Summary

To-trinns tilnærming til utforske tidlig og sent-etappene Organ-formasjonen i Avian modellen: Thymus og Parathyroid Glands organogenesen paradigme

Published: June 17, 2018
doi:

Summary

Denne artikkelen inneholder en oppdatert tilnærming til klassisk vaktel-kylling chimera systemet å studere orgel formasjon, ved å kombinere romanen i vitro og ovo eksperimentelle prosedyrer.

Abstract

Avian embryoet, er som en eksperimentell modell, av største betydning for banebrytende funn i utviklingsbiologi. Flere tilnærminger, dannelsen av vaktel-kylling chimeras og bruk av chorioallantoic membranen (CAM) for å opprettholde utviklingen av ektopisk vev går tilbake til forrige århundre. I dag, tilbyr kombinasjonen av disse klassiske teknikker med siste i vitro metoder romanen utsiktene videre utforsking orgel formasjon.

Her beskriver vi en to-trinns tilnærming for å studere tidlig og sent-etappene av organogenesen. Kort, embryonale regionen presumptive territorium av orgelet er isolert fra vaktel embryoer og dyrket i vitro i et organotypic system (opp til 48 h). Kultivert vev er senere podet på CAM på en kylling fosteret. Etter 10 dager i ovo utvikling, er fullt dannet organer Hentet fra podet vev. Denne metoden tillater også modulering av signalnettverk trasé av vanlige administrasjonen av farmakologiske agenter og vev genetisk manipulasjon gjennom i vitro og ovo utviklingsmessige trinnene. I tillegg kan utvikler vev samles på noen gang-vinduet til å analysere sine genuttrykk profil (med kvantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) og morfologi (vurdert med konvensjonelle histologi og immunochemistry).

Beskrevet eksperimentelle prosedyren kan brukes som et verktøy for å følge orgel formasjon utenfor avian embryoet, fra tidlige stadier av organogenesen til fullt dannet og funksjonelle organer.

Introduction

Avian embryoer har vært mye brukt i banebrytende utviklingsbiologi studier. De viktigste fordelene med avian modellen inkluderer muligheten til å åpne egg, relativt lett tilgang til fosteret, og utføre micromanipulation. Eksempler omfatter klassiske vaktel-kylling chimera systemet for å studere celle skjebne1, bruk av bestemte vekstfaktorer til fosteret2, og veksten av ektopisk cellulære strukturer på CAM1,3, 4.

For å få ny innsikt i forskjellige stadier av orgel formasjon, har vi nylig utviklet en metode som kombinerer pode teknikker med i vitro manipulering av embryonale vev5. To-trinns tilnærming aktiverer diskriminering og utforskning av både tidlig – og sen-stadier av organogenesen, som ofte er begrenset på grunn av svært dynamisk og komplekse vev interaksjoner2. Videre mangel på passende vev-spesifikke indikatorer ofte begrenser bruken av genmodifiserte dyr modeller6. Denne romanen metoden i two-step tilnærming seirer stort sett slike begrensninger.

For å studere tidlige stadier av orgel formasjon, i det første trinnet, er vaktel embryonale territoriet bestående av potensielle organ rudiment isolert og dyrket i et i vitro organotypic system for 48 timer. I denne perioden kan farmakologiske modulering av bestemte signalveier utføres ved å legge til narkotika kultur medium5,7. I tillegg kulturperler vev kan samles inn av i vitro vekst og analysert for genuttrykk (med metoder som qPCR, microarrays, osv.).

I det andre trinnet, 48 h-kulturperler vev er deretter podet på CAM på en kylling (c) fosteret på embryonale dag (E) 8 (cE8) (Hamburger og Hamilton (HH)-stadier 33-35)8. CAM fungerer vaskulær leverandør av næringsstoffer og lar gass utveksling1,3,4 podet vev aktivere sin utvikling i ovo for lengre perioder. Dette eksperimentelle trinnet er spesielt godt egnet for å studere slutten stadier av organogenesen, som fullt dannet organer kan oppnås etter 10 dager i ovo utvikling5,9,10,11 . Morfologisk analyse utføres enkelt av konvensjonelle histology å bekrefte riktig orgel dannelse og donor opprinnelsen til cellene kan identifiseres av immunhistokjemi ved hjelp av artsspesifikke antistoffer (i.e.MAb vaktel PeriNuclear (QCPN)). Under inkubasjonstid CAM kan grafts også vokst i nærvær av farmakologiske agenter og samlet inn av utviklingen å evaluere utviklingen av organogenesen.

