Здесь мы представляем протокол анализировать состав протеина большой родной: протеин и белка: комплексов нуклеиновых кислот из рапса (B. napus) флоэма экссудата с использованием 3D геля полиакриламида электрофореза (страница) подхода, сочетающего синий родной (BN) с двумя денатурируя страниц следуют масс-спектрометрических идентификации.
Выборка флоэма высших растений часто является трудоемким и существенно зависит от видов растений. Однако протеом исследований при денатурации условий может быть достигнуто в различных видов растений. Родной: протеин и белка: комплексов нуклеиновая кислота от флоэмы образцов пока вряд ли были проанализированы, хотя они могли бы играть важную роль в обслуживании этого специализированные отделения или в дальней сигнализации. Большой молекулярной сборки могут быть изолированы с помощью синий родной гель-электрофорез (БН-страница). Их белковых компонентов могут быть разделены последующих натрия Додециловый сульфат страницы (SDS-PAGE). Однако протеины с подобными молекулярными весами проникли совместно мигрируют, что может помешать белка идентификации по масс-спектрометрии. Сочетая BN-страница с двумя различными денатурируя гель электрофорез шаги, а именно трис-Трицин мочевина и SDS-PAGE, включает дополнительные разделение белков согласно их гидрофильность/гидрофобность и таким образом повышает разрешение и успех идентификации белков. Она даже позволяет различать белки, которые отличаются только в их Посттрансляционная модификации. Кроме того синий родной Северный blotting может применяться для идентификации компонентов РНК в макромолекулярных комплексов. Мы покажем, что наш протокол подходит разгадать белка и РНК компоненты родной: протеин и рибонуклеопротеида (RNP) комплексов, происходящих в образцах флоэмы. Объединяя синий родной страница с двумя различными денатурируя страницы шагов может помочь для разделения различных видов крупных белковых комплексов, а также позволяет показатель увеличения идентификации их компонентов по масс-спектрометрии. Кроме того протокол является достаточно прочным, чтобы одновременно обнаруживать потенциально связанных нуклеиновых кислот в пределах одного белковых комплексов.
Междугородные каналы флоэмы необходимы для выделения органических питательных веществ в высших растений, но также участвует в регуляции многих различных процессов, важных для роста и развития, Возбудитель обороне и адаптация к неблагоприятным условия окружающей среды. Помимо небольшой эффекторов как ионы, фитогормонов или метаболитов, сами макромолекулы как белков и РНК недавно появились как потенциальные сигналы.
Исследования показали, что Загрузка флоэмы белков является размер зависимых и контролируется поры plasmodesmal единиц соединения клеток спутник (CC) исключение ограничение на размер (SEL) и сита элементы (SE), которые, как правило, в диапазоне от 10 до > 67 кДа1 , 2 , 3. Однако, несмотря на эти ограничения размера больше белков и белковых комплексов были найдены в системе флоэмы, сложной идею исключения размер4, и даже неспецифических потеря белков от CC для SE был предлагается5 .
Multiprotein, а также большой рибонуклеопротеида комплексы играть решающую роль в биосинтезе и сохранения структурной целостности ячейки6. Есть свидетельства, что флоэма мобильный рибонуклеопротеида и белок белковых комплексов существует4,7, но на сегодняшний день известно мало о их функции. В элементы флоэмы сито: протеин и RNP комплексы были вовлечены с дальних перевозок и / или сигнализации8,9. Чтобы разгадать функции translocated комплексов, изучая их состава в различных экологических или подчеркнуть условия не требуется. Для достижения этой цели, родной комплексы должны быть изолированы и их компоненты должны быть разделены с достаточным разрешением.
Чтобы изолировать комплексы высоким молекулярным весом от флоэмы, это сначала необходимо получить образцы sap в достаточного качества и количества. Метод, который может использоваться для выборки флоэмы, зависит от видов растений интерес. Существуют три основные методы для получения флоэма sap 10: насекомых stylectomy11, ЭДТА способствовали экссудацию12и спонтанное экссудацию13.
