Summary
Vi beskriver användning av fullfältsoptisk koherensmikroskopi som en metod för högkvalitativ bedömning av hornhinnedonatorstroma. Detta protokoll kan användas för att identifiera funktioner som indikerar hälsa eller sjukdom och syftar till att förbättra screening och urval av donatorvävnader och därmed resultaten av keratoplastik.
Abstract
Kvaliteten på donatorhornhinnans stroma, som utgör cirka 90% av den totala hornhinnans tjocklek, kommer sannolikt att vara en av de viktigaste, om inte de viktigaste, begränsande faktorerna för framgång med djup främre lamellär och penetrerande keratoplastik. Dessa är kirurgiska ingrepp som innebär att man ersätter en del eller alla de sjuka hornhinneskikten, med donerad vävnad, transplantatet, taget från en nyligen avliden individ. Metoderna för att utvärdera stromal kvalitet hos hornhinnetransplantat i ögonbankar är dock begränsade och saknar kapacitet för högupplöst kvantitativ bedömning av sjukdomsindikatorer. Fullfältsoptisk koherensmikroskopi (FF-OCM), som möjliggör högupplöst 3D-avbildning av färska eller fasta ex vivo biologiska vävnadsprover, är en icke-invasiv teknik som är väl lämpad för bedömning av donatorhornhinna. Här beskrivs en metod för kvalitativ och kvantitativ analys av hornhinnestroma med hjälp av FF-OCM. Protokollet har framgångsrikt tillämpats på normala donatorhornhinnor och patologiska hornhinneknappar och kan användas för att identifiera friska och patologiska egenskaper på både makroskopisk och mikroskopisk nivå, vilket underlättar detektering av stromasjukdomar som kan äventyra resultatet av keratoplastik. Genom att förbättra graftkvalitetskontrollen har detta protokoll potential att resultera i bättre urval (och avstötning) av donatorvävnader och därmed minskad transplantatfel.
Introduction
Hornhinnesjukdomar är bland de främsta orsakerna till blindhet över hela världen1. Vissa sjukdomar kan endast behandlas kirurgiskt, ofta med ersättning av en del (dvs. lamellär keratoplastik) eller hela (dvs. penetrerande keratoplastik) sjukt hornhinna, genom donerad vävnad, transplantatet, taget från en nyligen avliden individ. För hornhinnesjukdomar som inte påverkar endotelet (t.ex. keratokonus, stromala ärr efter infektiös keratit, trauma och stromadystrofier) anses djup främre lamellär keratoplastik (DALK) för närvarande vara den kirurgiska tekniken som valts 2,3,4,5. Denna teknik möjliggör bevarande av mottagarens hornhinneendotel genom att endast ersätta det centrala hornhinneepitelet och stroma, vilket är förknippat med en lägre förekomst av transplantatavstötning, frånvaro av endotelavstötning, lägre endotelcellförlust och gynnsamt kostnadseffektivitetsförhållande 6,7,8,9,10,11 . DALK tillåter vidare hornhinnor med mindre än optimal endotelkvalitet att användas som transplantat, eftersom detta komprometterade lager inte kommer att transplanteras12. Omvänt är kvaliteten på donatorhornhinnans stroma sannolikt den viktigaste begränsande faktorn för transplantatframgång och synåterhämtning eftersom stroma är det enda donatorhornhinneskiktet som finns kvar, medan givarepitelet kommer att ersättas av mottagarepitel. Tyvärr är medel för att bedöma donatorhornhinnestroma i ögonbanker begränsade. De inkluderar vanligtvis spaltlampundersökning av donatorögongloben när vävnadshämtning görs genom enukleation och ljusmikroskopundersökning av donatorstroma13. Vissa ögonbanker har börjat komplettera sådana standardförfaranden med hjälp av Fourier-domän optisk koherenstomografi (FD-OCT)14.
Oftalmisk optisk koherenstomografi (OCT), en optisk analog till ultraljudsavbildning15, använder störningar av bredband eller avstämbart ljus för att generera optiska sektioner av näthinnan 16 och främre segment17. I tidsdomän OCT, grunden för tidiga kliniska system, ändras positionen för en referensspegel, så att interferensmönster dyker upp när referensstrålen har rest nästan lika lång tid som strålen reflekteras vid de olika vävnadsgränssnitten, med A-skanningar som genereras som en funktion av tiden. I FD-OCT (även kallad spektral- eller frekvensdomän OCT), grunden för de flesta moderna kliniska system, fixeras referensspegeln vid en position och en individuell A-scan, med alla interferensmönster blandade, förvärvas åt gången och dissekeras isär via Fourieranalys.
Medan kliniska OCT-system (tid eller spektraldomän) tillåter tvärsnittsvyer av hornhinnan och detektion av stromala opaciteter vid en högre axiell upplösning än spaltlampbiomikroskopi, är deras laterala upplösning begränsad. Konfokalmikroskopi18 möjliggör undersökning av hornhinnan med en lateral upplösning som närmar sig histologisk detalj, men är begränsad axiellt.
Fullfälts optisk koherens tomografimikroskopi (FF-OCT eller FF-OCM)19,20 kombinerar element av både konfokalmikroskopi och OCT, vilket ger en lateral upplösning jämförbar med den axiella upplösningen på cirka 1 μm. Mer specifikt använder FF-OCM osammanhängande bredbandsljuskällor (t.ex. en halogenlampa) och hög numerisk bländaroptik för att förvärva 2D-tomografiska bilder utan sidoskanning. Genom att skanna i djupriktningen möjliggör FF-OCM icke-invasiv 3D-avbildning av färska eller fasta ex vivo biologiska vävnadsprover. Det har använts för att avbilda hornhinnan21,22,23. Genom att tillhandahålla både högupplösta ansikts- och tvärsnittsvyer ger FF-OCM information om både hornhinnans histologiska struktur och cellulära detaljer. Faktum är att FF-OCM har visat sig ge strukturell information överlägsen histologi och kunde identifiera fler sjukdomsindikatorer som var möjliga med kombinationen av spektraldomän OCT och konfokalmikroskopi24,25.
Här beskrivs ett protokoll för kvalitativ och kvantitativ bedömning av hornhinnedonatorstroma med hjälp av FF-OCM. Metoden är baserad på histologiliknande analys av makroskopiska och mikroskopiska egenskaper som indikerar stromalt tillstånd, inklusive tre kvantitativa stromaparametrar (dvs. Bowmans skikttjocklek och dess variabilitet och stromal reflektivitet). Det beskrivna protokollet tillämpas därför på normal och onormal hornhinnevävnad och tillåter differentiering av sjuka från normala mänskliga hornhinnevävnader.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här utfördes enligt principerna i Helsingforsdeklarationen och följde internationella etiska krav för mänskliga vävnader. Detta var en prospektiv observationsfallkontrollstudie. Informerat samtycke erhölls från patienter. Inga ändringar av franska standarder för behandling eller uppföljning gjordes. Godkännande från Institutional Review Board (IRB) erhölls från patientskyddskommittén, Ile-de-France V (14944).
1. Vävnadsval och beredning
- Välj donatorhornhinnor.
- Överför donatorhornhinnor lagrade i organodlingsmedium26 till dextrankompletterat organodlingsmedium i 3 dagar för att möjliggöra deturgescens27 före FF-OCM avbildning28 (se materialtabell).
- Förbered proverna.
- Placera hornhinnan, nedsänkt i lagringsmedium, i provhållaren med epitelet uppåt.
- Placera ett rent kiseldioxidtäckglas (medföljt av provhållaren) ovanpå hornhinnan och stäng hållaren genom att försiktigt vrida basen tills provet är något tillplattat och immobiliserat under täckglaset, vilket ger en relativt jämn bildyta. Vidta försiktighetsåtgärder för att undvika luftbubblor.
