Här presenterar vi ett protokoll för att analysera stora infödda protein: protein och protein protein sammansättning: nukleinsyra komplex från raps (B. napus) phloem exsudat använder en 3D Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan) strategi som kombinerar blå Native (BN) med två denatureringen sidor följt av massa spektrometriska identifiering.
Provtagning phloemen av högre växter är ofta arbetskrävande och kraftigt beroende av växtarterna. Dock kunde proteomet studier under denatureringen villkor uppnås i olika växtarter. Infödda protein: protein och protein: nukleinsyra komplex från phloem prover har ännu knappt analyserats, även om de kan spela en viktig roll i upprätthållandet av specialiserade kupén eller långdistans signalering. Stora molekylära sammanställningar kan isoleras med en blå infödda gelelektrofores (BN-sidan). Deras proteinkomponenter kan avgränsas med en efterföljande sodium dodecyl sulfate (SDS-sidan). Dock migrerar proteiner med liknande molekylvikter samarbete, vad kan hindra protein identifiering av masspektrometri. Att kombinera BN-sida med två olika denatureringen gelelektrofores steg, nämligen Tris-Tricine-urea och SDS-PAGE, möjliggör ytterligare separation av proteiner enligt deras hydrophilicitet/vattenavvisande egenskaper och ökar därmed resolution och framgång av protein identifiering. Det kan skilja proteiner som bara skiljer sig åt i deras posttranslationell ändringar. Dessutom kan blå infödda northern blotting användas för att identifiera RNA komponenter i makromolekylärt komplex. Vi visar att vår protokoll är lämplig att nysta upp protein och RNA komponenter av infödda protein: protein och ribonukleoprotein (RNP) komplex som förekommer i floem prover. Kombinera en blå infödda sida med två olika denatureringen sida steg kan hjälpa till att separera olika typer av stora proteinkomplex, och också möjliggör en ökad identifiering andelen deras komponenter genom masspektrometri. Protokollet är dessutom tillräckligt robust för att samtidigt upptäcka potentiellt bundna nukleinsyror inom enda proteinkomplex.
De långväga conduits i floem är nödvändiga för fördelningen av organiska näringsämnen i högre växter, men är också involverade i regleringen av många olika processer som är viktiga för tillväxt och utveckling, patogen försvar och anpassning till negativa miljöförhållanden. Förutom små effektorer som joner, fytohormoner eller metaboliter själva, makromolekyler som proteiner och RNAs har nyligen dykt upp som potentiella signaler.
Studier har visat att phloem lastning av proteiner är storlek beroende och kontrollerad av utslagning storleksgränsen (SEL) av por-plasmodesmal enheter ansluta följeslagare celler (CC) och sikten element (SE) som är normalt i intervallet 10 till > 67 kDa1 , 2 , 3. men trots dessa storlek begränsningar större proteiner och protein komplex har hittats inom phloem systemet utmanande tanken på storlek utslagning4och även ospecifik förlust av proteiner från CC till SE har varit föreslagna5 .
Multiprotein samt stor ribonukleoprotein komplex spela avgörande roller i biosyntes och underhålla den strukturella integriteten av cell6. Det finns bevis att phloem-mobile protein-protein och ribonukleoprotein komplex finns4,7, men hittills lite om deras funktion är känd. I floem sieve element har protein: protein och RNP komplex varit inblandade med långväga transporter och / eller signalering8,9. För att riva upp funktioner flyttade komplexen, studera deras sammansättning under varierande miljö eller stress villkor krävs. För att uppnå detta, infödda komplex måste isoleras och deras komponenter måste separeras med tillräcklig upplösning.
För att isolera hög molekylvikt komplex från floem, är det först nödvändigt att erhålla sap prover i tillräcklig kvalitet och kvantitet. Den teknik som kan användas för phloem provtagning är beroende av växtarterna av intresse. Finns tre huvudsakliga metoder att få phloem sap 10: insekt stylectomy11, EDTA-stödda exsudation12och spontana exsudation13.