Флоэма образцы от Arabidopsis thaliana (A. thaliana), основные модели завода в лабораториях во всем мире, только может быть получено при содействии ЭДТА экссудацию или тля stylectomy14,15. Оба метода приведет к сильно разбавленных флоэма sap или очень низкой выборки сумм. Экссудацию, ЭДТА способствует также подвержен загрязнению и не может представлять реальный флоэма состав16. Спонтанное флоэма экссудацию ограничивается растительных видов, как тыква, Люпин или юкки, где отрезать части растений приводит к спонтанного флоэма sap, которые могут быть легко собраны в13,,1718, 19. Мы недавно создали рапса (Brassica napus) как система подходящую модель для анализа флоэмы, так как это близкий родственник A. thaliana и несколько микролитров флоэма sap может быть получена от небольших разрезов, которые было показано быть высокой чистоты4,8,20. Кроме того последовательность генома B. napus был выпущен в 201421.
За исключением stylectomy тля все методы коллекции флоэмы, описанные включают повреждения окружающих тканей в месте отбора проб, и состав флоэма sap может измениться в ответ на травмы. Поэтому крайне важно для проверки качества образцов флоэмы, независимо от того, применяется метод выборки. Существуют различные методы для контроля качества собранных флоэма SAP, например путем определения RNase деятельность22,23, RT-PCR с праймерами против Рибулозобисфосфаткарбоксилаза8,24, или анализ сахара Композиция8.
Могут применяться различные методы, чтобы изолировать и отдельные белковых комплексов, включая размер гель-проникающей хроматографии, ultracentrifugation плотность сахарозы или пример фильтрации через мембраны с собственный молекулярный вес cut компромиссов. Однако эти подходы не позволяют высокого разрешения. Техника называется синий родной (страница BN-), впервые описана в Schägger и др. 25, Улучшенный с точки зрения резолюции. Он был успешно используется для определения молекулярным весом большого родной белковых комплексов из различных органеллы или сотовой лизатов и их относительного обилия26,27.
Для дальнейшего уточнения сложного состава белковых комплексов, необходимо отделить отдельные компоненты под денатурации условий, ведущих к полной разборки компонентов комплекса. Это может быть достигнуто путем второе измерение SDS-PAGE 28,29 , или для достижения более высокое разрешение, второй аспект изоэлектрического фокусирования (МЭФ) следуют third dimension SDS-PAGE30 и последующей идентификации с помощью масс-спектрометрии белков.
В этом протоколе мы описываем выборки чистого флоэма sap от B. napus растений и анализа белковых комплексов от таких образцов флоэмы, с помощью 3D электрофоретической подхода, сочетающего BN-страница с трис-Трицин мочевина страницы и SDS-PAGE. Раздельный белковых компонентов комплекса впоследствии идентифицируются с помощью масс-спектрометрии. Кроме того мы представляем, синий родной Северный blotting метод, позволяющий обнаружение РНК в больших RNP комплексы4, расширяя применимость подхода.
Флоэмы — отсек высокий интерес, поскольку она представляет собой крупный транспортный маршрут для photoassimilates и также важно для дальней передачи сигналов между различными завод частей9,20,34, 35. Помимо мелких молекул были причастны макромолекулы как белков и РНК с флоэма обслуживания и сигнализации4,7,8. Анализ состава флоэмы, ограниченная доступность ограничивается флоэма образцов в большинстве видов растений. Насекомое стилет техника широко применяется, но экспериментально требовательных и приводит в очень небольших количествах флоэма образцы11. Один простой метод, используемый для выборки флоэма-ЭДТА способствовали экссудацию12. ЭДТА chelates ионов двухвалентной как кальция и таким образом предотвращает закрытие сито пластины P-белков и callose. Она проста в использовании, но подвержена загрязнению поврежденных клеток и разбавленной пробы. Истощает EDTA-ионов двухвалентной также может привести к нарушению существующих комплексов. Однако она позволяет выборки из широкого спектра видов, включая модель завод A. thaliana15. Спонтанное экссудацию флоэма sap происходит только в небольшое количество видов растений. Это инвазивный метод, который предполагает значительные повреждения тканей растений10. Мы недавно создали B. napus как вид модели для изучения переноса на большие расстояния4,8,20. Здесь флоэма sap можно отведать от небольших разрезов, которая уменьшает ранив эффекты и источников загрязнения.
Использование методов выборки, протеома флоэма образцы из различных видов растений была исследована в последние годы7,8,17,,3637, 38,39. Для этих исследований протеом, белки извлекали и химически осажденный под денатурации условия и поэтому не позволяют выводы о: протеин и белка: взаимодействие нуклеиновых кислот представляют родной условиях. Co Иммунопреципитация (CoIP) и наложение анализов указывается, что основных рибонуклеопротеида комплекс может существовать в флоэмы sap из тыквы40, но не было доказано, что любой макромолекулярных комплексов существуют в родной условиях в течение Флоэма системы.
Синий страницу машинный код, представленный Schägger et al. 26, в сочетании с последующим разрешением гель электрофорез шаги позволяют осуществить разделение отдельных компонентов крупных белковых комплексов. С помощью 3D-страница анализ родной B. napus флоэма экссудата, мы недавно можно было продемонстрировать, что несколько высокий молекулярный вес: протеин и RNP комплексы существуют в образцах флоэма и ферментативно активной4. Альтернативные методы для изоляции белковых комплексов, а также RNPs как гель-проникающей хроматографии размер может существовать, но не с точки зрения резолюции по сравнению с БН-страницы. Кроме того для приемлемого качества сложных разделения, размер исключение столбцов матрицы должны быть адаптированы согласно общей сложных молекулярных масс проводится расследование. Анализ комплексов разного размера, поэтому, требуют различные типы столбцов, которые является дорогостоящими и не позволяют как мощные фокусировки как BN-страница.
Важнейшие шаги для анализа комплексов от B. napus включают в себя общее количество флоэма sap, используется в качестве исходного материала. По крайней мере 600 мкл пример флоэма являются необходимыми и могут быть получены из пяти хорошо поливать растения. Для 3D-страницы и BN Северный blotting необходимо начать первоначального млрд лари с достаточное количество образцов флоэмы. Для достижения этой цели, образцы флоэма сосредоточены до 20-30 мкг белка могут быть загружены в каждый хорошо и по крайней мере, triplicates же выборки выполняются параллельно. Слишком низкая или слишком высокая концентрация уменьшить обнаружения комплексов (рис. 3). Флоэма образцы должны быть собраны в реакции трубы на льду и следует хранить замороженные для последующего использования избежать деградации белка и оборот. Ингибиторы протеазы были найдены в всех флоэма протеомов анализируется, но также полностью активные протеасом был описан в флоэмы B. napus4. Кроме того объем и состав флоэма образцов зависит от времени точку выборки и условий окружающей среды10. Поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы собирать в то же время дня в аналогичных условиях. Лечение стресса (например , засуха) может уменьшить количество флоэмы, которые могут быть собраны. Чтобы определить единый белки по масс-спектрометрии, обязательно ограничить возможные кератин загрязнений, перчатках все время. Кератин приводит к дополнительные сигналы во время массовых спектр анализа и препятствует идентификации белков. Запуск BN-страницы на высоком напряжении или при температуре окружающего воздуха может привести к Отопление геля, что может привести к разборке хрупких комплексов.
Протокол, представленные здесь подходит для анализа комплексов: протеин. Мы также показывают, что он может использоваться для обнаружения конкретных РНК, содержащихся в комплексах параллельно. Для достижения этой цели, мы недавно представил протокол для Северный blotting4млрд. РНК подвержены деградации РНКазы загрязнений. Чтобы ограничить такой деградации DEPC-лечение, воды должны использоваться.
Основные ограничения метода представленных включают оценки молекулярной массы белковых комплексов разделенных BN-страницы, так как поведение миграции зависит от размера, формы и даже Посттрансляционная модификации комплексы31, 41. Оценка размера RNP комплексов является еще более сложной из-за влияния на поведение миграции нуклеиновых кислот. Она может также не быть предотвращено что комплексов такого же размера совместно мигрировать в одной одной полосе. Это может привести к ошибочной прогнозирование сложных композиций. Поэтому проверка наблюдаемых взаимодействия с дополнительных методов, например , функциональные анализы4, может оказаться необходимым. Также только слабо или временно связанные с комплексом высокомолекулярных белков может быть потеряно в буфер млрд. Чтобы избежать этого, образцы могут быть высокоструктурированные, что также может привести к артефактам, или может предотвратить идентификации белков, или буфер условия могут быть оптимизированы.
В отличие от классического 2D-страницы, сочетание мочевины – и SDS-PAGE позволяет разделение согласно гидрофобность и молекулярный вес вместо Изоэлектрическая точка (pI) и молекулярный вес 28и не ограничивает разделение белков ряд конкретных Пи. Похож на классический 2D-страница, разделенных белки видны как одного пятна, но по диагонали линия 4,28 (рис. 5, рис. 6). Более гидрофобные белки появляются в точках выше диагонали, тогда как более гидрофильные белки находятся ниже линии28. Концентрацию полиакриламида, используемые в настоящем протоколе будет отделить протеины между 25 до 80 кДа хорошо. Разрешить разделение меньше или больше белков полиакриламида концентрация может быть изменено или градиент гели могут использоваться в третьем измерении. Компонентов сложных IV (рис. 3), разделенных 3D-страница (рис. 6) были вырезать, трипсина переваривается и проанализированы по масс-спектрометрии. Это привело к идентификации нескольких тРНК ligases. Компоненты другие комплексы были недавно опубликованы 4. Наши 3D-страницы включено разделение различных ligases, а именно аспартат, аспарагин, треонина, лизина и глицин и ligases, с подобными молекулярными весами проникли (Таблица 3). С помощью зонда tRNA специфичные метионина, мы смогли обнаружить потенциально связанных tRNA в сложном IV, но если полнометражного tRNA или фрагменты tRNA в комплексе не могут подвергаться с зондами используется. Чтобы проверить, если действительно связанные внутри комплекса, так и не совместно перенос нуклеиновые кислоты, протеазы переваривается флоэма sap образцы может служить подходящим миграционного контроля.
Ранее предположил, что белка перевод может произойти внутри трубки флоэмы сито, поскольку почти большинство компонентов всей рибосомы, а также удлинение факторы были найдены в флоэмы образцы4,7. Наш вывод тРНК и ligases тРНК, как представляется, поддерживают эту идею. Однако tRNA фрагменты присутствует в флоэмы образцы из тыквы, было показано, быть сильными ингибиторами перевод42 и функциональных рибосомы, как представляется, отсутствует4, предполагая, что перевод не может иметь место.
Взятые вместе, протокол, представленные здесь позволяет разделение родной: протеин и даже RNP комплексов от флоэмы образцов и разделения и идентификации их отдельных компонентов с высоким разрешением. Применение этого метода позволяет открытие новых белков и RNP комплексов в образцах флоэма и поэтому может выяснить новые функции в этом отсеке узкоспециализированные завод.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Дженнифер Дик и Urszula Zarzenska за их научной поддержки. Эта работа была финансовой поддержке карьеры интеграции Грант (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) Европейской Комиссией в рамках 7-й Рамочной программы, Грант LFF-GK06 «DELIGRAH» (Landesforschungsförderung Гамбург) и DFG Грант (DFG KE 856_6-1) присуждена JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |