Summary
该协议描述了一种简单有效的方法, 用于存储外周血和血清/血浆, 用于下游分析, 如单核苷酸多态性 (SNP) 评价和 ELISA 检测。
Abstract
血液样本质量是确保准确的下游分析, 如实时 PCR 或 ELISA 的关键。正确贮存生物材料是实现可重现性和可靠结果的出发点。所有样品的处理方式应与采集血液的方法相同。根据要执行的分析, 整个血液和血清样本应储存在-20 摄氏度或-80 °c, 直到使用。血液/血清标本也应 aliquoted, 以避免多种冻融。另一个重要的问题是从一个实验室装运到另一间化验室的样品条件。如果干冰不可用或装运时间超过几天, 则需要其他方法。一种选择是使用滤纸收集血液。在这里, 我们提出了血液和血清标本收集的方法, 利用干血点 (DBS) 和干血清点 (DSS)。我们开发了从 DBS 中提取 DNA 的程序, 用于对某些单核苷酸多态性 (SNPs) 进行实时 PCR 的下游评价。我们还优化了从 DSS 蛋白质洗脱开始的 ELISA 检测。该方法可与其他酶联免疫测定法或评估蛋白质的程序一起使用。
Introduction
研究癌症生物标志物的主要目的是确定新的生物学参数, 用于诊断、预测患者预后, 以及确定患者是否会对特定治疗作出反应。这个研究领域是发现创新癌症治疗的基础, 并在量身定做的治疗中发挥关键作用。
在生物标志物鉴定和验证的每一个步骤中执行的程序必须是可靠和可重现的。翻译研究成功的基石是正确储存血液和血清等生物样本。这是获得高质量生物材料的第一步, 可用于进行分子生物学实验或蛋白质化验。
多中心的研究往往需要招募足够的病人, 以获得可靠的数据。并非所有的研究所都能将样品储存在-80 摄氏度, 或者将样品送到其他国际中心的干冰中。使用滤纸收集血液是一种简单的方法来储存血液和血清, 不需要立即冻结样本1,2。一滴血或血清可以被发现在纸上, 留到干燥过夜, 然后储存14天的室温1,2。这使得研究者们有时间把样品送到其他实验室。利用干血点 (DBS) 和干血清点 (DSS) 可以简化发达国家和发展中国家研究所之间的合作。
由于它的易用性, DBS 取样被广泛应用于几种血清学或遗传下游分析的化验。例如, 在过去, 星展集团经常被用于发展中国家的艾滋病毒筛查1、2、3、4、5。这种存储方法的另一个优点是可以从手指刺中收集血液样本, 从而使其用于新生儿筛查试验6、7、8。方便的样品处理和运输是 DBS 的进一步优势, 特别是在没有实验室设备的偏远地区收集的样品。在以前的出版物中, 我们使用 DBS 和 DSS 测试维生素 d 和维生素 d 结合蛋白 (DBP) 在一系列的白种人和非洲患者9。我们的非洲同事无法获得干冰。为了比较生物标记物对两个族群之间维生素 D 通路的差异, 我们进一步改进了在标准条件下和滤纸上储存的匹配样品的使用方法。在优化了星展/DSS 程序后, 我们能够分析两个患者血清中的 DBP 和维生素 D。我们还评估了一些单核苷酸多态性 (SNPs) 后, 从全血 DNA 提取的白种人和星展集团的非洲9。本议定书允许高质量的血液样本储存在室温下, 而不影响不同类型的下游分析, 从分子生物学到 ELISA 化验。建议用于管理多中心研究中的生物材料或没有标准贮存条件设施的中心。下面的协议代表了这些优化过程的顶点。
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Protocol
外周血和血清被收集和储存的健康捐赠者和患者谁给予书面知情同意参与该项研究。该研究议定书是根据《1964赫尔辛基宣言》规定的道德标准, 由地方道德委员会批准的。
1. 星展集团的血液贮存
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采血样本收集
- 收集3毫升的外周血样本在3毫升管与5.4 毫克乙二胺乙酸 (EDTA)。
注: 在8小时内尽快将外周血储存在 DBS 内。 - 在保护卡的右下角写上病人代码号。
- 小心地用5毫升的吸管并用重悬血液。
- 收集3毫升的外周血样本在3毫升管与5.4 毫克乙二胺乙酸 (EDTA)。
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星展的血液斑点
- 吸管和转移一点血液 (50 µL) 到保护卡 (材料表) 与50–200µL 提示。
- 重复步骤1.2.1。有一共有3–5的血点。扔掉旧的小费, 并采取一个新的每一个血液整除。
- 让星展集团在室温下过夜, 在一个开放的不吸水表面, 避免阳光直射的水平位置。把保护卡的盖子打开, 方便血液干燥。
注: 在干燥过程中, 空气或粉尘中的任何微粒都不会影响下游的应用。 - 将卡在室温下存放在带有干燥剂的塑料袋中, 直到使用。
2. dna 提取试剂盒 (用于干血斑点切片) 从 DBS 开始
-
样品准备
- 使用卡上的3个干血点。从卡上切下每个干血点, 并用镊子将它们与卡分开。将分离的干血点切成小块 (直径约1毫米)。
- 将小块放入1.5 毫升离心管中。
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样品消化
- 将试剂盒 (材料表) 中提供的180µL 裂解缓冲液1添加到管中。添加20µL 蛋白酶 K。不要将裂解缓冲剂1与蛋白酶 k 混合, 然后再用血斑点卡吹打到1.5 毫升管。混合涡流。
- 把管子放在 thermoincubator 中, 在56摄氏度处孵化60分钟。如果 thermoincubator 没有配备摇床, 则每10–15至少十年代将样品涡流, 注意不要让样品的温度降低。简单地离心管子从盖子去除下落。
-
洗涤步骤
- 在十年代加入200µL 溶解缓冲 2 (材料表) 和漩涡。
- 将管子放在 thermomixer 或加热的轨道孵化器中, 在70摄氏度处孵化10分钟。如果 thermoincubator 没有配备振动筛, 则至少在十年代将样品涡流一次, 注意不要让样品的温度降低。
- 重复步骤2.3.1。将400µL 的裂解物从1.5 毫升管转移到洗脱柱 (材料表)。离心柱在 6000 x g 1 分钟。
- 将洗脱柱放入新的2毫升收集管中, 丢弃旧的。
- 添加500µL 洗涤缓冲 1 (材料表) 和离心机在 6000 x g 为1分钟。
- 将该列放入一个新的2毫升收集管并丢弃旧的。
- 添加500µL 洗涤缓冲 2 (材料表) 和离心机在 6000 x g 为1分钟。
- 将该列放入一个新的2毫升收集管并丢弃旧的。
- 离心机在 2万 x g 3 分钟干燥膜。
-
洗脱步骤
- 将该柱放入新的1.5 毫升离心管中, 并丢弃收集管。
- 将50µL 蒸馏水放到膜的中心。室温下孵育10分钟。
- 离心管在 2万 x g 1 分钟收集洗脱液并再次放置在膜的中心。
- 离心管在 2万 x g 1 分钟丢弃膜。
- 使用分光光度计测量 DNA 浓度。
- 储存的 DNA 在-20 摄氏度, 直到使用。
注: 从星展中提取的 DNA 可以用来进行几种分析, 如 SNP 评估的实时 PCR 或 DNA 测序。
3. 用于 DSS 的血清贮存
-
采血样本收集
- 收集7毫升的外周血样本在7毫升管没有 EDTA。让血样在室温下凝固30分钟。
- 在保护卡的右下角写上病人代码号。
- 在室温下离心 980 x g的血液样本15分钟。
注: 在8小时内尽快将血清作为 DSS 贮存。 - 小心地从试管中取出上清, 将其转移到新的15毫升管上。小心地用5毫升的吸管并用重悬血液。
-
DSS 中的血清斑点
- 用吸管将一点血清 (50 µL) 转移到保护卡上。重复这一步, 有一个总的3–5血点。
注意: 要非常小心地将50µL 的血清注入每个部位。血清不应超出卡的虚线。 - 让 DSS 在室温下过夜。把保护卡的盖子打开, 方便血液干燥。
- 将卡在室温下存放在带有干燥剂的塑料袋中, 直到使用。如果存储时间超过14天, 请将卡存储在-20 摄氏度。
- 用吸管将一点血清 (50 µL) 转移到保护卡上。重复这一步, 有一个总的3–5血点。
4. 从 DSS 开始的 ELISA 检测
-
洗脱蛋白来自 DSS。
- 如有必要, 解冻每个示例的 DSS。将 DSS 切成小块 (直径约1毫米)。把这些碎片放入一个1.5 毫升管与400µL PBS。
- 在4摄氏度一夜之间摇动样品。
注: 在低强度下摇动。在震动时, PBS 不应将管子的盖子弄湿。
- 根据 ELISA 试剂盒的指示, 在适当的稀释后, 使用蛋白洗脱液作为血清标本进行分泌蛋白/生长因子分析。
注: 本程序适用于 DBP 检测9。对于其他 ELISA 化验, 可能需要一个优化步骤。
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Representative Results
我们利用星展银行和 DSS 的程序, 在室温下储存血液和血清, 而不影响生物材料的质量。图 1显示了一个没有血液和血液收集后的蛋白卡保护程序的例子。为了确认滤纸的贮存和洗脱血液的过程不影响样品质量, 我们对标准贮存方法进行了比较。我们提取的 DNA 来自3匹配样本的全血收集的2毫升管或存储为 DBS, 如报告的协议部分。采用实时 PCR 技术对五个 SNPs 进行分析。为匹配的样品获得的数据是100% 和谐。
关于 ELISA 分析, 我们储存了8样品的血清收集在2毫升管 (并立即储存在-80 °c) 和作为 DSS (储存在室温下一周, 然后在-20 摄氏度)。我们从 DSS 中洗脱蛋白质, 如协议部分所述, 然后根据制造商的数据表为8样品进行 ELISA。结果见表 1。匹配样品之间的变异系数从2% 到24% 不等。平均 CV 为9.6%。
图 1: 星展在采血前后的例子.(A) 蛋白保护卡。(B) 血液取样后的蛋白保护卡。请单击此处查看此图的较大版本.
| DBP (µg/毫升) | |||
| 样品 | 血清 (st) | Dss | CV% |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
表 1: 匹配的 DSS 和血清样品中的 DPB 水平.用 ELISA 法分析了 DBP 的含量。CV 是在2得到的值之间计算出的变化系数。CV 百分比计算如下: (DSS 价值-血清价值)/DSS 价值) x 100%。
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Discussion
本议定书研究当实验室没有必要的工作人员或基础设施来正确处理血液样本时, 在滤纸上储存血液和血清的潜力。特别是, 在标准管或手指刺中收集的全血或血清可以用这种方法储存, 并且没有必要在血液收集后立即冷冻-20 摄氏度或-80 摄氏度的样品。星展/DSS 可以保持室温14天, 不改变血液/血清完整性。储存的一个关键问题是水分的存在, 影响生物材料的性能超过温度。使用干燥剂的塑料袋可以避免这个问题。当卡在塑料袋内时, 水分就成为了储存过程中的一个问题。在夜间孵化10期间, 没有观察到空气中微粒/水滴/灰尘或湿气造成的问题。我们以前用滤纸储存血液和血清在一个研究的生物标记在意大利和非洲人11。我们对星展集团的 DNA 提取进行了优化, 并分析了两种病例序列中的一些 SNPs。由于我们也对蛋白质水平的评估感兴趣, 我们优化了一种方法, 洗脱蛋白质从 DSS, 以执行 ELISA 化验。ELISA 的血清贮存比全血储存更微妙, 因为实验室的研究人员必须确保在所有样品中完全吸出相同量的血清。如果吹打不准确, 下游分析将受到损害。DNA 提取过程可应用于其他分子分析, 对每个新的细胞因子/分泌因子的匹配样本进行优化。重要的是把 DSS 切成很小的块, 并在夜间孵化过程中与 PBS 彻底湿润, 以确保有效的蛋白质洗脱。这是一个比血液洗脱更微妙的步骤, 因为 ELISA 是一个定量评估。
近年来, 这种存储方法已广泛用于不同的应用范围 (如本议定书所述) 从分子生物学到蛋白质分析12,13。特别是, 从14的保护卡中发现的血清开始, 质量好的结果, 证实了该方法的高灵活性和可靠性。
我们的结果与文献一致, 强调了将样本存储为星展集团的用处, 并确认了该程序在标准存储方法方面的可靠性。我们确认了以前的结果, 并强调了通过与我们的存储方法一起使用它来优化 ELISA 检测的可能性。由于它的简单性, 发展中国家也可以为癌症研究做出贡献。例如, 由于大多数对非洲人的研究都是针对非裔美国人进行的, 所以很少有关于9土著非洲国家的数据。利用 DBS 可以帮助弥合这一差距。
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Disclosures
作者没有披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们想感谢 Gráinne 的编辑协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
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