Summary
توفر هذه المقالة نهج تحديث للنظام الكلاسيكي الدجاج السمان الوهم لدراسة تكوين الجهاز، ومن خلال الجمع بين رواية الإجراءات التجريبية في المختبر و في ovo .
Abstract
كان الجنين إنفلونزا الطيور، كنموذج تجريبي، أهمية قصوى للاكتشافات الأصيلة في علم الأحياء التنموي. من بين العديد من الطرق وتشكيل التركيبات السمان-الدجاج واستخدام الغشاء تشوريوالانتويك (كام) لمواصلة تطوير أنسجة خارج الرحم تاريخ يعود إلى القرن الماضي. في الوقت الحاضر، يقدم المزيج من هذه الأساليب الكلاسيكية مع المنهجيات الحديثة في المختبر آفاق الرواية مواصلة استكشاف تشكيل الجهاز.
هنا يصف لنا نهجاً خطوتين للدراسة ومتأخرة-المراحل الأولى من أورجانوجينيسيس. بإيجاز، منطقة الجنينية التي تحتوي على الإقليم المفترض للجهاز يتم عزل من الأجنة السمان، ونمت في المختبر في نظام أورجانوتيبيك (ما يصل إلى 48 ساعة). وفي وقت لاحق يتم المطعمة الأنسجة المستزرعة على كام جنين الدجاج. بعد 10 أيام تنمية في ovo ، يتم الحصول على أجهزة شكلت بالكامل من الأنسجة المطعمة. يسمح هذا الأسلوب أيضا تحوير مما يشير إلى مسارات الإدارة العادية لوكلاء الدوائية والتلاعب بالجينات الأنسجة في جميع أنحاء الخطوات الإنمائية في المختبر و في ovo . بالإضافة إلى ذلك، وضع الأنسجة يمكن جمعها في أي إطار زمني تحليل التعبير الجيني الشخصية (باستخدام PCR الكمي (قبكر), [ميكروارس], إلخ) ومورفولوجيا (تقييم مع الأنسجة التقليدية وإيمونوتشيميستري).
يمكن استخدام الإجراء التجريبي المبين كأداة لمتابعة تكوين الجهاز خارج الجنين إنفلونزا الطيور، من المراحل المبكرة من organogenesis تماما تشكيلها والأجهزة الفنية.
Introduction
أجنة الطيور قد استخدمت على نطاق واسع في دراسات علم الأحياء التنموي المنوي. وتشمل المزايا الرئيسية لنموذج إنفلونزا الطيور إمكانية فتح البيضة، ووصول سهلة نسبيا للجنين، والقدرة على أداء ميكرومانيبوليشن. بعض الأمثلة تشمل نظام كلاسيك الدجاج السمان الوهم لدراسة الخلية مصير1، وتطبيق عوامل نمو معينة ل الجنين2، ونمو الهياكل الخلوية حمل خارج الرحم في كام1،3، 4.
للحصول على أفكار جديدة إلى مراحل متميزة لتكوين الجهاز، وضعنا مؤخرا أسلوب الذي يجمع بين تقنيات التطعيم بالتلاعب في المختبر من الأنسجة الجنينية5. تمكين النهج خطوتين التمييز والاستكشاف لكلا-وأواخر-المراحل الأولى من أورجانوجينيسيس، التي غالباً ما تكون محدودة بسبب تفاعلات الأنسجة المعقدة وديناميكية عالية2. وعلاوة على ذلك، عدم وجود علامات خاصة بالانسجة مناسبة كثيرا ما يحد من الاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا النماذج الحيوانية6. هذا الأسلوب رواية النهج خطوتين إلى حد كبير ويتغلب على هذه القيود.
دراسة المراحل الأولى لتكوين الجهاز، في خطوة أولى، معزولة الإقليم الجنينية السمان تتألف من بداية الجهاز المرتقب ونمت في نظام أورجانوتيبيك في المختبر ح 48. خلال هذه الفترة، يمكن أن يؤديها التشكيل الدوائية لمسارات إشارات محددة إلى إضافة الأدوية إلى5،المتوسطة الثقافة7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن جمعها في أي مرحلة من النمو في المختبر الأنسجة المستزرعة وسبر للتعبير الجيني (باستخدام أساليب مثل قبكر، [ميكروارس]، إلخ).