- Applicera ett tjockt lager oftalmisk eller optisk gel på täckglaset som nedsänkningsmedium.
2. FF-OCM-initiering, installation och bildförvärv
- Initiera enheten.
- Slå på enheten genom att använda strömbrytaren på baksidan av enheten; belysning av en grön lysdiod på enhetens framsida indikerar att strömmen är på.
- Slå på den dedikerade datorn och halogenljuskällan genom att använda strömbrytaren på framsidan.
- Starta förvärvsprogrammet (se Materialförteckning) genom att dubbelklicka på genvägen på skrivbordet.
- Se till att bildsteget är fritt förutom det rörliga facket. Klicka sedan på "OK" för att initiera motorerna vid prompten.
- Dra ut brickan och sätt in provhållaren i den särskilda behållaren och tryck sedan försiktigt tillbaka brickan.
- Ställ in enheten.
- Ange en "providentifierare" i det angivna och obligatoriska fältet; Du kan också ange en "Provbeskrivning" och/eller "Studiebeskrivning".
- Klicka på "Hämta makrobild" när du är klar för att skapa en ögonblicksbild av provet som kan användas för lateral positionering och navigering senare; När du är nöjd, validera bilden vid prompten genom att klicka på "Ja", varefter enheten flyttar provfacket under målet och utför en automatisk justering.
- Se till att mikroskopmålet är väl nedsänkt i den optiska gelén innan du fortsätter vidare.
- Skaffa staplarna.
- Välj fliken "Utforska" för att förbereda ett förvärv.
- Innan du hämtar en stapel bilder, navigera till mitten av hornhinnan, via översättning av joysticken eller manuellt val på skärmen (det vill säga genom att klicka och dra den röda fyrkanten på den förvärvade makrobilden till önskad plats).
- Variera bilddjupet via rotation av joysticken, justering av skjutreglaget eller manuell tangentbordsinmatning i det grafiska användargränssnittet (GUI) och justera medelvärdesvärdet (ett genomsnitt på 40 rekommenderas vanligtvis för optimal hornhinneavbildning).
OBS: Detta görs för att bestämma tjockleken på hornhinneprovet och medelvärdet som krävs för att avbilda genom hela hornhinnans tjocklek samtidigt som man noterar den första och sista bildplatsen på djupet. Täckglasets nedre yta skapar parallella interferensfransar som ses på den tomografiska bilden (på höger sida av GUI), vilket underlättar lokaliseringen av hornhinnans yta. - Ange hornhinnans ytvärde eller första bildplats på djupet i fältet "Djup".
- Välj fliken "Förvärva" för att hämta bilder.
- Välj "Slice spacing" (standard och rekommenderad inställning är 1 μm, som matchar enhetens axiella upplösning) och ange hornhinnans tjockleksvärde i enlighet därmed under "Antal skivor".
- Granska parametrar och förvärvstid, och när du är nöjd trycker du på "OK" för att starta förvärvet.
- Undvik kontakt med bordet som FF-OCM är placerat på under förvärvet.
- Välj fliken "Utforska" för att förbereda ett förvärv.
3. Hantering av förvärvade bilder
- Visa och exportera bilder.
- Starta FF-OCM-visningsprogramvaran (se Materialförteckning) genom att dubbelklicka på skrivbordsgenvägen; förvärvade bilder (identifieras av exempel-ID) visas i listan "Lokala studier".
- Välj studien med motsvarande prov-ID, som innehåller både makrobilden och den förvärvade bildstacken, och "exportera" den senare genom att högerklicka på bildserien och välja formatet "DICOM" för att behålla råa pixeldata och metadata för vidare analys.
- Visa 3D-bildstaplarna i ansikts - och tvärsnittsvyer med MPR-läget (Multiplanar Reconstruction Demo) genom att dubbelklicka på bildserien. Navigera genom bilderna (t.ex. via mushjulsrullning eller skjutreglagejustering) och välj representativa vyer på framsidan och tvärsnitt för varje stapel.
