Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice e utile per memorizzare sangue periferico e del siero/plasma per analisi a valle, quali single nucleotide polymorphism (SNP) valutazione e analisi di ELISA.
Abstract
Qualità del campione di sangue è fondamentale per garantire l'accurata analisi a valle, quali ELISA o PCR in tempo reale. Corretta conservazione dei materiali biologici è il punto di partenza per ottenere risultati riproducibili e affidabili. Tutti i campioni devono essere trattati allo stesso modo da prelievo di sangue per deposito. In base alle analisi da eseguire, sangue intero e campioni di siero dovrebbero essere conservati a-20 ° C o da-80 ° C fino all'utilizzo. Campioni di siero di anima dovrebbero anche essere aliquotati per evitare più di congelamento-scongelamento. Un'altra questione importante è le condizioni del campione durante la spedizione da un laboratorio a altro. Se il ghiaccio secco non è disponibile o la spedizione richiede più di pochi giorni, sono necessari approcci alternativi. Un'opzione consiste nell'utilizzare la carta da filtro per la raccolta del sangue. Qui, vi proponiamo un metodo per sangue e raccolta del campione di siero che si avvale di secca macchie di sangue (DBS) e asciugato macchie del siero (DSS). Abbiamo sviluppato la procedura per estrarre il DNA da DBS per la valutazione a valle di alcuni polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) con real time PCR. Abbiamo inoltre ottimizzato saggio ELISA a partire da proteine eluite da DSS. Questo metodo può essere utilizzato con altri saggi ELISA o procedure di valutazione di proteine.
Introduction
L'obiettivo principale della ricerca in biomarcatori del cancro è l'identificazione di nuovi parametri biologici che possono essere utilizzati per la diagnosi, per predire la prognosi paziente e per determinare se un paziente risponderà ad un trattamento specifico. Questa area di ricerca è fondamentale per la scoperta delle terapie antitumorali innovativi e svolge un ruolo chiave nel trattamento su misura.
Procedure effettuate durante ogni passaggio del biomarcatore individuazione e la convalida devono essere affidabile e riproducibile. Un elemento fondamentale per il successo della ricerca traslazionale è la corretta conservazione dei campioni biologici quali sangue e siero. Questo è il primo passo verso l'ottenimento di materiale biologico di alta qualità che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di biologia molecolare o analisi proteina.
Studi multicentrici sono spesso necessarie per reclutare abbastanza pazienti per ottenere dati affidabili. Non tutti gli istituti sono in grado di conservare i campioni a-80 ° C o di inviare campioni di altri centri internazionali in ghiaccio secco. L'uso di carta da filtro per la raccolta del sangue è un metodo semplice per la memorizzazione di sangue e siero e non richiede il blocco immediato di campioni1,2. Una goccia di sangue o di siero possa essere individuata sulla carta, lasciato ad asciugare durante la notte e poi conservati per fino a 14 giorni a temperatura ambiente1,2. In questo modo i ricercatori tempo per inviare i campioni ad altri laboratori. L'uso di sangue secco macchie (DBS) e macchie secche del siero (DSS) così potrebbero semplificare la collaborazione tra istituti di paesi in via di sviluppo.
Data la sua facilità d'uso, DBS campionamento è ampiamente utilizzato in diversi tipi di analisi per analisi sierologiche o genetiche a valle. Ad esempio, in passato, DBS erano utilizzati frequentemente per l'HIV di screening in paesi in via di sviluppo1,2,3,4,5. Un altro vantaggio di questo metodo di deposito è che possono essere raccolti campioni di sangue dal dito-punture, permettendo così il suo uso per test 6,7,8di screening neonatale. Facile manipolazione e trasporto sono ulteriori vantaggi di DBS, specialmente per campioni raccolti in siti remoti dove non c'è nessuna attrezzatura di laboratorio. In una pubblicazione precedente, abbiamo utilizzato DBS e DSS a prova di vitamina D e vitamina D proteina (DBP) in una serie di pazienti caucasici e africano9. I nostri colleghi africani non erano in grado di ottenere ghiaccio secco. Per confrontare i marcatori biologici per comprendere le differenze nella via di vitamina D fra le due popolazioni etniche, abbiamo ulteriormente migliorato la procedura utilizzando abbinati i campioni conservati in condizioni standard e su carta da filtro. Dopo l'ottimizzazione della procedura DBS/DSS, siamo stati in grado di analizzare il DBP e la vitamina D nel siero del paziente in due coorti. Inoltre abbiamo valutato una serie di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) dopo estrazione del DNA da sangue intero per i caucasici e da DBS per gli africani9. Il presente protocollo permette i campioni di sangue di alta qualità per essere conservato a temperatura ambiente senza influenzare diversi tipi di analisi a valle che vanno dalla biologia molecolare a dosaggi ELISA. È consigliabile per l'uso gestire materiali biologici in studi multicentrici o per i centri che non dispongono di strutture per le condizioni di conservazione standard. Il seguente protocollo rappresenta il culmine di queste procedure ottimizzate.
