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Developmental Biology

दो कदम दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए जल्दी और देर से एवियन मॉडल में अंग निर्माण के चरणों: थाइमस और Parathyroid ग्रंथियों Organogenesis प्रतिमान

doi: 10.3791/57114 Published: June 17, 2018

Summary

इस लेख शास्त्रीय बटेर के लिए एक अद्यतन दृष्टिकोण-चिकन कल्पना प्रणाली के लिए अंग निर्माण का अध्ययन प्रदान करता है, इन विट्रो में उपंयास के संयोजन और ovo प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में

Abstract

एवियन भ्रूण, एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में, विकास जीव विज्ञान में लाभदायक खोजों के लिए अत्यंत महत्व का किया गया है । कई तरीकों के अलावा, बटेर के गठन-चिकन chimeras और chorioallantoic झिल्ली का उपयोग (सांचा) अस्थानिक ऊतकों के विकास को बनाए रखने के लिए पिछली सदी के लिए वापस तिथि । आजकल, इन विट्रो के तरीके में हाल के साथ इन शास्त्रीय तकनीकों का संयोजन उपंयास की संभावनाओं को आगे अंग गठन का पता लगाने प्रदान करता है ।

यहां हम एक दो कदम दृष्टिकोण का वर्णन जल्दी अध्ययन और देर से organogenesis के चरणों । संक्षेप में, भ्रूण शरीर के प्रकल्पित क्षेत्र युक्त क्षेत्र बटेर भ्रूण से अलग है और एक organotypic प्रणाली में इन विट्रो में उगाया जाता है (४८ ज तक) । संस्कृति के ऊतकों को बाद में एक चिकन भ्रूण के सांचा पर भ्रष्टाचार कर रहे हैं । ovo विकास के 10 दिनों के बाद, पूरी तरह से गठित अंगों भ्रष्टाचारी ऊतकों से प्राप्त कर रहे हैं । इस विधि भी औषधीय एजेंटों और ऊतक आनुवंशिक में हेरफेर के नियमित प्रशासन द्वारा मार्ग संकेत की अनुमति देता है इन विट्रो में भर में और ovo विकासात्मक चरणों में । इसके अतिरिक्त, ऊतकों के विकास के किसी भी समय-खिड़की पर एकत्र किया जा सकता है उनके जीन-अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का विश्लेषण (मात्रात्मक पीसीआर (qPCR), microarrays, आदि) और आकृति विज्ञान (पारंपरिक प्रोटोकॉल और immunochemistry के साथ मूल्यांकन का उपयोग करके) ।

वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एवियन भ्रूण के बाहर अंग गठन का पालन करें, organogenesis के प्रारंभिक दौर से पूरी तरह से गठन और कार्यात्मक अंगों के लिए ।

Introduction

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एवियन भ्रूण गया है व्यापक रूप से लाभदायक विकास जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया । एवियन मॉडल का मुख्य लाभ संभावना अंडा, भ्रूण के लिए अपेक्षाकृत आसान पहुंच, और micromanipulation प्रदर्शन करने की क्षमता को खोलने के लिए शामिल हैं । कुछ उदाहरण सेल भाग्य1, भ्रूण2के लिए विशिष्ट विकास कारकों के आवेदन, और1,3में अस्थानिक सेलुलर संरचनाओं के विकास के अध्ययन के लिए क्लासिक बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली शामिल 4.

अंग गठन के विभिन्न चरणों में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने हाल ही में एक विधि विकसित की है जो इन विट्रो में भ्रूण के ऊतकों में हेरफेर के साथ तकनीक को जोड़ती है5. दो कदम दृष्टिकोण भेदभाव और organogenesis, जो अक्सर अत्यधिक गतिशील और जटिल ऊतक बातचीत2के कारण सीमित कर रहे है के दोनों जल्दी और देर से चरणों की खोज में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, उपयुक्त ऊतक की कमी-विशिष्ट मार्करों अक्सर आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल के उपयोग की सीमा6. दो कदम दृष्टिकोण की यह उपन्यास विधि मुख्यतः ऐसी सीमाओं पर काबू पाती है.

पहले चरण में, अंग गठन के प्रारंभिक चरणों का अध्ययन करने के लिए, बटेर भ्रूण भावी अंग रुडी शामिल क्षेत्र अलग है और एक इन विट्रो organotypic प्रणाली में हो ४८ ज के लिए । इस अवधि के दौरान, विशिष्ट संकेतन रास्ते के औषधीय मॉडुलन संस्कृति मध्यम5,7के लिए दवाओं को जोड़कर किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, प्रसंस्कृत ऊतकों के किसी भी चरण में एकत्र किया जा सकता है इन विट्रो विकास और जीन के लिए जांच-अभिव्यक्ति (जैसे तरीकों का उपयोग कर qPCR, microarrays, आदि) ।