To-trinns tilnærming, beskrevet her i dybden, har allerede vært ansatt i Figueiredo et al. 5 å utforske avian parathyroid/thymus primordium utbygging. Følgelig vil iboende særegenheter på embryonale territorier og stadier av utviklingen i organogenesen av thymus og parathyroid glands bli presentert nedenfor.

Thymus og parathyroid glands epithelia, avledet men funksjonelt tydelig, fra endoderm av pharyngeal poser (PP)12. I avian, epithelia av disse organene kommer fra den tredje og fjerde PP endoderm (3/4PP)12, mens i pattedyr thymic epitel stammer fra 3PP og epitel i parathyroid glands stammer fra 3PP og 3/4PP musen og menneskelige, henholdsvis13,14.

En av de tidligste stadiene i dannelsen av disse organene er diskret thymus og parathyroid domener i den vanlige primordium. I kylling, kan disse domenene identifiseres ved i situ hybridisering, med bestemte molekylære markører, E4.515. Som utviklingen fortsetter, disse orgel barnelærdom individualisere og separat fra pharynx, mens en tynn mesenchymal kapsel, dannet av neural crest-avledet celler, omgir dem (på E5; HH-stage 27). Senere er thymic epitel kolonisert av blodkreft stamfar celler (på E6.5; HH-stage 30)12.

Som vaktel-kylling Realencyclopädie1,12er i two-step tilnærming spesielt nyttig å studere dannelsen av blodkreft/lymfoide organer, nemlig thymus5. Som vaktel explant, med orgel-rudiment er podet i kylling embryo før blodkreft stamfar celle kolonisering, dannes en chimeric thymus med kylling blodbårne progenitor celler infiltrere vaktel thymic epitel motpart. Denne metoden er derfor en nyttig verktøyet å utforske bidrag av blodkreft cellene i utviklingen av avian hemato/lymfoide systemet.

Protocol

Alle disse eksperimentene følger dyr omsorg og etiske retningslinjer på Centro Académico de Medicina de Lisboa. 1. inkubering av befruktet vaktel og kylling egg Inkuber japanske vaktel (Coturnix coturnix japonica) og kylling (Gallus gallus) befruktet egg i 3 og 8 dager, respectively. Legg eggene med i luftkammer (egg sløv slutten) vender i en fuktet inkubator på 38 ° C. Bruke rundt 20 vaktelegg og 40 kylling egg til å utføre dette eksperim…

Representative Results

Ovenfor beskrevet protokollen detaljer en metode som gjør etterforskningen av både tidlig – og sen-stadier av organogenesen, ofte begrenset av komplekse cellulære og molekylære interaksjoner. Denne metoden var tidligere ansatt i Figueiredo et al. 5 å rakne rollen hakk og Hh signalering i avian parathyroid/thymus primordium utbygging. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="…

Discussion

Et viktig aspekt for suksessen til denne metoden er kvaliteten på både kylling og vaktel egg. Vurderer de lange inkubasjonstiden periodene, spesielt i ovo analysen, en god kvalitet av kylling egg forbedrer priser levedyktighet (opptil 90%) ved slutten av prosedyren. For å oppnå dette, kan du teste egg fra forskjellige leverandører. Ruge unmanipulated egg i lange perioder (opptil 16-17 dager) og sjekk deres utvikling. Skal regnes som en god batch, bør mer enn 80% av embryoene presentere normal utvikling. De…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlig António Cidadão, Isabel Alcobia og Leonor Parreira for kritisk lesing av manuskriptet, til Padma Akkapeddi for video fortellerstemme, og Vitor Proa fra tjenesten Histology Instituto de Histologia e Biologia gjøremål Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, kundestøtte. Vi er spesielt gjeld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (audiovisuelle enhet), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres enestående engasjement for produksjon av denne videoen. Vi erkjenner Leica Microsystems for vennlig å gi en stereoscope utstyrt med video-system og Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, sa for å bidra med vaktelegg befruktede egg. Dette arbeidet ble støttet av Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Materials

Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Polycarbonate Membrane Insert  Corning 3412 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert 
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
6-well culture plates Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
Pyrex bowls from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette normax 5426015
Whatman qualitative filter paper Sigma-Aldrich WHA1001090 Filter paper
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Cyclopamine hydrate Sigma-Aldrich C4116 Pharmacological inhibitor of Hh signalling
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Stemolecule LY411575 Stemgent 04-0054 Pharmacological inhibitor of Notch signalling
TRIzol Reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15596026 Reagent for total RNA isolation
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 Microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80
Microscope Leica Microsystems  DM2500

References

  1. Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
  3. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
  4. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  5. Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
  6. National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
  7. Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
  10. Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
  11. Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
  12. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
  13. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
  14. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
  15. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
  16. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
  17. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
  18. Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
  19. Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).

Play Video

Cite This Article
Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).

View Video