Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og nyttig metode for å lagre perifert blod og serum/plasma for nedstrøms analyser som single nukleotid polymorfisme (SNP) evaluering og ELISA-analysen.
Abstract
Blod prøve kvalitet er avgjørende for å sikre nøyaktig nedstrøms analyser som sanntid PCR eller ELISA. Riktig lagring av biologisk materiale er utgangspunktet oppnå reproduserbare og pålitelige resultater. Alle prøvene skal behandles på samme måte fra blod samling til lagring. Avhengig av analyser utføres, bør fullblod og serumprøver lagres på 20 ° C eller-80 ° C før bruk. Blod/serumprøver bør også være aliquoted å unngå flere fryse-tining. En annen viktig sak er eksempel betingelsene under forsendelsen fra ett laboratorium til en annen. Hvis tørris er ikke tilgjengelig eller forsendelsen tar lengre tid enn noen dager, er alternative tilnærminger nødvendig. Ett alternativ er å bruke filter papir for blod samling. Her foreslår vi en metode for blod og serum prøvetakingen som utnytter tørket blod flekker (DBS) og tørket serum flekker (DSS). Vi utviklet prosedyren for å trekke ut DNA fra DBS for nedstrøms evalueringen noen single nukleotid (SNPer) av sanntid PCR. Vi har også optimalisert ELISA analysen fra proteiner elut fra DSS. Denne metoden kan brukes med andre ELISA analyser eller prosedyrer evaluere proteiner.
Introduction
Hovedformålet med forskning i kreft biomarkers er identifisering av nye biologiske parametere som kan brukes for diagnostisering for forutsi pasienten prognose og for å avgjøre om en pasient vil svare på en behandling. Denne forskningen er grunnleggende for å nyskapende kreft behandlinger og spiller en nøkkelrolle i skreddersydd behandling.
Prosedyrene utført på hvert trinn i biomarkør identifikasjon og godkjenningen må være pålitelig og reproduserbar. En hjørnestein for suksessen av translasjonsforskning er riktig lagring av biologiske prøver som blod og serum. Dette er første skritt mot å få høy kvalitet biologisk materiale som kan brukes til å utføre molekylærbiologi eksperimenter eller protein analyser.
Multicenter studier er ofte nødvendig å rekruttere nok pasienter for å få sikre data. Ikke alle institutter kan lagre prøver-80 ° c eller sende prøver til andre internasjonale sentre i tørris. Bruk av filter papir for blod samling er en enkel metode for lagring av blod og serum og krever umiddelbar frysing av prøver1,2. En dråpe blod- eller serumprøver kan bli sett på papiret, igjen til tørr overnatting og lagres i opptil 14 dager ved romtemperatur1,2. Dette gir forskere tid å sende prøvene til andre laboratorier. Bruk av tørket blod flekker (DBS) og tørket serum flekker (DSS) kan dermed forenkle samarbeidet mellom institutter i industriland og utviklingsland.
Gitt sin brukervennlighet, er DBS prøvetaking mye brukt i flere typer analyser for serologisk eller genetisk nedstrøms analyser. For eksempel tidligere ble DBS ofte brukt for HIV screening i utviklingsland,1,,2,,3,,4,,5. En annen fordel med denne lagringsmetode er at blodprøver kan hentes fra finger-brodden, dermed muliggjør bruken for nyfødt screening tester 6,7,8. Enkelt eksempel håndtering og transport er ytterligere fordeler av DBS, spesielt for prøver i eksterne nettsteder der det er ingen laboratorieutstyr. I en tidligere publikasjon brukte vi DBS og DSS teste vitamin D og vitamin D bindende protein (DBP) i en rekke kaukasiske og afrikanske pasienter9. Våre afrikanske kolleger kunne ikke hente tørris. For å sammenligne den biologiske markører for å forstå forskjellene i vitamin D veien mellom de to etniske befolkningene, forbedret vi ytterligere prosedyren matchet utvalg lagret under standard betingelser og på filter papir. Etter optimalisere DBS/DSS prosedyren, kunne vi analysere DBP og vitamin D i pasienten serum i begge kohorter. Vi har også vurdert en rekke single nukleotid (SNPer) etter DNA utvinning fra fullblod for hvite og DBS for afrikanere9. Nåværende protokollen tillater høykvalitets blodprøver lagres ved romtemperatur uten å påvirke ulike typer nedstrøms analyser mellom molekylærbiologi ELISA analyser. Det anbefales for bruk til å styre biologisk materiale i multicenter studier eller sentre som ikke har fasiliteter for standard lagringsforhold. Følgende protokollen representerer kulminasjonen av disse optimalisert prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifert blod og serum ble samlet inn og lagret fra sunn donorer og pasienter som ga skriftlig samtykke i studien. Studien protokollen ble godkjent av den lokale etikk i samsvar med de etiske standardene fastsatt i 1964 erklæring i Helsinki.
1. blod lagring i DBS
-
Blod prøvetaking
- Samle 3 mL perifert blodprøve i en 3 mL tube med 5,4 mg av ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
Merk: Lagre perifert blod som DBS så snart som mulig og innen 8 timer. - Skrive pasienten kodenummeret i nederste høyre hjørne av saver kortet.
- Nøye resuspend blodet med en 5 mL pipette.
- Samle 3 mL perifert blodprøve i en 3 mL tube med 5,4 mg av ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
-
Blod flekkete på DBS
- Pipetter og overføre ett sted blod (50 µL) på saver kortet (Tabell for materiale) med 50-200 µL tips.
- Gjenta trinn 1.2.1. har totalt 3 – 5 blod flekker. Kast de gamle tipset og ta en ny en for hver blod aliquot.
- La DBS tørre over natten i romtemperatur i vannrett stilling over en åpne ikke-absorberende overflaten, unngå direkte sollys. La forsiden av saver kortet åpent å gjøre blod tørking.
Merk: Alle partikler i luften eller støv under dette tørking trinnet påvirker ikke nedstrøms programmer. - Oppbevar kortet i romtemperatur i en plastpose med fuktighet til bruk.
2. DNA utvinning fra DBS etter DNA utvinning Kit dataarket (inndelingen for tørket blod flekker)
-
Eksempel forberedelse
- Bruk 3 tørket blod flekker fra kortet. Skjær hver av de tørkede blod flekkene fra kortet og skille dem fra kortet med pinsett. Klipp den separerte tørkede blod flekker i små biter (diameter ca 1 mm).
- Plassere små stykker i en 1,5 mL sentrifuge rør.
-
Eksempel fordøyelse
- Legg til 180 µL av lyseringsbuffer 1 i settet (Table of Materials) til røret. Legge til 20 µL av proteinasen K. Ikke bland lyseringsbuffer 1 med proteinasen rett før pipettering inn i 1,5 mL røret med blod flekkete kort. Bland ved vortexing.
- Sett røret i en thermoincubator og ruge på 56 ° C for 60 min. Hvis thermoincubator ikke er utstyrt med en shaker, vortex prøven hvert 10-15 min for minst 10 s, ta vare ikke for å la temperaturen på prøven redusere. Kort sentrifuge rør for å fjerne dråper fra lokket.
-
Wash trinn
- Legge til 200 µL av lyseringsbuffer 2 (Tabell for materiale) og vortex for 10 s.
- Plasser rør i thermomixer eller oppvarmet orbital inkubator og ruge ved 70 ° C i 10 min. Hvis thermoincubator ikke er utstyrt med en shaker, vortex prøvene en gang i minst 10 s, ta vare ikke for å la temperaturen av prøvene redusere.
- Gjenta trinn 2.3.1. Overføre den 400 µL av lysate fra 1,5 mL tube elueringsrør kolonne (Tabell for materiale). Sentrifuge kolonnen 6000 x g for 1 min.
- Plasser kolonnen elueringsrør i en ny 2 mL samling rør og kast gjengangeren ettall.
- Legg til 500 µL av vaskebuffer 1 (Tabell for materiale) og sentrifuger 6000 x g for 1 min.
- Plasser kolonnen i en ny 2 mL samling rør og kast gjengangeren ettall.
- Legg til 500 µL av vaskebuffer 2 (Tabell for materiale) og sentrifuger 6000 x g for 1 min.
- Plasser kolonnen i en ny 2 mL samling rør og kast gjengangeren ettall.
- Sentrifuge 20.000 x g for 3 min tørke membranen.
-
Elueringsrør trinn
- Plasser kolonnen i en ny 1,5 mL sentrifuge tube og kast samling røret.
- Sted 50 µL destillert vann på midten av membranen. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge røret på 20.000 x g i 1 hente eluate og plassere den på nytt på midten av membranen.
- Sentrifuger røret i 20.000 x g i 1 kast membranen.
- Måle DNA konsentrasjonen bruker et spektrofotometer.
- Lagre DNA på 20 ° C før bruk.
Merk: DNA utvunnet fra DBS kan brukes til å utføre flere analyser som SNP evaluering av sanntid PCR eller DNA Sanger sekvensering.
3. serum lagring for DSS
-
Blod prøvetaking
- Samle 7 mL av perifert blodprøve i en 7 mL tube uten EDTA. La blodprøve å tykne i 30 min ved romtemperatur.
- Skrive pasienten kodenummeret i nederste høyre hjørne av saver kortet.
- Sentrifuge blodprøve 980 x g i 15 min ved romtemperatur.
Merk: Lagre serum som DSS så snart som mulig og innen 8 timer. - Nøye fjerne nedbryting fra røret og overføre den til en ny 15 mL tube. Nøye resuspend blodet med en 5 mL pipette.
-
Serum spotting i DSS
- Pipetter og overføre ett sted av serum (50 µL) på saver kortet. Gjenta dette trinnet for å har totalt 3 – 5 blod flekker.
Merk: Vær svært forsiktig Pipetter nøyaktig 50 µL av serum i hver spot. Serum bør ikke gå utover fra den stiplede linjen av kortet. - La DSS tørre over natten i romtemperatur. La forsiden av saver kortet åpent å gjøre blod tørking.
- Oppbevar kortet i romtemperatur i en plastpose med fuktighet til bruk. Hvis lageret er lengre enn 14 dager, Oppbevar kortet på 20 ° C.
- Pipetter og overføre ett sted av serum (50 µL) på saver kortet. Gjenta dette trinnet for å har totalt 3 – 5 blod flekker.
4. ELISA-analysen fra DSS
-
Elute protein fra DSS.
- Eventuelt tine en DSS for hvert utvalg. Skjær DSS i små biter (ca 1 mm i diameter). Sette bitene i en 1,5 mL tube med 400 µL av PBS.
- Riste prøvene natten på 4 ° C.
Merk: Riste dem lav intensitet. PBS bør ikke våt av røret under risting.
- Bruke protein eluate som en serum prøve for utskilles protein/vekst faktor-analyse i henhold til ELISA kit instruksjoner, etter passende fortynninger.
Merk: Denne fremgangsmåten fungerer bra for DBP oppdagelsen9. For andre ELISA analyser kreves en optimalisering trinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tok fordel av de DBS og DSS prosedyrene for å lagre blod og serum ved romtemperatur uten å påvirke kvaliteten på det biologisk materialet. Figur 1 viser et eksempel på protein kort saver uten blod og etter blod samling. For å bekrefte at lagring på filter papir og fremgangsmåten for å elute blod ikke forstyrrer utvalg kvalitet, utført vi en sammenligning med målestokk lagringsmetoder. Vi hentet DNA fra 3 matchet prøver av fullblod samlet i en 2 mL tube eller lagret som DBS, som rapportert i delen protokollen. Fem SNPs ble analysert av sanntid PCR. Dataene innhentet for samsvarende prøver var 100% overensstemmende.
Med hensyn til ELISA analyser, vi lagret 8 prøver av serum samlet i en 2 mL tube (og lagret umiddelbart ved-80 ° C) og DSS (lagret ved romtemperatur for en uke og så på 20 ° C). Vi elut proteiner fra DSS, som beskrevet i delen protokoll og deretter utført ELISA etter produsentens dataark for DBP for 8 prøvene. Resultatene vises i tabell 1. Variasjonskoeffisienten (CV) mellom matchet prøvene varierte fra 2% til 24%. Gjennomsnittlig CV var 9.6%.
Figur 1: eksempel på DBS før og etter samlingen blod. (A) Protein saver kort. (B) Protein saver kortet etter blodprøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| DBP (µg/mL) | |||
| Prøver | Serum (st) | DSS | CV % |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
Tabell 1: DPB nivåer i matchet DSS og serumprøver. DBP nivåer analysert av ELISA-analysen. CV er variasjonskoeffisienten beregnet mellom 2 innhentet. CV prosent beregnes som følger: ((DSS value-Serum value)/DSS verdi) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen undersøker muligheten for lagring av blod og serum på filter papir når labs ikke har ansatte eller infrastruktur nødvendig for riktig håndtering av blodprøver. Spesielt fullblod eller serum samlet i standard rør eller finger-stikk kan lagres ved hjelp av denne metoden og det er ikke nødvendig å fryse samples ved 20 ° C eller-80 ° C umiddelbart etter samlingen blod. DBS/DSS kan forbli i romtemperatur i opptil 14 dager uten endring i blodårene/integritet. Viktig for lagring er tilstedeværelse av fuktighet som påvirker egenskapene for biologisk materiale mer enn temperaturen. Dette problemet kan unngås ved hjelp av plastposer med fuktighet. Fuktighet blir et problem under lagring når kortene er i plastposer. Problemer som følge av partikler i luften/dråper/støv eller fuktighet var ikke observert i løpet av natten inkubasjon10. Vi har tidligere brukt filter papir lagre blod og serum i en studie av biologiske markører i italiensk og afrikanske kohorter11. Vi optimalisert DNA utvinning fra DBS og analysert en rekke SNPs i begge tilfelle serien. Som vi var også interessert i å evaluere protein nivå, optimalisert vi en metode for å elute proteiner fra DSS for å utføre ELISA analyser. Serum lagring i DSS for ELISA er mer delikat enn fullblod lagring for kvalitativ analyser fordi laboratorium forskere må forsikre Pipetter nøyaktig samme mengde serum i alle prøvene. Hvis pipettering ikke er nøyaktig, blir nedstrøms analyser kompromittert. Mens DNA utvinning prosedyren kan brukes til andre molekylære analyser, skal protein prosedyren være optimalisert i matchet prøver for hver nye cytokin/utskilles faktor undersøkt. Det er viktig å kutte DSS i veldig små biter og våt biter av kort grundig med PBS under overnatting incubation å sikre effektiv protein elueringsrør. Dette er litt mer delikat enn blod elueringsrør fordi ELISA er en kvantitativ vurdering.
De siste årene, har dette lagring tilnærming vært mye brukt for forskjellige søknadene oppstiller (som beskrevet i denne protokollen) fra molekylærbiologi til protein analyse12,13. Spesielt rapportert god kvalitet masse resultatene fra serum oppdaget i saver kort har vært14, bekrefter det høy fleksibilitet og pålitelig metoden.
Våre resultater, med litteratur, markere nytten av lagre prøver som DBS og bekrefte påliteligheten til denne prosedyren med hensyn til standard lagringsmetoder. Vi bekreftet tidligere resultater og understreket at optimalisere en ELISA-analysen ved å bruke den sammen med våre lagringsmetoder. Takket være sin enkelhet, kan utviklingsland også bidra til kreftforskning. For eksempel som fleste studier av afrikanere utføres på afrikanske amerikanere, er svært få data tilgjengelig på native afrikanere9. Bruk av DBS kan bidra til å bygge bro dette gapet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Gráinne Tierney for redaksjonell bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