Phloem prover från Arabidopsis thaliana (A. thaliana), den större modellen växten i laboratorier över hela världen, kan endast erhållas genom EDTA-stödda exsudation eller bladlöss stylectomy14,15. Båda metoderna leda till antingen mycket utspädda phloem sap eller mycket låg prov belopp. EDTA-stödda exsudation är också benägna att kontaminering och kan inte representera de verkliga phloem sammansättning16. Spontan phloem exsudation är begränsad till växtarter som gurkväxter, Lupin eller yucca, där skära av växtdelar leder till en spontan utsläpp av phloem sap som kan vara enkelt insamlade13,17,18, 19. Vi har nyligen etablerat raps (Brassica napus) som lämplig modellsystem för phloem analys, eftersom det är en nära släkting till A. thaliana och flera mikroliter av phloem sap kan erhållas från små snitt som har visat sig vara av hög renhet4,8,20. Dessutom släpptes den B. napus genomsekvens 201421.
Förutom bladlöss stylectomy, alla metoder för insamling av phloem beskrivs inkluderar skada på omgivande vävnad på platsen för provtagning och floem sap sammansättning ändras som svar på skadan. Därför är det viktigt att kontrollera kvaliteten på phloem proverna, oavsett den provtagningsmetod som tillämpas. Det finns olika metoder för kvalitetskontroll av insamlade phloem sap, t.ex. genom bestämning av RNase aktivitet22,23, RT-PCR med grundfärg mot Rubisco8,24eller analys av sockret sammansättning8.
Olika metoder att isolera och separera proteinkomplex kan tillämpas, inklusive storlek utslagning kromatografi, sackaros densitet ultracentrifugering eller prov filtrering genom membran med distinkta molekylvikt cut offs. Dessa tillvägagångssätt tillåter dock inte hög upplösning. Den teknik som kallas blå infödda (sidan BN-), först beskrevs av Schägger et al. 25, är överlägsen när det gäller upplösning. Det har framgångsrikt använts för att bestämma molekylvikt av stora infödda proteinkomplex från olika organeller eller cellulär lysates och deras relativa förekomsten26,27.
För att ytterligare belysa den komplexa sammansättningen av proteinkomplex, är det nödvändigt att separera de enskilda komponenterna under denatureringen förhållanden, som leder till fullständig demontering av komplexa komponenter. Detta kan uppnås genom en andra dimension av SDS-PAGE 28,29 eller, för att uppnå högre upplösning, av en andra dimension av isoelektrisk fokusering (IEF) följt av en third dimension av SDS-PAGE30 och efterföljande identifiering av proteiner med hjälp av masspektrometri.
I detta protokoll beskriver vi provtagning av ren phloem sap från B. napus växter och analys av proteinkomplex från sådana phloem prover med en 3D elektroforetiska metod som kombinerar BN-sida med Tris-Tricine-urea-PAGE och SDS-PAGE. Separerade proteinet komplexa komponenter identifieras därefter med masspektrometri. Dessutom introducerar vi blå infödda northern blotting som en metod som möjliggör upptäckt av RNAs i stora RNP komplex4, utvidga tillämpligheten av metoden.
Floem är ett fack av stort intresse, eftersom den utgör den viktigaste transportled för photoassimilates och är också viktigt för långdistans signalering mellan olika växt delar9,20,34, 35. Förutom små molekyler, har makromolekyler som proteiner och RNAs varit inblandade med phloem underhåll och signalering4,7,8. Analysen av phloem sammansättning begränsas av begränsad tillgänglighet till phloem prover i de flesta växtarter. Insekt mandrängen tekniken är allmänt tillämplig, men experimentellt krävande och resulterar i mycket små mängder av phloem prover11. En enkel teknik som används för phloem provtagning är EDTA-stödda exsudation12. EDTA kelater tvåvärda joner som kalcium och därmed hindrar stängning av sikten plattor av P-proteiner och callose. Det är lätt att använda, men är benägna att kontaminering av skadade celler och prover är utspädda. Nedbrytande tvåvärda joner av EDTA kan också leda till en uppdelning av befintliga komplex. Det tillåter dock provtagning från en rad olika arter, inklusive modell växten A. thaliana15. Spontan utsöndring av phloem sap förekommer endast i ett litet antal växtarter. Det är en invasiv metod som innebär betydande skada växt vävnader10. Vi har nyligen etablerat B. napus som modell art för att studera långväga transporter4,8,20. Här, kan phloem sap avsmakas från små snitt, vilket minskar skadade effekter och källor till förorening.