- Exportera de valda vyerna genom att klicka på ikonen längst ned till höger i fönstret med formatet "DICOM".
- Importera bilder.
- Öppna bildbehandlingsprogrammet (se Materialförteckning) genom att dubbelklicka på skrivbordsgenvägen och navigera till "Bio-Formats" "Importer" under "Plugins" för att importera DICOM-bilder; se till att "Gruppfiler med liknande namn" är markerat i fönstret "Importalternativ för bioformat".
4. Bildanalys: Kvalitativt och kvantitativt bedömning av stromamorfologi och egenskaper
- Bedöm stromal och Bowmans skikttjocklek.
- Mät avstånd manuellt på hornhinnans tvärsnitt, till exempel vid fem jämnt fördelade punkter över tvärsnittet25.
- Rita en linje mellan två punkter med känt avstånd (t.ex. från vänster till höger om hela bilden, det vill säga enligt standardsynfältet, 1 024 pixlar eller 780 μm), gå till "Analysera" och välj "Ställ in skala" och ange "Känt avstånd" och "Längdenhet" i lämpliga fält och klicka på "OK".
- Rita en linje mellan två punkter med okänt avstånd; Läs längden eller sträckan mätt direkt från statusfältet.
- Anteckna medelvärdet och variationskoefficienten (COV). Bowmans skikttjocklek mindre än 6,5 μm och en COV större än 18,6% har associerats med onormal hornhinnestroma25.
- Mät avstånd manuellt på hornhinnans tvärsnitt, till exempel vid fem jämnt fördelade punkter över tvärsnittet25.
- Bestäm keratocytdensiteten.
- Följande konvention för konfokalmikroskopi: summera stromala ansiktsbilder i grupper om 7 för att producera skivor med jämförbar tjocklek. För detta, gå till fliken "Bild" och välj "Skiva Z" under "Stackar".
- Ta hänsyn till den olika (minskande) celldensiteten vid progression genom stroma24,25. För detta kan stroma anses bestå av 4 regioner beroende på djup: (1) det mycket främre stroma under Bowmans lager, det vill säga 2% av hela stromatjockleken; det återstående stroma (det vill säga 98% av hela stromatjockleken), med tre zoner med identisk tjocklek: (2) främre stroma, (3) mitten av stroma och (4) bakre stroma.
- För vidare analys, inkludera alla tillgängliga skivor med ansiktet för det mycket främre stroma, 15 bilder för det främre stroma, 5 bilder för det mellersta stroma, samt 5 bilder för det bakre stroma (där antalet bilder per region som krävs för ett tillförlitligt antal bestämdes genom stegvis analys29).
- På varje ansiktsbild väljer du ett intresseområde på 300 μm x 300 μm. För att förbättra kärnvisualiseringen, invertera bilden med "Invertera" under fliken "Redigera" och justera kontrast och ljusstyrka. För det senare, gå till "Bild" och navigera till "Ljusstyrka / kontrast" under "Analysera".
- Räkna cellkärnor manuellt, till exempel med hjälp av funktionen "cellräknare"25. För detta, gå till "Plugins" och navigera till "Cell Counter" under "Analysera". Tryck på "initiera" och välj sedan en räknartyp. Börja sedan räkna cellkärnorna genom att klicka på mörka ovala funktioner i den inverterade bilden, med tanke på de som landar på en bildkant endast för två av de fyra sidorna av bilden25.
- Registrera celldensiteten i termer av areadensitet, det vill säga i celler/mm² (dividera antalet celler räknade med 0,09, för att konvertera från celler/90 000 μm² till celler/mm²), enligt konfokalmikroskopikonventionen där keratocyttätheten har visat sig vara lägre hos patienter (t.ex. med keratokonus) än hos friska försökspersoner och korreleras med sjukdomens svårighetsgrad25.
OBS: Ytterligare kliniska studier är nödvändiga för att avgöra om en minimal tröskel för keratocytdensitet krävs för att erhålla ett helt klart hornhinnetransplantat efter transplantation.
- Bedöm stromal reflektivitet.
- Generera djupprofiler för medelintensitet för stromabildstaplar, till exempel med hjälp av funktionen "Z-axelprofil" och/eller anpassad programvara25,30,31.
OBS: Dessa är i själva verket amplituddjupprofiler eftersom FF-OCM mäter amplituden hos ljus som sprids tillbaka av provet snarare än dess intensitet.- Beräkna den genomsnittliga grånivån för varje ytstapel .
- Subtrahera det lägsta gråvärdet och normalisera med det maximala gråvärdet.
- Visas i loggskala som en funktion av stromadjupet (% av stromatjockleken).
- Approximera den resulterande logaritmiska profilen med en linjär regressionslinje, vilket minimerar summan av de kvadrerade resterna (minstakvadratpassning).
- Registrera R-kvadratvärdet (R²) som ett mått på linjäritet. Värden under 0,94 kan vara en indikation på hornhinnans patologi25.
OBS: För att skilja otillräckligheten hos en linjär logaritmisk regressionsmodell (eller en monoexponentiell sönderfallsmodell) på grund av närvaro av en patologi från enbart mätbrus, kan signalanalys med Bayesiansk inferens utföras31. Även i hornhinnor med linjära logaritmiska (eller monoexponentiella) stromadjupprofiler (t.ex. representerade av R-kvadratvärden30 eller Birge-förhållanden 31 nära 1) kan beräkningen av fotonens medelfria väg från signalförfallshastigheten användas för att ytterligare kvantifiera graden av transparens31.
- Generera djupprofiler för medelintensitet för stromabildstaplar, till exempel med hjälp av funktionen "Z-axelprofil" och/eller anpassad programvara25,30,31.
- Bedöm synligheten av andra stromala egenskaper och sjukdomsindikatorer.
- Kontrollera om det finns ärr, fibrotisk vävnad, sjöar eller Vogt striae.
- Bedöm medeltjockleken på nerverna i stroma, om den är tillräckligt synlig för mätning24.
- Välj en ansiktsbild där stromanerven är mest synlig (vanligtvis i mitten av stromaregionen).
- Mät nervens tjocklek, till exempel vid fem punkter24, beräkna sedan medelvärdet och standardavvikelsen. Nervtjocklekar över 9 μm kan vara en ytterligare indikator för patologi, såsom keratokonus24.
Representative Results
FF-OCM-enheten (se Materialförteckning)28 och den allmänna inställning som används i detta manuskript visas i figur 1. Figur 2 visar en svälld mänsklig donatorhornhinna efter lagring i organodlingsmedium, vilket ger en patofysiologisk modell av edematös hornhinna och förhindrar FF-OCM bildförvärv genom hela hornhinnans tjocklek på grund av begränsat penetrationsdjup. Överföring till dextran-kompletterat organodlingsmedium orsakar svullnad och resulterar i donatorhornhinnor med normal tjocklek, som visas i figur 3. Sjuka hornhinnor kan kännas igen av morfologiska förändringar och typiska stromaegenskaper, inklusive en minskad och varierande tjocklek på stroma (figur 4) och / eller Bowmans lager (figur 5). Bedömning av keratocytdensitet (figur 6) och stromal reflektivitet (figur 7) kan ytterligare underlätta histologiliknande analys och differentiering av normal från patologisk hornhinnevävnad med FF-OCM, utöver kapaciteten hos kliniska OCT-system (figur 8).
Figur 1: Schematisk och fotografier av den allmänna inställningen och FF-OCM-enheten som används i detta arbete. a) Fotografi av FF-OCM-anordningen (se materialförteckning)28. (B) Schematisk och optisk inställning av enheten. c) Fotografi av en mänsklig donatorhornhinna i provhållaren. (D) Zooma på fördjupningsmålet och provhållaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Organodlad normal mänsklig hornhinna före deturgescens. Tvärsnitt (A) och en face view (B, skiva genom stroma) av svälld ("edematös") hornhinna orsakad av lagring i organodlingsmedium, där sjöar kan ses som mörka områden (vilket indikeras av pilar). Kornealtjockleken har fördubblats till över 1 100 μm, vilket förhindrar bildinsamling genom hela djupet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Organodlad normal mänsklig hornhinna efter deturgens. Tvärsnittsvy genom hela hornhinnan (A) och en face stromal view (B) av avsvälld hornhinna nedsänkt i dextran-kompletterat medium, som visar regelbundet distribuerade hyperreflekterande (vita) keratocyter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Övergripande bedömning av stromamorfologi och egenskaper, inklusive stromatjocklek. Jämfört med normal mänsklig hornhinna (A) har hornhinnor med keratokonus (B) minskad och varierande stromatjocklek, tillsammans med många, parallella Vogt striae som kan observeras som mörka vertikala band i tvärsnittsvyer och tjocka stromanerver som kan hittas i mitten av stromal en face slices (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bedömning av Bowmans skikttjocklek, som avgränsas framåt av det hyperreflekterande epiteliala källarmembranet och bakre av de hyperreflekterande keratocyterna i det mycket främre stroma. Jämfört med en normal mänsklig hornhinna (A) har patologisk hornhinna (t.ex. keratokonus) (B) minskat och varierande Bowmans skikttjocklek på grund av avbrott och ärrbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bedömning av keratocytdensitet. (A) Keratocytkärnor räknas manuellt på förbättrade och inverterade ansiktsbilder efter val av ett 300 μm x 300 μm område av intresse. (B) Räknade kärnor indikeras med pilar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bedömning av stromal reflektivitet. Mängden bakåtspritt ljus minskar (exponentiellt) med djupet i stroma hos normala donatorhornhinnor (se figur 3 och figur 4A), vilket resulterar i linjära logaritmiska djupprofiler, representerade av R-kvadratvärden nära 1 (grönt spår). Detta kanske inte gäller för patologiska hornhinnor med stromaregioner med ökad ljusspridning (se figur 4B). Närvaron av sådana makroskopiska egenskaper, som i exemplet med en hornhinna med stromalt ärr efter infektiös keratit (avbildad i insatsen), kommer således att skapa icke-linjära logaritmiska intensitetsdjupprofiler, representerade av ett R-kvadratvärde under ett visst tröskelvärde (t.ex. lägre än 0,9425; rött spår). Observera att logaritmiska amplituddjupprofiler faktiskt visas när FF-OCM mäter amplituden för ljus som sprids tillbaka av provet snarare än dess intensitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Påvisande av fördelarna med FF-OCM jämfört med histologi och spektraldomän OCT. (A) Histologi och (B) motsvarande spektraldomän-OCT-bild som erhållits på samma hornhinna in vivo före keratoplastik. (C) Motsvarande FF-OCM-tvärsnitt av ex vivo-hornhinneknappen efter keratoplastik, vilket illustrerar överlägsen upplösning jämfört med OCT-bilderna i den kliniska spektraldomänen. Fibrosen är också tydligare synlig i FF-OCM-bilder än i histologin. Den höga densiteten av keratocyter i det övre stroma kan tydligt ses i både (C) tvärsnitt och (D) en face view. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Protokollet som beskrivs här för kvalitativ och kvantitativ bedömning av hornhinnedonatorstroma med FF-OCM är baserat på histologiliknande analys av makroskopiska och mikroskopiska egenskaper som indikerar stromalt tillstånd, bortom kapaciteten hos spektraldomän OCT och konfokalmikroskopi21,24,25, och möjliggör differentiering av sjuka från normala mänskliga vävnader.
Bortsett från en utmärkt endotelkvalitetsbedömning av mänskliga donatorhornhinnor med hjälp av spekulär mikroskopi, är bedömning av stromal kvalitet utmanande i ögonbanker och i allmänhet begränsad till en grov observation med spaltlampbiomikroskopi och / eller ljusmikroskopi i nuvarande protokoll. Brist på finupplösning med befintliga metoder innebär inte bara att hornhinnor med någon stromal sjukdom kan väljas som äventyrar resultatet av keratoplastik, utan också att hornhinnor kan stötas bort för stromala opaciteter som i själva verket är begränsade till främre stroma eller epitelregioner och fortfarande kan användas för endotelial keratoplastik14.
Det nuvarande ögonbankprotokollet kan kompletteras med tillägg av FF-OCM, som på grund av sin överlägsna upplösning utgör ett kraftfullt och icke-invasivt verktyg för att slutföra kvalitetsbedömningen av hornhinnan, särskilt stroma (inklusive Bowmans lager). Till skillnad från vid undersökning av spaltlampa förblir transplantatet nedsänkt i en sluten kammare fylld med lagringsmedium under hela FF-OCM-bildinsamlingen, vilket minskar risken för kontaminering.
För framgångsrik bildinsamling med FF-OCM (se materialförteckning) är det viktigt att mikroskopmålet är väl nedsänkt i den optiska gelen som appliceras ovanpå provhållarens täckglas (steg 2.2.3). Det rekommenderas vidare att regelbundet kontrollera kalibreringen av enheten, en procedur som också ska utföras efter misslyckad automatisk justering (steg 2.2.2) och nås via "Verktyg och alternativ" i förvärvsprogramvaran (se Materialförteckning). Proceduren, som innebär användning av en kalibreringsspegel i provhållaren, är densamma som den vanliga provberedningen (se steg 1.2) förutom att den optiska gelen bör appliceras på spegeln innan täckglaset placeras.
En serie donatorhornhinnetransplantat, som anses ha normalt stroma enligt befintliga ögonbankprocedurer, användes för att beskriva protokollet i detta manuskript och specifikt visa FF-OCM lämplighet för exakt och tillförlitlig bedömning av donatorstromal kvalitet. Dessa normala donatorhornhinnor jämfördes med patologiska hornhinnor nedsänkta i lagringsmedium, vilket visar att den histologiliknande analysen som möjliggjordes med FF-OCM av flera stromaegenskaper (illustrerad i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 och figur 8) i hornhinnetransplantat gör det möjligt att skilja sjuka från normala mänskliga hornhinnevävnader.
Bortsett från morfologiska förändringar, såsom förekomst av ärr (figur 5 och figur 7), fibrotisk vävnad (figur 8), sjöar (figur 2), Vogt striae (figur 4) eller ökad stromanervdiameter (figur 4), finns typiska stromaegenskaper i sjuka hornhinnor. Stromaparametrar som är särskilt relevanta i stromakvalitetsbedömningen verkar vara Bowmans skikttjocklek och dess variabilitet och stromal reflektivitet. Kritiska steg i protokollet är alltså steg 4.1 och 4.3.
Medan det utsöndras under mänsklig hornhinneutveckling, blir Bowmans lager, i synnerhet, distinkt av 19 veckors graviditet och reparerar aldrig efter födseln32. Skador på Bowmans lager är således irreversibla och fungerar som en idealisk indikator på tidigare stromaskador i donatorhornhinnans vävnad, inklusive skador orsakade av brytningskirurgi, infektiös keratit, keratokonus. Sådana hornhinnesjukdomar, som utgör kontraindikationer för användning av donatorhornhinnan, är förknippade med minskad och varierande Bowmans skikttjocklek på grund av avbrott och ärrbildning (figur 5) och kommer sannolikt att missas av nuvarande ögonbankprotokoll när donatorns historia inte är exakt känd.
Även om hornhinnans transparens försämras efter givardöd på grund av postmortem hornhinneödem, förväntas mängden bakåtspritt ljus eller stromal reflektivitet minska exponentiellt med djupet i stroma (se figur 3 och figur 4A); som ett resultat kommer logaritmen för normaliserad stromal reflektivitet att vara en linjär funktion av stromalt djup i normala donatorhornhinnor, representerade av R-kvadratvärden nära 1. Omvänt är förekomsten av makroskopiska egenskaper associerad med icke-linjära logaritmiska djupprofiler och indikerar stromal sjukdom (figur 4B och figur 7)25.