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Protocol
Sangue periferico e del siero sono stati raccolti e memorizzati da donatori sani e pazienti che hanno dato il consenso informato scritto a partecipare allo studio. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico locale in conformità con gli standard etici stabiliti nella dichiarazione di Helsinki 1964.
1. sangue deposito in DBS
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Raccolta campioni ematici
- Raccogliere 3 mL di sangue venoso periferico in un tubo da 3 mL con 5,4 mg di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
Nota: Conservare sangue periferico come DBS appena possibile ed entro 8 h. - Scrivere il numero di codice paziente sull'angolo inferiore destro della scheda Screen saver.
- Risospendere accuratamente il sangue con una pipetta da 5 mL.
- Raccogliere 3 mL di sangue venoso periferico in un tubo da 3 mL con 5,4 mg di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
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Sangue di spotting sulla DBS
- Pipetta e trasferire una macchia di sangue (50 µ l) sulla scheda Screen saver (Tabella materiali) con una punta di 50-200 µ l.
- Ripetere il punto 1.2.1. avere un totale di 3 – 5 macchie di sangue. Eliminare la vecchia punta e prenderne uno nuovo per ogni sangue aliquota.
- Lasciare la DBS per asciugare durante la notte a temperatura ambiente in posizione orizzontale su una superficie non assorbente aperta, evitando la luce diretta del sole. Lasciare il coperchio della scheda Screen saver aperto per facilitare l'asciugatura di sangue.
Nota: Qualsiasi particolato in aria o polvere durante la fase di asciugatura non influisce sulle applicazioni a valle. - Conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino all'utilizzo.
2. DNA estrazione a partire da DBS secondo il Datasheet di Kit di estrazione del DNA (sezione per le macchie di sangue essiccato)
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Preparazione del campione
- Utilizzare 3 macchie di sangue essiccato dalla scheda. Tagliare ciascuna delle macchie di sangue essiccato dalla scheda e separarli dalla scheda con le pinzette. Tagliare le macchie di sangue essiccato separati in piccoli pezzi (diametro di circa 1 mm).
- Posto i pezzi piccoli in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
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Digestione del campione
- Aggiungere 180 µ l di tampone di lisi 1 fornito nel kit (Tabella materiali) al tubo. Aggiungere 20 µ l di proteinasi K. Non mescolare il buffer di lisi 1 con proteinasi k prima di pipettaggio nella provetta da 1,5 mL con sangue macchiato carta. Mescolare nel Vortex.
- Collocare la provetta in un thermoincubator e incubare a 56 ° C per 60 min. Se il thermoincubator non è dotato di un agitatore, vortexare il campione ogni 10 – 15 min per almeno 10 s, avendo cura di non far diminuire la temperatura del campione. Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce dal coperchio.
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Ciclo di lavaggio
- Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi 2 (Tabella materiali) e vortex per 10 s.
- Posizionare i tubi nel thermomixer o riscaldata incubatore orbitale e incubare a 70 ° C per 10 min. Se il thermoincubator non è dotato di un agitatore vortex i campioni una volta per almeno 10 s, avendo cura di non far diminuire la temperatura dei campioni.
- Ripetere il punto 2.3.1. Il 400 µ l di lisato di trasferimento dalla provetta da 1,5 mL a colonna di eluizione (Tabella materiali). Centrifugare la colonna a 6.000 x g per 1 min.
- Collocare la colonna di eluizione in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare quella vecchia.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 1 (Tabella materiali) e centrifugare a 6.000 x g per 1 min.