في الخطوة الثانية، ثم يتم المطعمة الأنسجة المستزرعة ح 48 على كام جنين الدجاج (ج) في يوم الجنينية (ه) 8 (cE8) (همبرغر وهاملتون (ح ح)-مراحل 33-35)8. كام يتصرف كمورد الأوعية الدموية من المواد الغذائية، ويسمح للغاز التبادلات1،3،4 للأنسجة المطعمة التمكين على التنمية في ovo لفترات أطول من الوقت. هذه خطوة تجريبية خاصة أيضا مناسبة لدراسة المراحل المتأخرة من أورجانوجينيسيس، كما يمكن الحصول على أجهزة شكلت بالكامل بعد 10 أيام في ovo التنمية5،،من910،11 . بسهولة إجراء التحليل المورفولوجي بالانسجة التقليدية لتأكيد تشكيل الجهاز السليم، ويمكن تحديد الجهات المانحة المنشأ من الخلايا إيمونوهيستوتشيميستري باستخدام الأجسام المضادة إبلاغها (أيماب السمان بيرينوكلير (قكبن)). خلال فترة الحضانة كام، يمكن أيضا تزايد حضور وكلاء الدوائية الطعوم وجمعها في أي مرحلة من التنمية لتقييم تطور organogenesis.
النهج خطوتين، الموصوفة هنا في العمق، واستخدمت فعلا في فيغيريدو et al. 5 لاستكشاف وضع الغدة الدرقية إنفلونزا الطيور/الغدة الصعترية primordium المشتركة. وبناء على ذلك، ستعرض الملازمة لخصوصيات الأقاليم الجنينية ومراحل التنمية المشتركة في أورجانوجينيسيس الغدة الصعترية والغدد الدرقية أدناه.
الغدة الصعترية والغدد الدرقية ابيثيليا، على الرغم من الناحية الوظيفية المتميزة، تستمد من الأنسجة الحقائب البلعوم (PP)12. في إنفلونزا الطيور، ابيثيليا هذه الأجهزة تنبع من الثالثة والرابعة PP الأنسجة (3/4PP)12، بينما في الثدييات ظهارة الغدة الصعترية مستمد من 3PP وظهاره الغدة الدرقية الغدد مستمد من 3PP و 3/4PP في الماوس والبشرية، على التوالي من13،،14.
واحدة من المراحل الأولى في تشكيل هذه الأجهزة هو ظهور الغدة الصعترية المنفصلة والمجالات جارات الدرق في بريمورديوم المشتركة. الدجاج، ويمكن تحديد هذه المجالات بالتهجين في الموقع ، مع علامات جزيئية محددة، في E4.515. كما عائدات التنمية، هذه الهيئة ترافع تفريد وفصل من البلعوم، بينما كبسولة الوسيطة رقيقة، شكلتها الخلايا المستمدة من قمة العصبية، يحيط بهم (في E5؛ 27 هستاجي). وفي وقت لاحق من استعمر ظهارة الغدة الصعترية الخلايا المكونة للدم السلف (في E6.5؛ هستاجي 30)12.
كما هو الحال في الدراسات الكلاسيكية الدجاج السمان1،12، نهج خطوتين مفيد بشكل خاص لدراسة تشكيل الهيئات المكونة للدم/اللمفاوية، الغدة الصعترية هي5. كما explant السمان، مع بداية الجهاز، هو المطعمة في جنين الدجاج قبل استعمار الخلايا المكونة للدم السلف، تتشكل الغدة الصعترية تشيميريك مع الدجاج السلف التي يحملها الدم الخلايا التسلل إلى نظير الظهارية الغدة الصعترية السمان. هذا الأسلوب، لذلك، أداة مفيدة لاستكشاف المساهمة الخلايا المكونة للدم في تطوير نظام حمتو/اللمفاوية إنفلونزا الطيور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كل هذه التجارب اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية دي التاريخ مركز الطب والرعاية الحيوانية يسبوا.
1-حضانة السمان المخصبة وبيض الدجاج
- احتضان السماني الياباني (طائر طائر japonica) وبيض الدجاج (Gallus gallus) مخصبة لأيام 3 و 8، على التوالي.
- وضع البيض مع الدائرة الجوية (نهاية غير حادة البيض) التي تواجه في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية.
- استخدم بيض السمان حوالي 20 وبيض الدجاج 40 لإجراء هذه التجربة.
ملاحظة: ينبغي مضاعفة هذه الأرقام عند وضع هذا الإجراء للمرة الأولى.
2-عزل المنطقة الجنينية السمان التي تحتوي على أراضي الظني ترافع الغدة الصعترية وجارات الدرق
ملاحظة: إجراء البيض إجراءات التلاعب في ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي أفقي وتعقيم الأدوات والمواد.