Eftersom keratocytdensiteten är ansvarig för stromal kollagenfibril och extracellulär matrissyntes och förnyelse, verkar det rimligt att anta att keratocytdensitet är en annan relevant parameter för att bedöma donatorstromal kvalitet och att vävnader som uppvisar mycket lågt keratocytantal inte bör transplanteras. Protokollet innehåller därför en exakt och tillförlitlig metod för att mäta keratocytdensitet från FF-OCM-bilder som enkelt kan användas i ögonbanker25 och följer konventionen för konfokalmikroskopi. Observera att med FF-OCM kan keratocytdensiteten också bestämmas genom att räkna keratocyter direkt i tvärsnittsvyn33, en potentiell fördel jämfört med konfokalmikroskopi, vilket kräver att keratocyter räknas på flera ansiktsskivor. Till skillnad från levande patienter, där keratocyttätheten har visat sig vara lägre hos sjukdomspatienter än hos normala kontroller 34,35,36,37 och korrelera med sjukdomens svårighetsgrad 34,38, var detta dock inte fallet i humana ex vivo-vävnadsprover 25 , och ytterligare studier är nödvändiga för att avgöra om ett minimalt antal keratocyter krävs i donatorhornhinnor för att resultera i god visuell återhämtning efter transplantation. Låg keratocyttäthet i donatorvävnad som i patologisk vävnad kan förklaras av åldrande, postmortemförlust av celler inducerad av ischemi och / eller lagring av donatorvävnad 27,39,40,41. Det bör också påpekas att de normala donatorhornhinnorna som erhölls och avbildades i detta protokoll antingen lagrades och var edematösa eller avsvällda, eller hade kasserats av ögonbanken före transplantation på grund av dålig endotelkvalitet enligt standarderna från EU Eye Bank Association. Om FF-OCM-avbildning tillsammans med det beskrivna protokollet skulle inkluderas i ögonbankinställningen, skulle hornhinnorna vanligtvis bedömas i ett fräschare tillstånd än vad som var möjligt här, vilket kan påverka keratocytdensiteterna.
Protokollet som beskrivs här för stromakvalitetsanalysen kan utvidgas för bedömning av Descemets membran, vilket också kan lösas med FF-OCM när det gäller tjocklek och struktur21,24. Detta kan vara användbart för val av vävnader för Descemets membranendotelial keratoplastik, där tunna Descemets membran kan vara svårare att separera från stroma.
Sammanfattningsvis möjliggör FF-OCM exakt och tillförlitlig bedömning av humant donatorhornhinnestroma under lagring. Genom att förbättra transplantatkvaliteten har tillägget av detta protokoll till nuvarande ögonbankförfaranden potential att förbättra screening och urval av donatorvävnader och därmed resultaten av keratoplastik. Verklig integration av FF-OCM-enheten i ögonbankrutinen bör underlättas av de senaste tekniska uppdateringarna, inklusive snabbare bildinsamling och större synfält tack vare utvecklingen av en anpassad CMOS-kamera och utformningen av anpassade sterila engångskassetter för lagring och hantering av hornhinnan under avbildning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har fått finansiering från Agence Nationale de Recherche (ANR), genom ett PRTS-bidrag (Projet de Recherche Translationelle en Santé) nr ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) och från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 709104 (K.I.). Författarna tackar Céline de Sousa för hjälp med cellräkning och histologisk bearbetning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P.
- Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
- Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
- Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
- Amayem, A. F., Anwar, M.
- Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
- Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
- Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
- Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
- Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
- Huang, D., et al.
- Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
- Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
- Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
- Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H.
- Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
- Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
- Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202 (2007).
- Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006 (2010).
- Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
- Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
- Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
- Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
- Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).
- Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
- Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
- Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
- Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
- Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
- Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
- Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
- Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
- Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
- Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).