दूसरे चरण में, ४८ ज-संस्कृति वाले ऊतकों तो एक चिकन (सी) भ्रूण भ्रूण दिवस (ई) 8 (cE8) (हैमबर्गर और हैमिल्टन (एच. टी.) के कैम पर भ्रष्टाचार कर रहे है-33-35 चरणों)8। कैम पोषक तत्वों की एक संवहनी आपूर्तिकर्ता के रूप में व्यवहार करता है और गैस एक्सचेंजों1,3,4 के लिए ovo में समय की लंबी अवधि के लिए अपने विकास को सक्षम करने की अनुमति देता है । इस प्रायोगिक कदम विशेष रूप से अच्छी तरह से organogenesis के देर चरणों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, के रूप में पूरी तरह से गठन अंगों ovo विकास में 10 दिनों के बाद प्राप्त किया जा सकता है5,9,10,11 . रूपात्मक विश्लेषण आसानी से पारंपरिक प्रोटोकॉल द्वारा किया जाता है उचित अंग गठन और कोशिकाओं के दाता मूल की पुष्टि करने के लिए प्रजातियों का उपयोग कर immunohistochemistry द्वारा पहचाना जा सकता है विशिष्ट एंटीबॉडी (यानी, मॉब बटेर PeriNuclear (QCPN)) । कैम मशीन अवधि के दौरान, भ्रष्टाचार भी औषधीय एजेंटों की उपस्थिति में उगाया जा सकता है और विकास के किसी भी स्तर पर एकत्र करने के लिए organogenesis की प्रगति का मूल्यांकन ।

दो कदम दृष्टिकोण, गहराई में यहां वर्णित है, पहले से ही Figueiredo एट अल में कार्यरत किया गया है । 5 एवियन parathyroid/थाइमस आम primordium विकास का पता लगाने के लिए । तदनुसार, भ्रूण प्रदेशों और थाइमस और parathyroid ग्रंथियों के organogenesis में शामिल विकास के चरणों के निहित विशेषताओं के नीचे प्रस्तुत किया जाएगा ।

थाइमस और parathyroid ग्रंथियों epithelia, हालांकि कार्यात्मक अलग, ग्रसनी पाउच (पीपी)12के अन्तः से निकला । एवियन में, इन अंगों के epithelia तीसरे और चौथे पीपी अन्तः (3/4PP)12से शुरू होता है, जबकि स्तनधारियों में thymic उपकला 3PP से निकला और parathyroid ग्रंथियों की उपकला 3PP से निकला और माउस और मानव में 3/4PP, क्रमशः१३,१४.

इन अंगों के गठन में प्रारंभिक चरणों में से एक आम primordium में असतत थाइमस और parathyroid डोमेन के उद्भव है । चिकन में, इन डोमेन द्वारा की पहचान की जा सकती है सीटू संकरण में , विशिष्ट आणविक मार्करों के साथ, ई में 4.515. विकास आय के रूप में, इन अंगों individualize और ग्रसनी से अलग है, जबकि एक पतली mesenchymal कैप्सूल, तंत्रिका शिखा व्युत्पंन कोशिकाओं द्वारा गठित, उन चारों ओर से घेरे (E5 पर; एचएच-स्टेज 27) । बाद में, thymic उपकला टेम जनक कोशिकाओं द्वारा बृहदांत्र है (ई 6.5 पर; एचएच-स्टेज 30)12.

के रूप में शास्त्रीय बटेर-चिकन1,12अध्ययन, दो कदम दृष्टिकोण विशेष रूप से टेम/लसीकावत् अंगों, अर्थात् थाइमस5के गठन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है । अंग रुडी के साथ बटेर explant के रूप में, टेम जनक सेल औपनिवेशीकरण से पहले चिकन भ्रूण में भ्रष्टाचार, एक chimeric थाइमस चिकन रक्त जनित जनक उपकला समकक्ष thymic एक बटेर घुसपैठ कोशिकाओं के साथ गठन किया है । इस विधि है, इसलिए, एक उपयोगी उपकरण एवियन hemato/लसीकावत् प्रणाली के विकास में टेम कोशिकाओं के योगदान का पता लगाने के लिए ।

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Protocol

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इन सभी प्रयोगों Centro Académico de Medicina de Lisboa के पशु देखभाल और नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करें ।

1. निषेचित बटेर और चिकन अंडे की मशीन

  1. जापानी बटेर (Coturnix Coturnix बिही) और चिकन (गैलस गैलस) की मशीन, क्रमशः 3 और 8 दिनों के लिए अंडे निषेचित ।
    1. एयर चैंबर के साथ अंडे प्लेस (अंडा कुंद अंत) ३८ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में सामना करना पड़ रहा ।
    2. इस प्रयोग को करने के लिए लगभग 20 बटेर अंडे और ४० चिकन अंडे का प्रयोग करें ।
      नोट: पहली बार इस कार्यविधि को स्थापित करते समय इन संख्याओं को दुगुना किया जाना चाहिए ।

2. Thymic और Parathyroid के प्रकल्पित क्षेत्र युक्त बटेर भ्रूण क्षेत्र का अलगाव

नोट: एक क्षैतिज लामिना प्रवाह हूड और निष्फल उपकरणों और सामग्री का उपयोग कर बाँझ स्थितियों में अंडा हेरफेर प्रक्रियाओं प्रदर्शन.

  1. एक बड़े borosilicate ग्लास बाउल के बारे में 3/4 ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) समाधान के साथ भरा तैयार करें ।
  2. खोल दोहन और घुमावदार कैंची के साथ अपने कुंद अंत के विपरीत पक्ष पर एक परिपत्र खोलने के काटने से गर्मी के 3 दिनों के बाद एक बटेर अंडे खोलो । ध्यान से गोले के टुकड़ों को हटा दें और ठंडे पंजाबियों से भरे कांच के कटोरे में भ्रूण को ट्रांसफर करें ।
  3. E3 (qE3) पर बटेर (q) भ्रूण पकड़ो (एच. डी. के लिए इसी बटेर चरण चिकन के 21 मंच) पतली संदंश की मदद से । घुमावदार कैंची का उपयोग कर जर्दी को ढंक कर vitelline झिल्ली में एक कट बनाओ । अतिरिक्त भ्रूण वाहिकाओं की परिधि के लिए चारों ओर और बाह्य में कटौती करने के लिए जारी रखें ।
  4. पतली संदंश की मदद से ठंडे पंजाबियों से भरे 3/4 के बारे में एक छोटी कटोरी को भ्रूण हस्तांतरण । शेष संलग्न जर्दी से भ्रूण को अच्छी तरह धो लें ।
  5. एक स्किमर का उपयोग करने के लिए एक १०० mm ग्लास पेट्री डिश के लिए काले आधार के साथ भ्रूण हस्तांतरण (देखें सामग्री की मेज) ठंड पंजाबियों के 10 मिलीलीटर युक्त ।
  6. एक stereomicroscope के नीचे पेट्री डिश लगाएं ।
    नोट: इस बिंदु से आगे, प्रगतिशील आवर्धन के लिए एक stereomicroscope के तहत microsurgery प्रक्रियाओं का प्रदर्शन । एक रोशनी स्रोत के रूप में, यह एलईडी stereomicroscope में या ऑप्टिक फाइबर में शामिल रोशनी, सीमित गर्मी लोड पर विचार का उपयोग करने की सलाह दी है ।
  7. पतली कीट पिन के साथ प्लेट के नीचे करने के लिए भ्रूण पकड़ो । जगह चार अतिरिक्त भ्रूण क्षेत्र में एक वर्ग आकार बनाने पिंस ।
  8. cephalic क्षेत्र के अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली पतली संदंश की मदद से निकालें और एक पांचवें पिन वहां जगह है ।
    नोट: यदि भ्रूण सही ढंग से तैनात है, तो भड़काऊ और पुटिका, दिल ट्यूब, और 1st, 2एन डी, और 3rd ग्रसनी मेहराब (प्राधान्य) दिखाई जानी चाहिए ।
  9. काटना के भ्रूण क्षेत्र, यानी, 3rd और 4वें ग्रसनी आर्क क्षेत्र (3/4PAR), Wecker नेत्र कैंची का उपयोग कर ।
    1. longitudinally और भ्रूण धुरी के समानांतर काटने शुरू, somite के बीच/तंत्रिका ट्यूब क्षेत्र और क़दम ।
    2. इसे काटने से ventrally तैनात हार्ट ट्यूब को हटा दें । कैंची को इसी पोजीशन में रखते हुए, पेट्री डिश को काट कर दिशा के अनुसार भ्रूण की जगह पर घुमाएं ।
    3. 2एन डी और 3rd क़दम और 4वें फिलीस्तीनी अथॉरिटी के नीचे के बीच कट ।
    4. शेष झिल्ली को बारीक संदंश की सहायता से 3/4PAR से अलग करें ।
  10. महाप्राण ऊतकों (3/4PAR) और उंहें एक गिलास ठंडे पंजाबियों के साथ एक 2 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर भरा पकवान 3/4 के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: इसके बाद, ऊतकों ४८ ज करने के लिए इन विट्रो में उगाया जा सकता है या तुरंत E8 पर एक चिकन भ्रूण के सांचा पर भ्रष्टाचारी हो ।
  11. ग्लास डिश रखने में अलग 3/4PAR पर इन विट्रो परख की तैयारी के दौरान बर्फ से युक्त रखें ।

3. इन विट्रो Organotypic परख: भ्रूण क्षेत्र की संस्कृति Thymic और Parathyroid के प्रकल्पित क्षेत्र से युक्त

  1. RPMI के साथ संस्कृति माध्यम तैयार-१६४० मध्यम 10% FBS के साथ पूरक और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
    नोट: घुलनशील औषधीय एजेंट मध्यम (उदाहरण के लिए, ४११.५७५ () और di-benzazepine या cyclopamine और vismodegib, पायदान और हेज हॉग (एचएच) संकेत मार्ग, क्रमशः बाधित करने के लिए जोड़ा जा सकता है । इस परख के लिए, benzazepine के 50-200 एनएम का उपयोग करें या Di के 5-15 µ m-3/4PAR में संकेतन पायदान को बाधित करने के लिए µ का उपयोग 20 cyclopamine के मीटर या µ के 10 vismodegib मीटर 3/4PAR5में एचएच सिग्नलिंग को बाधित करने के लिए ।
  2. तैयार इन विट्रो में एक 6-खैर प्लेट में 3/4PP explant की संस्कृति ।
    1. एक अच्छी तरह से 6-संस्कृति मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ थाली से भरें । एक 24 मिमी पाली कार्बोनेट झिल्ली डालें ( सामग्री की तालिकादेखें) पतली संदंश की मदद से अच्छी तरह से पर रखें ।
    2. stereomicroscope के तहत, 3/4PAR explant ग्लास डिश से झिल्ली की सतह के लिए धीरे एक ट्रांसप्लांटेशन चंमच (या रंग) और पतली संदंश की मदद से फिसलने से स्थानांतरण । ventral पक्ष के साथ explants प्लेस और झिल्ली के साथ संपर्क में पृष्ठीय पक्ष । प्रति झिल्ली संमिलित करने के लिए सात explants जोड़ें । ३.४ चरण के लिए आगे बढ़ें ।
  3. वैकल्पिक रूप से, संस्कृति फ्लोटिंग झिल्ली फिल्टर में explants ।
    1. कल्चरल मीडियम के 5 एमएल के साथ ३५ एमएम पेट्री डिश तैयार करें । पतली संदंश की मदद से, एक झिल्ली फिल्टर फ्लोट ( सामग्री की तालिकादेखें) और हवा के साथ संपर्क में एक सूखी सतह रहते हैं ।
    2. stereomicroscope के तहत, 3/4PAR explant ग्लास डिश से झिल्ली फिल्टर करने के लिए एक प्रत्यारोपण चंमच (या रंग) और पतली संदंश की मदद से कोमल फिसलने से स्थानांतरण । ventral पक्ष के साथ explants प्लेस और झिल्ली के साथ संपर्क में पृष्ठीय पक्ष । प्रति झिल्ली फ़िल्टर करने के लिए 8 explants जोड़ें ।
  4. ध्यान से एक humidified मशीन में 5% CO2के साथ ३७ ° c में कदम ३.२ और ३.३ में तैयार explants जगह है ।
  5. एक ४८ एच मशीन अवधि के बाद, 6 अच्छी तरह से थाली और मशीन से ३५ mm पेट्री डिश निकालें ।
    1. 6-वेल प्लेट की झिल्ली डालने से कल्चर्ड explants लीजिए.
      1. जगह तापमान (आरटी) में पंजाबियों जोड़ें झिल्ली डालने के लिए ।
      2. एक 2 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर जोरदार फ्लश द्वारा झिल्ली से explants अलग ।
      3. रंग और पतली संदंश की मदद से, आरटी में पंजाबियों से भरे एक गिलास पकवान 3/4 के लिए संस्कृतिपूर्ण explants हस्तांतरण ।
    2. इसी तरह ३५ एमएम पेट्री डिश में फ्लोटिंग झिल्ली फिल्टर से कल्चरल explants लीजिए ।
      1. एक नया ३५ mm पेट्री आर टी पर पंजाबियों से भरा पकवान के लिए पतली संदंश के साथ झिल्ली फिल्टर स्थानांतरण ।
      2. एक 2 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग जोरदार pipetting द्वारा झिल्ली फिल्टर से explants अलग करें ।
      3. पतले संदंश की मदद से explant-फ्री झिल्ली फिल्टर को डिस्चार्ज करने के बाद इसकी पुष्टि होती है कि कोई explants इससे जुड़ी नहीं रह गई.
      4. एक रंग और पतली संदंश के साथ, आरटी पर पंजाबियों से भरा एक गिलास डिश के लिए explants हस्तांतरण ।
  6. कुल आरएनए अलगाव के लिए एक रिएजेंट की 1 मिलीलीटर के लिए एक रंग के साथ संस्कृतिपूर्ण explants हस्तांतरण और जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए उपयोग करें ।
    सावधानी: इस एजेंट के संपर्क ( सामग्री की तालिकादेखें) एक गंभीर स्वास्थ्य खतरा हो सकता है । उपयुक्त सुरक्षात्मक eyewear, कपड़े पहनते हैं, और दस्ताने । हैंडलिंग निर्देशों का पालन करें और निर्माता द्वारा प्रदान की गई सुरक्षा डेटा पत्रकों को पढ़ें ।
  7. वैकल्पिक रूप से, E8 पर चिकन भ्रूण के कैम पर संस्कृतिपूर्ण ऊतकों भ्रष्टाचार । चरण 4 के लिए का पालन करें ।

4. कैम की तैयारी

  1. मशीन से भ्रूण विकास के 8 दिनों के साथ चिकन अंडे निकालें ।
    नोट: अंडे एक humidified मशीन में ३८ डिग्री सेल्सियस पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ हवा चैंबर के साथ मशीन थे ।
  2. साफ प्लास्टिक टेप के साथ अंडे के कुंद अंत को कवर करने के लिए हवा चैंबर में गिरने से खोल के टुकड़े को रोकने के । शैल नल और घुमावदार कैंची के साथ अंडे में एक परिपत्र खोलने में कटौती । एयर चैंबर दिखाई देना चाहिए ।
  3. सावधानी से निकालें हवा चैंबर की सफेद झिल्ली पतली संदंश के साथ । कैम तो दिखाई और अस्थानिक ऊतक प्रत्यारोपण के लिए सुलभ है ।
    नोट: पंजाब का उपयोग नहीं करने के लिए सांचा हाइड्रेट, पहले या बाद ट्रांसप्लांटेशन, के बाद से पंजाब फिसलने और explants के विस्थापन को बढ़ावा देता है । यदि झिल्ली सूख जाती है, तो अंडा छोड़ें ।

5. कैम पर प्रसंस्कृत Explants के भ्रष्टाचार

  1. एक धारक में एक microscalpel के साथ कैम के छोटे जहाजों में छोटे संवहनी घावों/
    नोट: अतिरिक्त रक्तस्राव के मामले में केशिकाओं द्वारा रक्त निकालने के लिए एक पाश्चर पिपेट की नोक का प्रयोग करें ।
  2. एक रंग और पतली संदंश का प्रयोग करें सांचा के घायल क्षेत्र के लिए कल्चरल explant हस्तांतरण ।
  3. explant से थोड़ा बड़ा एक फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा काटें और इसे explant के शीर्ष पर रखें ।
    नोट: फिल्टर पेपर कैम में इसके विकास के बाद explant स्थान पर नज़र रखने में मदद करता है. इसके अलावा, यह ovo विकास में explant के दौरान दैनिक दवा वितरण की अनुमति देता है, यदि आवश्यक हो तो (५.६ कदम में वर्णित) ।
  4. स्पष्ट प्लास्टिक टेप के साथ अंडा खिड़की सील और यह एक चारकोल पेंसिल का उपयोग कर की पहचान ।
    नोट: प्लास्टिक टेप गर्मी की अवधि के दौरान निर्जलीकरण से भ्रूण की रक्षा करता है ।
  5. ३८ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में 10 दिनों के लिए चालाक अंडा मशीन । चरण 6 के लिए का पालन करें ।
  6. वैकल्पिक कदम: दैनिक दवा प्रशासन की मशीन अवधि के दौरान ।
    1. फिल्टर का उपयोग करने के लिए, आंशिक रूप से प्लास्टिक टेप उठा । दवा समाधान के १०० µ एल जोड़ें, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, कागज के शीर्ष पर । फिर से खिड़की सील और humidified मशीन में अंडे वापस जगह ३८ डिग्री सेल्सियस पर ।
      नोट: इस परख के लिए, cyclopamine के 20 µ मीटर की खुराक ovo विकास5 में के दौरान एचएच संकेतन बाधित होगा ।

6. अस्थानिक में Ovo विकास के 10 दिनों के बाद कैम में अंग गठन

  1. मशीन के 10 दिनों के बाद, मशीन से अंडा निकालें और ध्यान से प्लास्टिक टेप वापस ले लो ।
  2. घुमावदार कैंची का उपयोग कर फिल्टर क्षेत्र के चारों ओर सांचा कट और ठंडे पंजाबियों से भरे 3/4 के बारे में एक छोटे गिलास कटोरे के लिए फिल्टर कागज के साथ कैम-व्युत्पंन explant हस्तांतरण ।
  3. पतली संदंश की मदद से कैम-पंजाब के 10 मिलीलीटर से युक्त काले आधार के साथ एक १०० mm पेट्री डिश के लिए explant व्युत्पंन । धीरे फिल्टर कागज और झिल्ली की अधिक Wecker आँख कैंची और पतली संदंश का उपयोग कर हटा दें ।
  4. कैम-explant समाधान (पंजाब में ३.७% पीएफए) एक स्किम के साथ स्थानांतरण । बड़े कैंची की मदद से भ्रूण की गर्दन क्षेत्र में एक सटीक काट कर उन्हें अंडे से निकाले बिना चिकन भ्रूण को Euthanize ।
  5. पारंपरिक प्रोटोकॉल और immunohistochemistry द्वारा कैम-व्युत्पंन explants के आयल वर्गों में अंग गठन का आकलन करें ।

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Representative Results

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ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल विवरण एक विधि है कि दोनों जल्दी और देर से organogenesis के चरणों की जांच की अनुमति देता है, अक्सर जटिल सेलुलर और आणविक बातचीत द्वारा सीमित है ।

यह पद्धति पहले Figueiredo एट अल में कार्यरत थी. 5 पायदान और एच. डी. की भूमिका को सुलझाना एवियन parathyroid/थाइमस आम primordium विकास में संकेतन ।

इस के साथ साथ, नए परिणाम चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाया organogenesis के एक ही मॉडल का उपयोग कर रहे हैं । चित्रा 1a थाइमस और parathyroid गठन के प्रारंभिक चरणों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल प्रयोगात्मक डिजाइन को दर्शाया गया है । बटेर भ्रूण भावी अंग (3/4PAR) के शामिल क्षेत्र अलग और एक organotypic प्रणाली में ४८ ज के लिए इन विट्रो में हो गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 . प्रतिनिधि organotypic संस्कृति परख के साथ प्राप्त परिणाम: भ्रूण क्षेत्र के जीन-अभिव्यक्ति विश्लेषण थाइमस और parathyroids (3/4PAR) के प्रकल्पित क्षेत्रों से युक्त इन विट्रो में विकसित के लिए ४८ ज. के हित के क्षेत्र में भ्रूण के आड़ा खंड के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और प्रयोगात्मक डिजाइन () । संक्षेप में, 3/4PAR पर qE3 यांत्रिक रूप से अलग किया गया था और ४८ ज के लिए इन विट्रो में उगाया जाता है । 3/4PAR-संबंधित जीन की अभिव्यक्ति, Tbx1, Six1, और Bmp4, तालिका () में प्राइमरों का उपयोग करते हुए qRT-पीसीआर द्वारा जांच की गई । Tbx1, Six1, और Bmp4 की अभिव्यक्ति हौसले से अलग (3/4PAR-0 एच) और (3/4PAR-48 ज) ऊतकों (सी) में विश्लेषण किया गया । बराबर की अभिव्यक्ति-संबंधित जीन की उपस्थिति में ४८ ज के लिए इन विट्रो में विकसित ऊतकों में विश्लेषण किया गया था २०० एनएम Ly411575 (डी) और 20 µ एम cyclopamine (), जो पायदान और हेज हॉग संकेत मार्ग के औषधीय अवरोधकों हैं, क्रमशः. प्रत्येक प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति β-actin और hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase प्रतिलिपि अभिव्यक्ति स्तर का मतलब के खिलाफ एक अनुपात के रूप में मापा गया था और मनमाना इकाइयों में व्यक्त (नियंत्रण में प्रत्येक प्रतिलिपि = 1) । मतलब है और मानक विचलन जैव सांख्यिकी विश्लेषण और वैज्ञानिक ग्राफिक डिजाइन के लिए एक सॉफ्टवेयर के साथ निर्धारित किया गया । त्रुटि पट्टियां माध्य के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । दो पूंछ न बिगड़ा छात्र का टी-टेस्ट इस्तेमाल किया गया था और परिणाम काफी अलग माना जाता था जब पी-मान ०.०५ (p < ०.०५) से कम था । β-actin, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; ४११.५७५, N, Notocord; NT, तंत्रिका ट्यूब; PAR, ग्रसनी आर्क क्षेत्र; पीपी, ग्रसनी थैली । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जीन की अभिव्यक्ति के लिए सममूल्य संरचनाओं (सममूल्य से संबंधित जीन), यानी, Tbx116,17, Six118, और Bmp415,17, के गठन में शामिल होना सामांय के दौरान मूल्यांकन किया गया विकास. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) पहले वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया5 (प्राइमर चित्र 1bमें सूचीबद्ध हैं) । तीन जीन के टेप हौसले से अलग (3/4PAR-0 एच) और ४८ में ज-संस्कृति वाले ऊतकों (3/4PAR-48 एच) (चित्रा 1C) में पाया गया । संस्कृति के ४८ ज के बाद केवल Bmp4 अभिव्यक्ति का स्तर काफी कम हुआ ।

थाइमस और parathyroid विकास के प्रारंभिक चरणों में पायदान और एचएच संकेत मार्ग की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए, औषधीय अवरोधकों संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया के दौरान इन विट्रो विकास । अवरोधक खुराक Figueiredo एट अल में वर्णित हैं । 5 तीन जीन का अभिव्यक्ति स्तर विश्लेषण काफी पायदान अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में वृद्धि हुई 3/4PAR में कम थे, जब (दवा के बिना) (चित्रा 1 डी) की स्थिति को नियंत्रित करने की तुलना में । इसके विपरीत, केवल Bmp4 टेप काफी ४८ ज में कम थे-संस्कृति वाले ऊतकों जब पारा संकेतन अवरुद्ध (चित्रा 1E) था ।

थाइमस और parathyroid ग्रंथि organogenesis के देर चरणों का अध्ययन करने के लिए, प्रसंस्कृत ऊतकों तो CAMs पर भ्रष्टाचार किया गया और 10 दिनों के लिए आगे विकसित करने की अनुमति दी ( चित्र 2aमें प्रयोगात्मक डिजाइन देखें) ।

Figure 2
चित्रा 2 . प्रतिनिधि के साथ प्राप्त परिणाम ovo में परख: chorioallantoic झिल्ली में 10 दिनों के लिए हो गए भ्रष्टाचारियों का रूपात्मक विश्लेषण । ४८ के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एच-कल्चर्ड बराबर कैम पर भ्रष्टाचार किया और 10 दिनों के लिए विकसित (एक). कैम के धारावाहिक वर्गों-व्युत्पन्न explants (बी-I) स्लाइड एच एंड ई के साथ सना हुआ (बी, सी, एफ, और जी), QCPN के साथ immunodetected (डी और ) और विरोधी पैन CK (एच और मैं) एंटीबॉडी, और गिल hematoxylin के साथ counterstained । काले तीर सिर QCPN () और पैन CK (मैं) के लिए मजबूत immunostaining संकेत मिलता है । मेजबान मूल के लसीकावत् कोशिकाओं के साथ एक chimeric थाइमस के एक अनुप्रस्थ अनुभाग और मजबूत thymic+ संकेतों (ब्लैक QCPN) () के साथ बटेर व्युत्पंन ऐरोहेड उपकला कोशिकाओं । थाइमस और parathyroid ग्रंथियों (I) के epithelia में मज़बूत पैन CK+ सिग्नल (black ऐरोहेड) । छवियां इमेजिंग सॉफ्टवेयर और एक कैमरा के साथ एक खुर्दबीन का उपयोग कर एकत्र किए गए ( सामग्री की तालिकादेखें) । Ca, उपास्थि; सांचा, chorioallantoic झिल्ली; महामारी, उपकला; PAR, ग्रसनी आर्क क्षेत्र; पीटी, parathyroid ग्रंथियों; सोम, चिकनी मांसपेशी; 10 डी, दस दिन । स्केल सलाखों, ५० µm (बी, डी, एफ, और एच) और १०० µm (सी, , जी, और मैं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कैम-व्युत्पन्न explants पर विकसित अंगों का रूपात्मक विश्लेषण पारंपरिक प्रोटोकॉल और immunohistochemistry (चित्रा 2 बी-I) द्वारा किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित5. कैम व्युत्पंन explants दिखाया पूरी तरह से chimeric थाइमस (चित्रा 2 बी-) बटेर के साथ व्युत्पंन (QCPN+) thymic दाता मूल के लसीकावत् जनक कोशिकाओं (चिकन) उपकला (आंकड़े 2d, ई) द्वारा बृहदांत्र । कैम के धारावाहिक वर्गों-व्युत्पंन explants आगे विरोधी पैन cytokeratin (विरोधी पैन CK) एंटीबॉडी के साथ immunocytochemistry के लिए संसाधित (एक उपकला कोशिका मार्कर), दिखाया thymic और सामान्य parathyroid सुविधाओं के साथ epithelia रूपात्मक (चित्रा 2H , I). thymic उपकला कोशिकाओं एक जालीदार वास्तुकला का प्रदर्शन किया, जबकि parathyroid parenchymal कोशिकाओं गोलाकार थे, समूहों में व्यवस्थित और कई केशिकाओं ने घेर लिया । इसके अतिरिक्त, श्वसन तंत्र से अंय बराबर-व्युत्पंन संरचनाओं भ्रष्टाचार में मनाया जा सकता है । उपास्थि, श्वसन उपकला, और चिकनी म्यूकोसा से जुड़े मांसपेशी आसानी से चित्रा बीमें प्रतिष्ठित किया गया ।

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Discussion

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इस विधि की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू दोनों चिकन और बटेर अंडे की गुणवत्ता है । विशेष रूप से ovo परख, चिकन अंडे की एक अच्छी गुणवत्ता के दौरान लंबी गर्मी की अवधि को ध्यान में रखते हुए व्यवहार्यता दर (९०%) प्रक्रिया के अंत तक में सुधार । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, विभिंन आपूर्तिकर्ताओं से अंडे का परीक्षण । लंबी अवधि के लिए (16-17 दिन तक) unlauncheded अंडे की मशीन और उनके विकास की जांच करें । एक अच्छी गुणवत्ता बैच माना जाता है, भ्रूण के ८०% से अधिक सामांय विकास वर्तमान चाहिए । यह भी सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक मशीन कदम reproducible तुल्यकालिक विकास चरण प्रदान करता है के अंत में विश्वसनीय और सही मायने में प्रतिनिधि परिणाम की गारंटी महत्वपूर्ण है । अंडा शैल porosity के कारण, सभी अंडे की गर्मी कदम के लिए मशीन में एक humidified माहौल बनाए रखें । पर्यावरण संदूषण से बचने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं (वैकल्पिक कदम) प्रक्रिया में पंजाबियों समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है ।

इस विधि बटेर अंग और उंहें एक organotypic प्रणाली में ४८ ज के लिए बढ़ रही है अलग से शुरू होता है । यह पहला कदम, पहले से ही थाइमस और parathyroid जल्दी-विकास5अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया, यह भी अंय अंगों को लागू किया जा सकता है अगर परख सीमाएं ध्यान में रखा जाता है । छोटे explants के अंग (से कम 3 मिमी) और इन विट्रो में छोटी अवधि की मशीन (४८ ज तक) पोषक तत्वों के अकुशल प्रसार को रोकने के लिए सलाह दी जाती है और ऊतकों को सुखाने, जो आमतौर पर तब होता है जब explants बड़े आयामों तक पहुँचने ।

इस विधि भी इस तरह के औषधीय अवरोधकों के रूप में घुलनशील रिएजेंट, के उपयोग से जटिल आनुवंशिक हेरफेर बाईपास जो संकेत रास्ते, के मॉडुलन की अनुमति देता है5,7. इस प्रक्रिया के लिए, दवा की खुराक में वृद्धि शारीरिक/विषाक्त संस्कृति की स्थिति की पहचान करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । निरोधात्मक कार्रवाई संकेतन मार्ग लक्ष्य के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से मापा जा सकता है-जीन ।

इस प्रक्रिया के दो चरण में, संस्कृति वाले ऊतकों को अंग गठन के देर चरणों का अध्ययन करने के लिए सांचा पर भ्रष्टाचार कर रहे हैं । कैम परख कंकाल विकास और पंख गठन की तरह organogenesis के अंय संदर्भों में इस्तेमाल किया गया है प्रत्यक्ष द्वारा अंग के रूडी पर भ्रष्टाचार का कैमरा9,10,11। इसके अतिरिक्त, कैम engraftment भी सफलतापूर्वक चूहों में चिकन xenografts में लागू किया गया परीक्षण परिपक्वता19अध्ययन करने के लिए । हालांकि सांचा परख एक शक्तिशाली अनुसंधान के लिए देर से अंग गठन के चरणों का अध्ययन उपकरण है, यह अपनी सीमाओं के बारे में पता होना जरूरी है । प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक भ्रष्टाचार के लिए सांचा तैयार है । यह केवल संवहनी घावों के लिए छोटे जहाजों को लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, अगर केवल उन में से कुछ को क्षतिग्रस्त कर रहे हैं, बाद angiogenic प्रतिक्रिया सांचा से उद्भव नए जहाजों द्वारा भ्रष्टाचारी ऊतकों के आक्रमण को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । नतीजतन, प्रत्यारोपण ऊतकों पर्याप्त पोषक तत्वों या गैस एक्सचेंजों के लिए विकास को बनाए रखने नहीं होगा । दूसरी ओर यदि जख्मी क्षेत्र की तैयारी करते समय बड़े जहाजों की निष्ठा से समझौता कर लिया जाए तो भ्रूण को त्याग देना पड़ता है.

ovo के विकास में सांचा का उपयोग करने की एक महत्वपूर्ण सीमा का गठन अंगों के संरचनात्मक विस्थापन, explants बढ़ते के तीन आयामी बाधा के कारण है । यह अक्सर थाइमस और parathyroid ग्रंथियों की अधूरी जुदाई में परिणाम (चित्रा 2F-I), और अपर्याप्त thymic विभाजन में, अंगों की सामान्य संख्या की कमी के साथ गठन5.

कैम प्रणाली की एक और बाधा एक उप औषधीय एजेंट5के इष्टतम पहुंच, यहां तक कि दैनिक दवा प्रशासन के साथ हो सकता है, इस प्रकार explant देर मंच के विकास के विश्लेषण सीमित । एक उदाहरण के रूप में, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि cyclopamine सफलतापूर्वक ovo मेंसंकेतन एचएच रोकना, जबकि पायदान संकेत अवरोधक, Ly411575,5 ovo मेंकोई निरोधात्मक गुण दिखाया ।

इन सीमाओं से परे, इस विधि महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एवियन मॉडल का उपयोग कर अंग गठन के प्रारंभिक और देर चरणों की जांच प्रदान करता है । इसके अलावा, विकासशील ऊतकों में हेरफेर किया जा सकता है और किसी भी समय में काटा-खिड़की इन विट्रो में और ovo विकास विधि भी organogenesis में अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाने ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक António Cidadão, इसाबेल Alcobia, और लियोन Parreira पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए, वीडियो कथा के लिए पद्म Akkapeddi के लिए आभारी हैं, और वीटर Proa प्रोटोकॉल de Instituto ई Histologia की सेवा से Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, तकनीकी सहायता के लिए । हम विशेष रूप से पाउलो Caeiro और ह्यूगो सिल्वा Unidade de audiovisuais (Audiovisual इकाई), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa के लिए उनके इस वीडियो के उत्पादन के लिए उत्कृष्ट प्रतिबद्धता के लिए ऋणी हैं । हम Leica माइक्रोसिस्टंस स्वीकार करने के लिए कृपया एक वीडियो प्रणाली के साथ सुसज्जित stereoscope प्रदान करने के लिए और Interaves-Sociedade एग्रो Pecuária के लिए, एस. ए बटेर निषेचित अंडे के साथ योगदान के लिए । यह काम Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Polycarbonate Membrane Insert  Corning 3412 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert 
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
6-well culture plates Nunc, Thermo Fisher Scientific 140675
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
Pyrex bowls from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette normax 5426015
Whatman qualitative filter paper Sigma-Aldrich WHA1001090 Filter paper
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Cyclopamine hydrate Sigma-Aldrich C4116 Pharmacological inhibitor of Hh signalling
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Stemolecule LY411575 Stemgent 04-0054 Pharmacological inhibitor of Notch signalling
TRIzol Reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15596026 Reagent for total RNA isolation
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 Microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80
Microscope Leica Microsystems  DM2500

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References

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दो कदम दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए जल्दी और देर से एवियन मॉडल में अंग निर्माण के चरणों: थाइमस और Parathyroid ग्रंथियों Organogenesis प्रतिमान
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Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).More

Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm. J. Vis. Exp. (136), e57114, doi:10.3791/57114 (2018).

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