- Collocare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare quella vecchia.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 2 (Tabella materiali) e centrifugare a 6.000 x g per 1 min.
- Collocare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare quella vecchia.
- Centrifugare a 20.000 x g per 3 minuti ad asciugare la membrana.
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Passo di eluizione
- Posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL e scartare il tubo di raccolta.
- Mettere 50 µ l di acqua distillata sul centro della membrana. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare la provetta a 20.000 x g per 1 min. raccogliere l'eluato e collocarlo nuovamente il centro della membrana.
- Centrifugare la provetta a 20.000 x g per 1 min. scartare la membrana.
- Misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro.
- Archivio DNA a-20 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Il DNA Estratto da DBS consente di eseguire diverse analisi quali la valutazione di SNP mediante Real Time PCR o DNA Sanger sequenziamento.
3. siero deposito per DSS
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Raccolta campioni ematici
- Raccogliere 7 mL di sangue venoso periferico in una provetta 7 mL senza EDTA. Lasciare il campione di sangue a coagulare per 30 min a temperatura ambiente.
- Scrivere il numero di codice paziente sull'angolo inferiore destro della scheda Screen saver.
- Centrifugare il campione di sangue a 980 x g per 15 min a temperatura ambiente.
Nota: Conservare il siero come DSS appena possibile ed entro 8 h. - Con attenzione rimuovere il supernatante dal tubo e trasferirlo in una nuova provetta da 15 mL. Risospendere accuratamente il sangue con una pipetta da 5 mL.
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Siero spotting nel DSS
- Pipetta e trasferire uno spot del siero (50 µ l) sulla scheda Screen saver. Ripetere questo passaggio per avere un totale di 3 – 5 macchie di sangue.
Nota: Essere molto attenti a dispensare esattamente 50 µ l di siero in ogni spot. Siero non dovrebbe andare di là dalla linea tratteggiata della carta. - Lasciare il DSS per asciugare durante la notte a temperatura ambiente. Lasciare il coperchio della scheda Screen saver aperto per facilitare l'asciugatura di sangue.
- Conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino all'utilizzo. Se l'archiviazione è più di 14 giorni, conservare la carta a-20 ° C.
- Pipetta e trasferire uno spot del siero (50 µ l) sulla scheda Screen saver. Ripetere questo passaggio per avere un totale di 3 – 5 macchie di sangue.
4. analisi di ELISA a partire da DSS
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Eluire la proteina da DSS.
- Se necessario, scongelare un DSS per ciascun campione. DSS tagliate a piccoli pezzi (circa 1 mm di diametro). Mettere i pezzi in una provetta da 1,5 mL con 400 µ l di PBS.
- Agitare i campioni durante la notte a 4 ° C.
Nota: Agitare loro a bassa intensità. PBS non dovrebbe bagnare il coperchio del tubo durante l'agitazione.
- Utilizzare l'eluato di proteina come un campione di siero per analisi dei fattori di crescita/proteine secrete secondo le istruzioni del kit ELISA, dopo appropriate diluizioni.
Nota: Questa procedura funziona bene per DBP rilevamento9. Per altri saggi ELISA, può essere necessario un passaggio di ottimizzazione.
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Representative Results
Abbiamo approfittato delle procedure DBS e DSS per memorizzare sangue e siero a temperatura ambiente senza compromettere la qualità del materiale biologico. Figura 1 Mostra un esempio del risparmiatore carta proteina senza sangue e dopo la raccolta del sangue. Al fine di confermare che l'archiviazione su carta da filtro e la procedura per eluire il sangue non interferiscono con la qualità del campione, abbiamo effettuato un confronto con metodi di archiviazione standard. Abbiamo estratto il DNA da abbinati 3 campioni di sangue intero raccolto in una provetta da 2 mL o conservato come DBS, come riportato nella sezione protocollo. Cinque SNPs sono stati analizzati mediante real time PCR. I dati ottenuti per i campioni abbinati sono stati concordi al 100%.
Per quanto riguarda l'analisi ELISA, abbiamo memorizzato 8 campioni di siero raccolto in una provetta da 2 mL (e immediatamente conservati a-80 ° C) e come DSS (conservati a temperatura ambiente per una settimana e poi a-20 ° C). Abbiamo eluiti proteine dal DSS, come descritto nella sezione protocollo e quindi ha eseguito ELISA secondo datasheet del costruttore per il DBP per 8 campioni. Risultati sono riportati nella tabella 1. Il coefficiente di variazione (CV) tra campioni abbinati variato dal 2% al 24%. Il CV medio era 9,6%.