- إعداد وعاء كبير البورسليكات زجاج حول 3/4 مليئة بالمياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات (PBS) الحل.
- فتح بيض السمان بعد 3 أيام حضانة بالتنصت على شل وقطع افتتاح دائري على الجانب المعاكس من نهايته حادة مع مقص منحنى. بعناية إزالة قطعة من قذيفة ونقل الجنين إلى وعاء الزجاج مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة.
- عقد الجنين السمان (q) في E3 (qE3) (مرحلة السمان المقابلة إلى السمو-المرحلة 21 من الدجاج) بمساعدة الملقط رقيقة. إجراء قطع في الغشاء فيتيلين تخيم صفار البيض باستخدام مقص منحنى. تواصل قطع حولها، وخارجياً إلى محيط السفن خارج الجنينية.
- نقل الجنين إلى صغيرة صحن حوالي 3/4 مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة بمساعدة الملقط رقيقة. دقة يغسل الجنين من الصفار المرفقة المتبقية.
- استخدام من المصفاة لنقل الجنين إلى كوب 100 مم طبق بيتري مع الأسود قاعدة (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- ضع طبق بيتري تحت ستيريوميكروسكوبي.
ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، تنفيذ إجراءات الجراحة تحت ستيريوميكروسكوبي للتكبير التدريجي. كمصدر لإضاءة، فإنه ينصح باستخدام مصابيح LED التي أدرجت في ستيريوميكروسكوبي أو الألياف البصرية، تفكر في الحمل الحراري محدودة. - عقد الجنين إلى الجزء السفلي من اللوحة مع دبابيس الحشرات رقيقة. ضع أربعة دبابيس تشكيل شكل مربع في منطقة خارج الجنينية.
- إزالة الأغشية الجنينية خارج المنطقة الرأسي بمساعدة الملقط رقيقة ووضع دبوس الخامس هناك.
ملاحظة: إذا كان يتم بشكل صحيح وضع الجنين، ثم حويصلة عتيق وأنبوب القلب، و 1st, 2ndوالأقواس البلعوم 3rd (PAs) يجب أن تكون مرئية. - تشريح المنطقة الجنينية الفائدة، أي، 3rd و 4th البلعوم قوس المنطقة (3/4PAR)، باستخدام مقص العين يكر.
- بدء قطع طوليا وموازية لمحور الجنين، بين منطقة أنبوب سميط/العصبية، ونظام تقييم الأداء.
- إزالة أنبوب القلب بطنيا متوضعة بقطع عليه. حفظ المقص في نفس الموضع، تدوير طبق بيتري لإعادة تعيين موضع الجنين تبعاً لاتجاه الخفض.
- قطع بين 2nd و 3rd نظام تقييم الأداء، وأدناه 4th السلطة الفلسطينية.
- فصل الأغشية المتبقية من 3/4PAR بمساعدة الملقط رقيقة.
- نضح الأنسجة المعزولة (3/4PAR) ونقل لهم طبق زجاج 3/4 مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة استخدام ماصة بلاستيكية معقمة 2 مل.
ملاحظة: الآخرة، الأنسجة يمكن أن تزرع في المختبر يصل إلى 48 ساعة أو يكون المطعمة فورا على كام جنين الدجاج في E8. - يبقى الطبق الزجاج الذي يحتوي على 3/4PAR معزولة على الجليد أثناء التحضير للفحص في المختبر .
3. في المختبر بالانزيم أورجانوتيبيك: ثقافة المنطقة الجنينية التي تحتوي على أراضي الظني ترافع الغدة الصعترية وجارات الدرق
- تعد الثقافة المتوسطة مع "المتوسط" RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
ملاحظة: يمكن إضافة الكواشف الدوائية القابلة للذوبان إلى المتوسطة (على سبيل المثال، LY-411.575 (Ly) دي-بينزازيبيني أو سيكلوباميني وفيسموديجيب، تحول دون تحقيقها والقنفذ (ح ح) مما يشير إلى مسارات، على التوالي. لهذا التحليل، استخدام 50-200 نانومتر لي أو 5-15 ميكرون من دي-بينزازيبيني لتمنع الشق إشارات في 3/4PAR. استخدام 20 ميكرون من سيكلوباميني أو 10 ميكرون من فيسموديجيب لتمنع سمو إشارات في 3/4PAR5. - إعداد ثقافة explant 3/4PP في لوحة 6-جيدا في المختبر .
- سد بئر واحدة من لوحة 6-جيدا مع 5 مل من الثقافة المتوسطة. ضع 24 مم إدراج غشاء البولي (انظر الجدول للمواد) في البئر بمساعدة الملقط رقيقة.
- تحت ستيريوميكروسكوبي، نقل اكسبلانت 3/4PAR من الطبق الزجاج على سطح الغشاء بالانزلاق بلطف بمساعدة ملعقة زرع (أو الملعقة) ورقيقة الملقط. ضع اكسبلانتس مع الجانب البطني الأعلى والجانب الظهرية على اتصال الغشاء. إضافة explants يصل إلى سبعة في إدراج غشاء. انتقل إلى الخطوة 3، 4.
- بدلاً من ذلك، اكسبلانتس الثقافة في غشاء فلاتر العائمة.
- تعد 35 مم طبق بيتري مع 5 مل من الثقافة المتوسطة. بمساعدة الملقط رقيقة، تعويم غشاء تصفية (انظر الجدول للمواد)، والحفاظ على سطح جاف على اتصال بالهواء.
- تحت ستيريوميكروسكوبي، نقل اكسبلانت 3/4PAR من الطبق الزجاج إلى تصفية الغشاء بانزلاق لطيف مع المساعدة من زرع ملعقة (أو الملعقة) ورقيقة الملقط. ضع اكسبلانتس مع الجانب البطني الأعلى والجانب الظهرية على اتصال الغشاء. إضافة explants يصل إلى 8 كل غشاء التصفية.
- ضع explants أعد الخطوات 3.2 و 3.3 في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2بعناية.
- وبعد فترة حضانة 48 ساعة، إزالة لوحة 6-جيدا وملم 35 طبق بيتري من الحاضنة.
- جمع explants مثقف من إدراج غشاء اللوحة 6-جيدا.
- إضافة برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى إدراج غشاء.
- فصل اكسبلانتس من الغشاء بالتنظيف قوية باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة 2 مل.
- مع المساعدة من البسط والملقط رقيقة، نقل explants مثقف لطبق زجاج 3/4 مليئة ببرنامج تلفزيوني في الرايت
- وبالمثل، جمع explants مثقف من تصفية غشاء عائمة في 35 ملم من طبق بيتري.
- نقل عامل التصفية الغشاء مع الملقط رقيقة إلى طبق بتري 35 ملم جديدة مليئة ببرنامج تلفزيوني في الرايت
- فصل اكسبلانتس من غشاء التصفية باستخدام بيبيتينج قوية ماصة بلاستيكية معقمة 2 مل.
- بمساعدة الملقط رقيقة، الاضطلاع بتصفية غشاء explant خالية بعد أن يؤكد أنه لا يزال لا explants مرفقة به.
- مع ملعقة والملقط رقيقة، ونقل اكسبلانتس إلى طبق زجاج مليئة ببرنامج تلفزيوني في الرايت
- جمع explants مثقف من إدراج غشاء اللوحة 6-جيدا.
- نقل explants مثقف مع ملعقة إلى 1 مل كاشف لعزل الحمض النووي الريبي واستخدام دراسات التعبير الجيني.
تنبيه: التعرض لهذا الكاشف (انظر الجدول للمواد) يمكن أن يكون خطرا على صحة خطيرة. ارتداء النظارات الواقية المناسبة والملابس والقفازات. اتبع الإرشادات التي تظهر في التعامل مع وقراءة صحائف بيانات السلامة توفرها الشركة المصنعة. - وبدلاً من ذلك، graft الأنسجة المستزرعة على كام أجنة الدجاج في E8. اتبع الخطوة 4.
4-إعداد كام
- إزالة بيض الدجاج مع 8 أيام تنمية الجنينية من الحاضنة.
ملاحظة: تم المحتضنة البيض مع الدائرة الجوية التي تواجه صعودا في 38 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد. - تغطية نهاية حادة من البيض مع الشريط البلاستيك الشفاف للحيلولة دون الوقوع في دائرة الهواء قطعة من shell. انقر فوق shell وقطع افتتاح دائري في البيض مع مقص منحنى. الدائرة الجوية يجب أن تكون مرئية.
- إزالة الغشاء الأبيض الدائرة الجوية بحذر مع الملقط رقيقة. ومن ثم كام مرئية ويمكن الوصول إليها لزرع الأنسجة حمل خارج الرحم.
ملاحظة: لا تستخدم برنامج تلفزيوني لهيدرات كام، قبل أو بعد زرع الأعضاء، وبما يعزز برنامج تلفزيوني انزلاق وفقدان اكسبلانتس. إذا كان الغشاء يجف، تجاهل البيض.
5-تطعيم Explants مثقف على كام
- إنشاء الجروح آفات الأوعية الدموية الصغيرة في سفن أصغر حجماً من كام مع ميكروسكالبيل في حامل.
ملاحظة: استخدام تلميح ماصة باستور لإزالة الدم بالشعرية في حالة النزيف الزائد. - استخدام ملعقة والملقط رقيقة لنقل explant مثقف إلى منطقة الجرحى كام.
- قص قطعة من ورقة تصفية أكبر قليلاً من explant ووضعه على رأس اكسبلانت.
ملاحظة: يساعد الورقة تصفية تتبع موقع explant بعد تطويره في كام. أيضا، فإنه يتيح اليومية إيصال المخدرات إلى explant خلال التنمية في ovo ، إذا لزم الأمر (كما هو موضح في الخطوة 5، 6). - إغلاق النافذة البيضة مع الشريط البلاستيك الشفاف والتعرف عليه باستخدام قلم رصاص فحم.
ملاحظة: الشريط البلاستيك يحمي الجنين من الجفاف خلال فترة الحضانة. - احتضان البيض التلاعب بها لمدة 10 أيام في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية. اتبع الخطوة 6.
- خطوة اختيارية: إدارة المخدرات اليومية خلال فترة الحضانة.
- للحصول على عامل التصفية، جزئيا برفع الشريط البلاستيك. إضافة 100 ميليلتر من المخدرات الحل، قطره قطره، على رأس الورقة. إعادة ختم النافذة ووضع البيض مرة أخرى في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية.
ملاحظة: لهذا التحليل، سوف الجرعة من 20 ميكرومتر من سيكلوباميني تمنع سمو الإشارات خلال في ovo التنمية5.
- للحصول على عامل التصفية، جزئيا برفع الشريط البلاستيك. إضافة 100 ميليلتر من المخدرات الحل، قطره قطره، على رأس الورقة. إعادة ختم النافذة ووضع البيض مرة أخرى في حاضنة هوميديفيد في 38 درجة مئوية.
6-تكوين الجهاز حمل خارج الرحم في كام بعد 10 أيام تنمية في Ovo
- بعد 10 أيام حضانة، إزالة البيض من الحاضنة وسحب الشريط البلاستيك بعناية.
- قطع كام حول المنطقة عامل تصفية باستخدام مقص منحنى ونقل explant المستمدة من كام مع أوراق الترشيح لزجاج صغيرة وعاء حوالي 3/4 مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة.
- بمساعدة الملقط رقيقة نقل explant المستمدة من كام إلى 100 مم طبق بيتري مع قاعدة السوداء التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة ورق الترشيح والزيادة في استخدام يكر العين المقص والملقط رقيقة الغشاء بلطف.
- نقل كام-اكسبلانت إلى حل مثبت (3.7 ٪ منهاج العمل في برنامج تلفزيوني) مع المصفاة. Euthanize أجنة الدجاج دون إزالتها من البيض بصنع قطع دقيقة في منطقة العنق للجنين بمساعدة مقص كبير.
- تقييم تشكيل الهيئة في أقسام البارافين explants المستمدة من كام بالانسجة التقليدية وإيمونوهيستوتشيميستري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ما ورد أعلاه وصف تفاصيل البروتوكول أسلوب الذي يسمح التحقيق من على حد سواء-وأواخر-المراحل الأولى من أورجانوجينيسيس، غالباً ما تكون محدودة بالتفاعلات الخلوية والجزيئية المعقدة.
هذا الأسلوب كان يعمل سابقا في فيغيريدو et al. 5 لكشف دور الشق وسمو إشارات في التنمية بريمورديوم الغدة الدرقية إنفلونزا الطيور/الغدة الصعترية المشتركة.
هنا، تظهر نتائج جديدة في الشكل 1 و الشكل 2 باستخدام نفس النموذج من أورجانوجينيسيس. ويصور الشكل 1A تصميم تجريبي يستخدم لاستكشاف في المراحل المبكرة من الغدة الصعترية وتشكيل جارات الدرق. أن الإقليم الجنينية السمان تضم ترافع الجهاز المرتقب (3/4PAR) على معزولة ونمت في المختبر ح 48 في نظام أورجانوتيبيك.
الشكل 1 . الحصول على نتائج الممثل مع المقايسة الثقافة أورجانوتيبيك: تحليل التعبير الجيني المنطقة الجنينية التي تتضمن الأراضي المفترض الغدة الصعترية وباراثيرويدس (3/4PAR) وضعت في المختبر ل 48 h. التمثيل التخطيطي من المقطع مستعرضة للجنين في منطقة الاهتمام والتصميم التجريبي (A). باختصار، كان 3/4PAR في qE3 ميكانيكيا معزولة ونمت في المختبر ح 48. التعبير عن الجينات المتعلقة 3/4PAR، Tbx1، Six1، و Bmp4، بحثت قرت-PCR تستخدم في الإشعال في الجدول (ب). تم تحليلها في طازجة معزولة (3-4PAR-0 ح) التعبير عن Tbx1 و Six1 و Bmp4 واستزراع الأنسجة (ح 3/4PAR-48) (ج). وقد تم تحليل الجينات المتعلقة الاسمية في الأنسجة التي نمت في المختبر ح 48 حضور 200 نانومتر Ly411575 (د) و 20 ميكرومتر سيكلوباميني (E)، ومثبطات الدوائي من الدرجة والقنفذ مما يشير إلى مسارات، على التوالي. التعبير عن كل نسخة تقاس كنسبة متوسط مستويات التعبير نسخة بيتا-أكتين وهيبوكسانثيني-جوانينيفوسفوريبوسيلترانسفيريز والتعبير عنها بوحدات التعسفي (كل نص في عنصر التحكم = 1). تم تحديد وسائل والانحرافات المعيارية مع برنامج حاسوبي لتحليل الإحصاء الحيوي وتصميم الرسوم البيانية العلمية. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية للوسط. مزاوج ثنائي الطرف الطالب t-تم استخدام الاختبار، وتم النظر في نتائج مختلفة إلى حد كبير عندما فكانت قيمة أقل من 0.05 (ف < 0.05). Β-أكتين، أكتب؛ سيكلوباميني، الفتوة؛ هيبوكسانثيني-جوانينيفوسفوريبوسيلترانسفيريز، هبرت؛ LY-411.575، لي؛ ن، نوتوكورد؛ NT، الأنبوب العصبي؛ PAR، منطقة القوس البلعوم؛ PP، الحقيبة البلعوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تم تقييم التعبير عن الجينات المعروفة للمشاركة في تشكيل هياكل الاسمية (الجينات المتعلقة الاسمية)، أي، Tbx1،من1617،18من Six1، و Bmp415،17، خلال العادي التنمية. وأجرى الوقت الحقيقي الكمي PCR (قرة-PCR) كما هو موضح سابقا5 (يتم سرد أجهزة الإشعال في الشكل 1B). تم الكشف عن المحاضر الحرفية للجينات الثلاثة في طازجة معزولة (3-4PAR-0 ح) وفي الأنسجة المستزرعة ح 48 (ح 3/4PAR-48) (الشكل 1). وقد تناقص مستويات التعبير Bmp4 فقط بعد 48 ساعة ثقافة.
وأضيفت إلى المتوسطة الثقافة الدوائية مثبطات لتقييم دور الشق وسمو إشارات المسارات في المراحل المبكرة من الغدة الصعترية والتنمية جارات الدرق، أثناء التطوير في المختبر . ويرد وصف جرعات مثبطات في فيغيريدو et al. 5 مستويات تعبير الجينات الثلاثة تم تحليلها كانت إلى حد كبير في 3/4PAR نمت حضور الشق المانع، عند مقارنتها بظروف التحكم (بدون المخدرات) (الشكل 1). وفي المقابل، حظر Bmp4 فقط النصوص كانت إلى حد كبير في الأنسجة المستزرعة ح 48 عندما كان يشير إلى نيافة (الشكل 1E).
للدراسة في المراحل المتأخرة من الغدة الصعترية، والغدة الدرقية أورجانوجينيسيس، ثم الأنسجة المستزرعة المطعمة على الحدب والسماح بمواصلة تطوير لمدة 10 أيام (راجع التصميم التجريبي في الشكل 2 ألف).
الشكل 2 . الحصول على نتائج الممثل مع في ovo التحليل: التحليل المورفولوجي ترقيع نمت لمدة 10 أيام في غشاء تشوريوالانتويك. التمثيل التخطيطي من 48 مثقف ح الاسمية المطعمة على كام وتطويرها لمدة 10 أيام (A). المسلسل أجزاء الشرائح explants المستمدة من كام (ب–أنا) ملطخة H & E (ب، ج، و، وز)، إيمونوديتيكتيد مع قكبن (دال و هاء) والمضادة عموم كورونا تشيكية (ح و أنا) الأجسام المضادة، وكونتيرستينيد مع توضع لجيل. رؤساء السهم الأسود يشير إلى إيمونوستينينج قوية قكبن (E) و "عموم كورونا تشيكية" (أنا). مقطع عرضية من الغدة الصعترية تشيميريك مع الخلايا اللمفاوية المضيف الأصلي والمستمدة من السمان الخلايا الظهارية الغدة الصعترية مع إشارات قوية قكبن+ (رؤوس سوداء) (ه). إشارات "قوية عموم كورونا"+ (رؤوس سوداء) في ابيثيليا الغدة الصعترية والغدد الدرقية (أنا). وجمعت الصور باستخدام برامج التصوير ومجهر مع كاميرا (انظر الجدول للمواد). كاليفورنيا، والغضروف؛ كام، غشاء تشوريوالانتويك؛ برنامج التحصين الموسع، وظهاره؛ PAR، منطقة القوس البلعوم؛ حزب العمال، الغدد الدرقية؛ سوم، العضلات الملساء؛ د 10 من عشرة أيام. تغيير حجم أشرطة، 50 ميكرومتر (ب، د، و، وح) و 100 ميكرومتر (ج، ه، ز، و أنا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تم إجراء تحليل المورفولوجية الأجهزة النامية على explants المستمدة من كام بالانسجة التقليدية وإيمونوهيستوتشيميستري (الشكل 2B–أنا)، كما هو موضح سابقا5. وأظهرت explants المستمدة من كام الغدة الصعترية تشيميريك شكلت بالكامل (الشكل 2B–ه) مع المستمدة من السمان (قكبن+) الغدة الصعترية ظهارة استعمر الخلايا اللمفاوية السلف المانحة المنشأ (دجاج) (2D الأرقام، هاء). مسلسل أبواب اكسبلانتس المستمدة من كام عن معالجة إيمونوسيتوتشيميستري مع عموم المضادة جسم سيتوكيراتين (المضادة عموم كورونا تشيكية) (علامة خلايا الظهارية)، أظهرت epithelia الغدة الصعترية وجارات الدرق مع الخصائص المورفولوجية العادي (الشكل 2 ح ، وأنا). عرض الخلايا الظهارية الغدة الصعترية هيكل شبكي بينما الخلايا متني جارات الدرق كروي، مرتبة في مجموعات ومطوقة بالعديد من الشعيرات الدموية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة الهياكل الأخرى المستمدة من الاسمية من الجهاز التنفسي في الطعوم. ظهارة تنفسية، الغضاريف والعضلات الملساء المرتبطة بالغشاء المخاطي تتميز بسهولة في الشكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أحد جوانب حاسمة لنجاح هذا الأسلوب هو نوعية كل من الدجاج والسمان البيض. النظر في فترات حضانة طويلة، لا سيما أثناء الفحص في ovo ، ذات نوعية جيدة من بيض الدجاج يحسن معدلات البقاء (تصل إلى 90 في المائة) في نهاية الإجراء. ولتحقيق ذلك، اختبار البيض من مختلف الموردين. احتضان البيض unmanipulated لفترات طويلة (تصل إلى 16-17 يوما) وتحقق تنميتها. ينبغي أن يقدم أكثر من 80% الأجنة التي سينظر فيها دفعة جيدة نوعية، التطور الطبيعي. من المهم أيضا لضمان أن توفر كل خطوة الاحتضان استنساخه بمراحل التطوير المتزامن لضمان موثوقية والنتائج تمثيلاً حقيقيا في النهاية. سبب المسامية شل البيض، الحفاظ على جو هوميديفيد في الحاضنة لجميع الخطوات حضانة البيض. لتجنب التلوث البيئي، يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى حلول برنامج تلفزيوني في الإجراء (خطوة اختيارية).
ويبدأ هذا الأسلوب بعزل ترافع الجهاز السمان وتزايد عليها في نظام أورجانوتيبيك ح 48. هذه الخطوة الأولى، استخدمت بالفعل لدراسة الغدة الصعترية وجارات الدرق المبكر والتنمية5، يمكن تطبيقها أيضا على الأجهزة الأخرى إذا روعيت القيود المقايسة. وينصح explants الصغيرة من أساسيات الجهاز (أقل من 3 ملم) وفترات قصيرة من الأنابيب في الحضانة (ما يصل إلى 48 ساعة) لمنع نشر المواد الغذائية غير فعالة وتجفيف الأنسجة، الذي يحدث عادة عندما تصل اكسبلانتس إلى أبعاد أكبر.
يسمح هذا الأسلوب أيضا تحوير مسارات الإشارات، الذي يتجاوز التحوير الوراثي معقدة باستخدام الكواشف القابلة للذوبان، مثل مثبطات الدوائية5،7. لتنفيذ هذا الإجراء، ينبغي اختبار زيادة جرعة من المخدرات تحديد الظروف الفسيولوجية/سمية الثقافة. ويمكن قياس الإجراءات المثبطة بتحليل التعبير الجيني مما يشير إلى المسار الهدف-الجينات.
في الخطوة اثنين من هذا الإجراء، يتم المطعمة الأنسجة المستزرعة على كام للدراسة في المراحل المتأخرة من تكوين الجهاز. استخدمت مقايسة كام في سياقات أخرى من أورجانوجينيسيس مثل تطوير الهيكل العظمى وتشكيل ريشة تطعيم مباشرة من أساسيات الجهاز على كام9،،من1011. بالإضافة إلى ذلك، engraftment كام طبق بنجاح أيضا في الفئران إلى الدجاج تكثيفها لدراسة الخصيتين نضوج19. على الرغم من أن التحليل كام أداة قوية لبحث دراسة المراحل المتأخرة من تكوين الجهاز، من المهم أن يكون على بينه من حدودها. إحدى الخطوات الأكثر أهمية للبروتوكول هو إعداد كام للتطعيم. من المهم أن تستهدف فقط سفن أصغر حجماً لآفات الأوعية الدموية. ومع ذلك، إلا إذا كان عدد قليل من تلك التي ليسيونيد، استجابة الأوعية اللاحقة قد لا كافية للنهوض بغزو الأنسجة المطعمة بالسفن الجديدة التي تنشأ من كام. ونتيجة لذلك، لن يكون زرع الأنسجة لما يكفي من المواد الغذائية أو تبادل الغاز الحفاظ على النمو. من ناحية أخرى، إذا كان هو المساس بسلامة السفن الكبيرة عند إعداد منطقة الجرحى، قد الجنين ليتم إهمالها.
قيداً هاما للتنمية في ovo باستخدام كام هو التشريد التشريحية الأجهزة المشكلة، بسبب القيد ثلاثي الأبعاد لزراعة اكسبلانتس. غالباً ما يؤدي هذا في فصل غير كامل الغدة الصعترية والغدد الدرقية (الشكل 2 واو–أنا)، وفي تجزئة الغدة الصعترية غير كافية، مع الحد العدد المعتاد من الأجهزة شكلت5.
قد يكون قيداً آخر للنظام كام وصول دون المستوى أمثل من الكواشف الدوائية5، حتى مع إدارة المخدرات يوميا، مما يحد من تحليل explant أواخر مرحلة التنمية. على سبيل مثال، أظهرت الدراسات السابقة أن سيكلوباميني بنجاح تحول دون سمو إشارات في ovo، بينما الشق إشارات المانع، Ly411575، وأظهر لا خصائص المثبطة في ovo5.
تتجاوز هذه القيود، يوفر هذا الأسلوب أهمية النهج التجريبي للتحقيق ومتأخرة-المراحل المبكرة من تكوين الجهاز باستخدام نموذج إنفلونزا الطيور. وباﻹضافة إلى ذلك،، يمكن التلاعب بها تطوير الأنسجة وتحصد في أي إطار زمني للتنمية في المختبر و في ovo مما يجعل الطريقة مناسبة أيضا للدراسات الطولية في أورجانوجينيسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون لانطونيو نظراً وايزابيل الكوبايا باريرا ليونور لقراءة نقدية من المخطوطة، أن بادما أكابيدي للفيديو والسرد، والقيام Proa فيتور من "دائرة علم الأنسجة" ه هيستولوجيا دي معهد بيولوجيا التنمية، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة، لتقديم الدعم التقني. ونحن مدينون لا سيما كايرو باولو و "هوجو سيلفا" من مقاتلي دي أوديوفيسوايس (الوحدة السمعية البصرية)، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي يسبوا على التزامهم المعلقة بإنتاج هذا الفيديو. ونعترف Microsystems إيكا يرجى توفير ستيريوسكوبي مزودة بنظام الفيديو وإلى إينتيرافيس--شركة زراعية-سنة, S.A للمساهمة مع السمان يخصب البيض. هذا العمل كان يدعمه دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة (فمول).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