Använder olika urvalsmetoder, proteomet phloem prover från olika växtarter har undersökts i senaste åren7,8,17,36,37, 38,39. För dessa studier i proteomet var proteiner extraheras och fälls ut under denatureringen villkor och därför tillåter inte slutsatser om protein: protein och protein: nukleinsyra interaktioner presentera infödda villkor. Co-immunoprecipitation (CoIP) och overlay analyser visade att en större ribonukleoprotein komplex kan finnas i floem sap från pumpa40, men det visades inte att någon makromolekylärt komplex finns infödda villkor inom den Phloem system.
Blue-native sida, introducerades av Schägger et al. 26, i kombination med efterföljande högupplösta gelelektrofores steg aktiverar separation av de enskilda komponenterna i stora proteinkomplex. Med hjälp av 3D-sidan analyser av infödda B. napus phloem exsudat, kunde vi nyligen visar att flera hög molekylvikt protein: protein och RNP komplex finns i floem prover och enzymatiskt aktiva4. Alternativa metoder att isolera proteinkomplex samt RNPs liknande storlek utslagning kromatografi kanske finns, men misslyckas när det gäller upplösning jämfört med BN-sida. Dessutom för en rimlig kvalitet på komplexa separation måste storlek utslagning kolumn matriser anpassas enligt de övergripande komplexa molekylvikter utreds. Analysera komplex av olika storlek kommer därför att kräva olika typer av kolonner som kostar intensiv och tillåter inte som hög fokuserande effekt som en BN-sida.
Kritiska steg att analysera komplex från B. napus inkluderar den totala mängden phloem sap används som utgångsmaterial. Minst 600 µL phloem prov är nödvändiga och kan erhållas från fem välbevattnat växter. För 3D-sidan och BN northern blotting är det nödvändigt att börja den inledande BN-gel med en tillräcklig mängd phloem prover. För att uppnå detta, är phloem prover koncentrerade tills 20 till 30 µg av protein kan läsas in i varje brunn och minst exemplar av samma prov löper parallellt. För låg eller för hög koncentrationer minska detektion av komplex (figur 3). Phloem prover behöver samlas in reaktionsrören på is och bör förvaras frysta för senare användning för att undvika proteinnedbrytning och omsättning. Proteashämmare har hittats i alla phloem proteom analyseras, men också en fullt aktiv proteasom beskrevs i phloemen av B. napus4. Dessutom beror volym och sammansättning av phloem prover på provtagning tidpunkt och miljöförhållanden10. Därför måste vara försiktig att samla på samma tid på dagen under liknande förhållanden. Stress behandlingar (t.ex. torka) kan minska mängden phloem som kan samlas. För att identifiera enstaka proteiner av masspektrometri, är det obligatoriskt att begränsa möjliga keratin föroreningar genom att bära handskar hela tiden. Keratin leder till ytterligare signaler under massa spec analys och hämmar protein identifiering. Kör BN-sidan på en högre spänning eller vid rumstemperatur kan leda till uppvärmning av gelen som kan resultera i demontering av bräckliga komplex.
Det protokoll som presenteras här är lämplig för analys av protein: protein komplex. Vi visar också att det kan användas för att identifiera specifika RNAs i komplexen parallellt. För att uppnå detta, infört vi nyligen ett protokoll för BN northern blotting4. RNAs är utsatta för nedbrytning av RNAse föroreningar. För att begränsa sådan nedbrytning DEPC-behandlad, vatten ska användas.