Figura 1: esempio di DBS prima e dopo la raccolta del sangue. (A) scheda Screen saver della proteina. (B) scheda Screen saver della proteina dopo prelievo di sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| DBP (µ g/mL) | |||
| Campioni | Siero (st) | DSS | CV % |
| 1 | 66,47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162,70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117,13 | 6 |
| 8 | 149,47 | 132.69 | 12 |
Tabella 1: livelli DPB in campioni di siero e abbinati DSS. Livelli DBP analizzati mediante ELISA. CV è il coefficiente di variazione calcolato tra i 2 valori ottenuti. La percentuale di CV è calcolata come segue: valore ((DSS value-Serum value)/DSS) x 100%.
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Discussion
Questo protocollo indaga il potenziale per la conservazione di sangue e siero su carta da filtro quando i laboratori non hanno il personale o le infrastrutture necessarie per la corretta gestione dei campioni di sangue. In particolare, sangue intero o siero raccolti in provette standard o da puntura del dito possa essere memorizzato utilizzando questo metodo, e non c'è nessun bisogno di congelarli a-20 ° C o da-80 ° C immediatamente dopo la raccolta del sangue. DBS/DSS può rimanere a temperatura ambiente fino a 14 giorni senza alcun cambiamento nell'integrità del siero di anima. Un problema critico per lo stoccaggio è la presenza di umidità che incide sulle proprietà del materiale biologico più di temperatura. Questo problema può essere evitato utilizzando sacchetti di plastica con essiccante. L'umidità diventa un problema durante l'immagazzinaggio, quando le carte sono all'interno dei sacchetti di plastica. Problemi derivanti da particolato in aria/goccioline/polvere o umidità non sono stati osservati durante l' incubazione durante la notte10. Abbiamo precedentemente usato carta da filtro per conservare sangue e siero in uno studio di markers biologici in coorti italiani e africani11. Abbiamo ottimizzato l'estrazione del DNA da DBS e analizzato un numero di SNPs in entrambe serie di caso. Come eravamo anche interessati a valutare i livelli della proteina, abbiamo ottimizzato un metodo per eluire proteine da DSS al fine di eseguire analisi di ELISA. Deposito di siero nel DSS per ELISA è più delicato rispetto sangue intero deposito per analisi di tipo qualitativo perché i ricercatori del laboratorio devono essere sicuri di dispensare esattamente la stessa quantità di siero in tutti i campioni. Se il pipettaggio non è accurato, analisi successive saranno compromessa. Mentre la procedura di estrazione del DNA può essere applicata ad altre analisi molecolare, la procedura di proteine deve essere ottimizzata in campioni abbinati per ogni nuovo fattore di citochina/secreto studiato. È importante tagliare DSS in pezzi molto piccoli e per bagnare i pezzi di carta accuratamente con PBS durante l'incubazione overnight per garantire eluizione proteina efficiente. Questo è un passo più delicato di quello di eluizione di sangue perché ELISA è una valutazione quantitativa.
Negli ultimi anni, questo approccio di deposito è stato ampiamente utilizzato per diverse applicazioni che vanno (come descritto in questo protocollo) dalla biologia molecolare al proteina analisi12,13. In particolare, buona qualità risultati di massa a partire dal siero avvistato in carte di risparmio sono stati segnalati14, confermando l'elevata flessibilità e l'affidabilità del metodo.
I nostri risultati, in accordo con la letteratura, sottolineare l'utilità di archiviazione di campioni come DBS e confermano l'affidabilità di questa procedura rispetto ai metodi di archiviazione standard. Abbiamo confermato i risultati precedenti e ha sottolineato la possibilità di ottimizzare il saggio ELISA di utilizzarlo insieme con i nostri metodi di deposito. Grazie alla sua semplicità, i paesi in via di sviluppo possono anche contribuire alla ricerca sul cancro. Ad esempio, come la maggior parte degli studi su africani vengono eseguita su afro-americani, molto pochi dati sono disponibili su nativi africani9. L'uso di DBS potrebbe contribuire a colmare questa lacuna.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
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