To-trinns tilnærming til utforske tidlig og sent-etappene Organ-formasjonen i Avian modellen: Thymus og Parathyroid Glands organogenesen paradigme
Summary
Denne artikkelen inneholder en oppdatert tilnærming til klassisk vaktel-kylling chimera systemet å studere orgel formasjon, ved å kombinere romanen i vitro og ovo eksperimentelle prosedyrer.
Abstract
Avian embryoet, er som en eksperimentell modell, av største betydning for banebrytende funn i utviklingsbiologi. Flere tilnærminger, dannelsen av vaktel-kylling chimeras og bruk av chorioallantoic membranen (CAM) for å opprettholde utviklingen av ektopisk vev går tilbake til forrige århundre. I dag, tilbyr kombinasjonen av disse klassiske teknikker med siste i vitro metoder romanen utsiktene videre utforsking orgel formasjon.
Her beskriver vi en to-trinns tilnærming for å studere tidlig og sent-etappene av organogenesen. Kort, embryonale regionen presumptive territorium av orgelet er isolert fra vaktel embryoer og dyrket i vitro i et organotypic system (opp til 48 h). Kultivert vev er senere podet på CAM på en kylling fosteret. Etter 10 dager i ovo utvikling, er fullt dannet organer Hentet fra podet vev. Denne metoden tillater også modulering av signalnettverk trasé av vanlige administrasjonen av farmakologiske agenter og vev genetisk manipulasjon gjennom i vitro og ovo utviklingsmessige trinnene. I tillegg kan utvikler vev samles på noen gang-vinduet til å analysere sine genuttrykk profil (med kvantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) og morfologi (vurdert med konvensjonelle histologi og immunochemistry).
Beskrevet eksperimentelle prosedyren kan brukes som et verktøy for å følge orgel formasjon utenfor avian embryoet, fra tidlige stadier av organogenesen til fullt dannet og funksjonelle organer.
Introduction
Avian embryoer har vært mye brukt i banebrytende utviklingsbiologi studier. De viktigste fordelene med avian modellen inkluderer muligheten til å åpne egg, relativt lett tilgang til fosteret, og utføre micromanipulation. Eksempler omfatter klassiske vaktel-kylling chimera systemet for å studere celle skjebne1, bruk av bestemte vekstfaktorer til fosteret2, og veksten av ektopisk cellulære strukturer på CAM1,3, 4.
For å få ny innsikt i forskjellige stadier av orgel formasjon, har vi nylig utviklet en metode som kombinerer pode teknikker med i vitro manipulering av embryonale vev5. To-trinns tilnærming aktiverer diskriminering og utforskning av både tidlig – og sen-stadier av organogenesen, som ofte er begrenset på grunn av svært dynamisk og komplekse vev interaksjoner2. Videre mangel på passende vev-spesifikke indikatorer ofte begrenser bruken av genmodifiserte dyr modeller6. Denne romanen metoden i two-step tilnærming seirer stort sett slike begrensninger.
For å studere tidlige stadier av orgel formasjon, i det første trinnet, er vaktel embryonale territoriet bestående av potensielle organ rudiment isolert og dyrket i et i vitro organotypic system for 48 timer. I denne perioden kan farmakologiske modulering av bestemte signalveier utføres ved å legge til narkotika kultur medium5,7. I tillegg kulturperler vev kan samles inn av i vitro vekst og analysert for genuttrykk (med metoder som qPCR, microarrays, osv.).
I det andre trinnet, 48 h-kulturperler vev er deretter podet på CAM på en kylling (c) fosteret på embryonale dag (E) 8 (cE8) (Hamburger og Hamilton (HH)-stadier 33-35)8. CAM fungerer vaskulær leverandør av næringsstoffer og lar gass utveksling1,3,4 podet vev aktivere sin utvikling i ovo for lengre perioder. Dette eksperimentelle trinnet er spesielt godt egnet for å studere slutten stadier av organogenesen, som fullt dannet organer kan oppnås etter 10 dager i ovo utvikling5,9,10,11 . Morfologisk analyse utføres enkelt av konvensjonelle histology å bekrefte riktig orgel dannelse og donor opprinnelsen til cellene kan identifiseres av immunhistokjemi ved hjelp av artsspesifikke antistoffer (i.e.MAb vaktel PeriNuclear (QCPN)). Under inkubasjonstid CAM kan grafts også vokst i nærvær av farmakologiske agenter og samlet inn av utviklingen å evaluere utviklingen av organogenesen.
To-trinns tilnærming, beskrevet her i dybden, har allerede vært ansatt i Figueiredo et al. 5 å utforske avian parathyroid/thymus primordium utbygging. Følgelig vil iboende særegenheter på embryonale territorier og stadier av utviklingen i organogenesen av thymus og parathyroid glands bli presentert nedenfor.
Thymus og parathyroid glands epithelia, avledet men funksjonelt tydelig, fra endoderm av pharyngeal poser (PP)12. I avian, epithelia av disse organene kommer fra den tredje og fjerde PP endoderm (3/4PP)12, mens i pattedyr thymic epitel stammer fra 3PP og epitel i parathyroid glands stammer fra 3PP og 3/4PP musen og menneskelige, henholdsvis13,14.
En av de tidligste stadiene i dannelsen av disse organene er diskret thymus og parathyroid domener i den vanlige primordium. I kylling, kan disse domenene identifiseres ved i situ hybridisering, med bestemte molekylære markører, E4.515. Som utviklingen fortsetter, disse orgel barnelærdom individualisere og separat fra pharynx, mens en tynn mesenchymal kapsel, dannet av neural crest-avledet celler, omgir dem (på E5; HH-stage 27). Senere er thymic epitel kolonisert av blodkreft stamfar celler (på E6.5; HH-stage 30)12.
Som vaktel-kylling Realencyclopädie1,12er i two-step tilnærming spesielt nyttig å studere dannelsen av blodkreft/lymfoide organer, nemlig thymus5. Som vaktel explant, med orgel-rudiment er podet i kylling embryo før blodkreft stamfar celle kolonisering, dannes en chimeric thymus med kylling blodbårne progenitor celler infiltrere vaktel thymic epitel motpart. Denne metoden er derfor en nyttig verktøyet å utforske bidrag av blodkreft cellene i utviklingen av avian hemato/lymfoide systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et viktig aspekt for suksessen til denne metoden er kvaliteten på både kylling og vaktel egg. Vurderer de lange inkubasjonstiden periodene, spesielt i ovo analysen, en god kvalitet av kylling egg forbedrer priser levedyktighet (opptil 90%) ved slutten av prosedyren. For å oppnå dette, kan du teste egg fra forskjellige leverandører. Ruge unmanipulated egg i lange perioder (opptil 16-17 dager) og sjekk deres utvikling. Skal regnes som en god batch, bør mer enn 80% av embryoene presentere normal utvikling. De…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlig António Cidadão, Isabel Alcobia og Leonor Parreira for kritisk lesing av manuskriptet, til Padma Akkapeddi for video fortellerstemme, og Vitor Proa fra tjenesten Histology Instituto de Histologia e Biologia gjøremål Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, kundestøtte. Vi er spesielt gjeld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (audiovisuelle enhet), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres enestående engasjement for produksjon av denne videoen. Vi erkjenner Leica Microsystems for vennlig å gi en stereoscope utstyrt med video-system og Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, sa for å bidra med vaktelegg befruktede egg. Dette arbeidet ble støttet av Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