Huvudsakliga begränsningar av den presenterade metoden inkluderar uppskattning av molekylvikten för proteinkomplex åtskilda av BN-sida, eftersom migration beteende beror på storlek, form och även på posttranslationell modifieringar av komplex31, 41. Storlek uppskattning av RNP komplex är ännu mer komplicerat på grund av påverkan av nukleinsyror på migration beteende. Det kan också inte förhindras att komplex av samma storlek samarbete migrerar i ett enda band. Detta kan leda till felaktiga förutsägelse av komplexa kompositioner. Därför att kontrollera de observerade interaktionerna med kompletterande tekniker, kan t.ex. genom funktionella analyser4, vara nödvändigt. Proteiner som endast svagt eller övergående är associerad till ett makromolekylärt komplex kan också förloras i BN bufferten används. För att undvika detta, prover kan vara tvärbunden, vad kan också leda till artefakter eller kan förhindra protein identifiering, eller villkor som buffert kan optimeras.
I motsats till klassisk 2D-sida, kombinationen av urea – och SDS-PAGE gör separationen enligt vattenavvisande egenskaper och molekylvikt istället för isoelektrisk punkt (pI) och molekylär vikt 28, och begränsar inte separation mot proteiner av en specifika pI utbud. Liknar klassisk 2D-sida, separerade proteinerna är synliga som enstaka fläckar, men på en diagonal linje 4,28 (figur 5, figur 6). Mer hydrofoba proteiner visas i fläckar över denna diagonal, medan mer hydrofil proteiner finns nedan i linje28. De polyakrylamid koncentrationer används i detta protokoll kommer att separera proteiner mellan 25 till 80 kDa väl. För att tillåta en separation av mindre eller större proteiner i polyakrylamid koncentration kan varieras eller lutning geler kan användas i den tredje dimensionen. Komponenterna i komplex IV (figur 3) åtskilda av 3D-sidan (figur 6) klipptes ut, trypsin rötas och analyseras med masspektrometri. Detta resulterade i att identifiera flera tRNA ligases. Komponenterna i andra komplexen har nyligen publicerade 4. Vår 3D-sida aktiverat separation av olika ligases, nämligen aspartat, asparagin, treonin, lysin och glycin ligases, med liknande molekylvikter (tabell 3). Använder en metionin tRNA-specifika sond, vi kunde upptäcka potentiellt bundna tRNA inom komplex IV, men om fullängds tRNA eller tRNA fragment i anläggningen inte kan diskrimineras med de sonder som används. För att kontrollera om nukleinsyror är verkligen bundna inom komplexet och inte samtidig migrering, proteas rötas phloem sap kan prover fungera som lämplig migration kontroller.
Det har tidigare spekulerats om att protein översättning kan förekomma inom phloem sieve rör, eftersom nästan de flesta komponenter i den hela Ribosomen samt töjning faktorer har hittats i floem prover4,7. Vår slutsats av tRNA och tRNA ligases tycks stödja denna idé. Dock tRNA fragment finns i floem prover från pumpa har visat sig vara potenta hämmare av översättning42 och funktionella ribosomer verkar vara frånvarande4, vilket tyder på att översättning inte kan ske.
Det protokoll som presenteras här tillsammans, och tillåter separation av infödda protein: protein och även RNP komplex från phloem prover och separation och identifiering av deras enskilda komponenter med hög upplösning. Tillämpningen av denna metod möjliggör upptäckten av romanen protein och RNP komplex i floem prover och kan därför belysa nya funktioner i detta mycket specialiserad anläggning fack.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jennifer Deke och Urszula Zarzenska för deras vetenskapliga stöd. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av en karriär Integration Grant (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) av Europeiska kommissionen inom det 7: e ramprogrammet, bidraget LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburg) och DFG bidraget (DFG KE 856_6-1) delas ut till JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |