ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة التعرف على يرقات melanogaster المورفولوجية التي تعاني من نقص تحت مستويات الأوكسجين الغلاف الجوي العادي. ويسمح هذا البروتوكول اليرقات التاكسج ينبغي تمييز من طفرات أخرى تظهر متداخلة تعمل مثل الركود أو بطء النمو.
يمكن أن يؤدي الحرمان من الأكسجين في الحيوانات من التعرض لمستويات منخفضة من الأكسجين الغلاف الجوي أو من تلف الأنسجة الداخلية الذي يتداخل مع توزيع الأوكسجين. من الممكن أيضا أن السلوك المنحرف للاستشعار الأكسجين من الخلايا العصبية يمكن أن تحفز السلوك مثل نقص وجود مستويات الأوكسجين العادي. في ميلانوجاستير دال، نتائج التنمية على مستويات منخفضة من الأوكسجين في تثبيط النمو والسلوك بطيئا خلال مراحل اليرقات. بيد هذه المنشأة مظاهر العجز الأكسجين تتداخل إلى حد كبير مع تعمل العديد من الطفرات التي تنظم النمو واستجابات الإجهاد أو الحركة. كنتيجة لذلك، لا يوجد حاليا لا مقايسة المتاحة لتحديد نقص ط) الخلوية التي يسببها طفرة أو السلوك الثاني) مثل نقص عند الناجمة عن سلوك الخلايا العصبية غير طبيعي.
ولقد حددنا مؤخرا اثنين السلوكيات المميزة في اليرقات melanogaster دال- التي تحدث في مستويات الأوكسجين العادي ردا على كشف داخلي من نقص. أولاً، تجنب هذه اليرقات في جميع المراحل، تختبئ في الغذاء، وكثيراً ما الضلال بعيداً عن مصدر لغذاء. ثانيا، نفق إلى التحتية ناعمة، التي تحدث عادة مرحلة الطور الثالث تجول هو يلغي كلياً إذا كانت اليرقات التاكسج. الفحص الموصوفة هنا يهدف إلى الكشف عن وكوانتيتاتي هذه السلوكيات ومن ثم لتوفير وسيلة للكشف عن نقص الناجمة عن الأضرار الداخلية بدلاً من الأوكسجين الخارجي منخفضة. لوحات المقايسة مع التحتية أجار والمكونات مركزية للصق الخميرة تستخدم لدعم الحيوانات من خلال حياة اليرقات. يتم تعقب مواقف والدولة من اليرقات يوميا كما أنها تنطلق من الطور الأول إلى الثالث. هو كوانتيتاتيد مدى الاتصال النفقي في التحتية أجار خلال المرحلة تجول بعد بوبيشن باستخدام إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة. المقايسة سوف تكون ذات قيمة في تحديد متى يكون نقص مكون من النمط الظاهري متحولة وبالتالي توفر نظرة ثاقبة المواقع المحتملة لعمل الجينات في السؤال.
مجموعة متطورة من الأدوات الوراثية الجزيئية المتاحة في ميلانوجاستير دال- جعله كائناً قيماً لدراسة العمليات البيولوجية تقحم مصانة. أثبتت ردود الجزيئية الرئيسية على توافر الأكسجين تكون حفظت عبر تطور والدراسات السابقة في ميلانوجاستير دال- ولدت رؤى مكونات عالمية هذه الإشارات مسارات 1،2، 3،4،،من56.
كجزء من دراسة تهدف إلى تشريح وظيفة الخلايا العصبية الحسية في اليرقات ميلانوجاستير دال ، وحددنا اثنين من الردود السلوكية التي ثبت أنها تنشط بنقص الأنسجة في مستويات الأوكسجين العادي 7. واحدة من هذه، فشل تحفر في الغذاء، عالية تتصل بالاستجابة لمستويات الأوكسجين المنخفضة التي أبلغ عنها وينجروفي و O’Farrell 8. سلوك الثاني، الفشل في نفق إلى التحتية ناعمة أثناء الطور الثالث أواخر تجول المرحلة، لا سابقا حددت اعتبارها تتعلق بنقص. عقدنا العزم أن تعريض اليرقات تجول نوع البرية إلى مستويات منخفضة الأكسجين يمنع أيضا التحتية أنفاق 7، واضعين بذلك أن كل هذه السلوكيات تنشأ من نقص-أما الناجم عن تلف الأنسجة أو بمستويات استهلاك منخفضة الأكسجين. هنا يصف لنا مقايسة وقد وضعنا على كوانتيتاتي هذه السلوكيات التي يسببها نقص اثنين، الذي يبدأ مع الملاحظات مباشرة بعد الفقس اليرقات.
ردود التاكسج في المراحل المبكرة اليرقات لا درست سابقا وذلك إجراء تحليل طوال حياة اليرقات عنصرا قيماً في جهودنا المقايسة. أكثر المظاهر وضوحاً لنقص – بطء النمو وضعف النمو والركود الحركي – تتداخل مع اليرقات تعمل العديد من الطفرات التي تنتجها. ولكن وجدنا أن يرقات الطور الثالث فقط مع نقص إظهار فشل كامل نفق 7. وبذلك، عقدنا العزم أن اليرقات حتى أكثر للخطر من حيث النمو والحركة مما لدينا اليرقات التاكسج، لا يزال أداء بعض نفق، بينما اليرقات التاكسج ابدأ نفقية 7. وهكذا عنصرا قيماً آخر لهذا الفحص أنه يوفر طريقة لإنشاء عند نقص هو المصدر لمجموعة معينة من بليوتروبيك تعمل، بدلاً من بعض الإجهاد أو عطل الأيضية الأخرى. كبرهان المقايسة، هنا يصف لنا استخدامها في وصف ردود اليرقات مع انخفاض التعبير الرغامى من أونينفلاتابل، جين الذي يعمل في الخطوط الجوية اليرقات 9.
ونحن نتصور أن هذا التحليل سوف تكون ذات قيمة للباحثين المشاركين في وصف تعمل اليرقات التي تشمل ضعف النمو والسلوك بطيئا. كنتيجة، الجينات الجديدة التي تؤثر على التوزيع، أو استخدام، أو الردود، يمكن تحديد الأكسجين في جميع أنحاء الجسم. علاوة على ذلك، إدراج هذا التحليل في خافض فحص البروتوكول سيوفر طريقا مباشرا لتحديد الطفرات التي تنتج نقص. هذا التحليل سوف تكون أيضا قيمة في تحليل الدوائر الذي يتسبب في سلوك الفطرية التي يسببها نقص الموصوفة هنا. تحليل الشبكات العصبية من هذا النوع محط الكثير من البحوث الحالية والعصبي بسيطة لليرقة ميلانوجاستير دال- نظاما قيماً لتشريح من السلوكيات الآلي. الخلايا العصبية الحسية المشتركة في تصور الأكسجين اليرقات قد تم بالفعل تحديد، توفير خطوة أولى نحو تحديد الدوائر الكاملة للردود التي يسببها نقص 10،11. استخدام لدينا الإنزيم في تركيبة مع ضربة قاضية العصبية الانتقائي عبر نظام GAL4-UAS12 مسار واضح لتحديد مكونات الشبكة العصبية الأخرى.
وقد قدمنا هنا مقايسة بسيطة مصممة للكشف عن نقص الأنسجة في اليرقات ميلانوجاستير د . يستند التشخيص تختبئ انخفض في أكوام المواد الغذائية في بداية حياة اليرقات وغياب التحتية نفق في أواخر الحياة اليرقات. مزاحمة اليرقات يمكن أن يسبب الهجرة المبكرة بعيداً عن مصدر لغذاء، وهكذا أحد الجوانب البالغة الأهمية في الفحص أن عددا صغيراً من اليرقات جزيئي حضور كبير لغذاء الزائد. إدراج نزوات هيدروكسيل ف الميثيل مبيد للفطريات (نيباجين) في لوحات أجار ضروري أيضا لمنع نمو العفن خلال المقايسة.
ونجد أن لوحات أجار يمكن أن تكون مصدرا لتقلب في المقايسة. نموذجياً، اليرقات من نفس النمط الوراثي، من دفعات مختلفة من الوالدين، أو من مجموعات مختلفة من اليرقات، تفاوتاً محدودة نسبيا في سلوكهم بالمقايسة. وفي المقابل، لوحات أجار في أيام مختلفة أو مع مجموعات مختلفة من أجار يمكن أن تؤدي الاختلافات في نفق. شرط واحد لذلك هو عنصر التحكم هذا واليرقات التجريبية ينبغي أن كل اختبار باستخدام لوحات أجار من إعداد المجموعة نفسها. أجار من مصنعين مختلفين أو الشحنات حتى من تصنيع نفس يمكن أن تختلف في قوتها التبلور، وحتى قد يكون من الضروري لضبط تركيز أجار صعودا من 2.2% المستخدمة هنا لتحقيق جل أمثل. وقد وجدنا أن سهولة يمكن أن تحفر اليرقات البرية نوع من خلال المواد الهلامية أجار 3%.
من أجل إبراز القيمة لهذا الفحص، وقد استخدمنا للتحقيق في احتمال نقص الأنسجة في اليرقات مع الدالة الممنوعة من أونينفلاتابل في تركي. النتائج التي توصلنا إليها تقديم دعم قوي للفرضية القائلة بأن فقدان التعبير الرغامى هذا الجين يمكن أن تنتج نقص: زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات أظهرت عدم تحفر في الغذاء، والغياب الكامل للاتصال النفقي التحتية خلال الطور الثالث. في دراساتنا السابقة للأنماط الجينية الأخرى، لاحظنا أن الخسائر الناجمة عن نقص في الغذاء تختبئ ليست كاملة مثل فقدان الاتصال النفقي التحتية و زجاجة-Gal4 > درس UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات هنا تصرفت على نحو مماثل. ولذلك توفر عنصر نفق الفاشلة لهذا الفحص إشارة أقوى من نقص.
على الرغم من أن زجاجة-Gal4 > واجهة المستخدمو [رني] اليرقات وأظهر الصفات السلوكية التشخيص من نقص، قطع(ue)-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] لا يحمل هذه التشوهات. زجاجة و قطع(ue) Gal4 برامج تشغيل يتم التعبير عنها في مراحل مختلفة، وفي أنماط مختلفة، داخل تركي اليرقات. زجاجة-أعرب عن سائق Gal4 في جميع أنحاء النظام الرغامى بدءاً من التنمية في امبريوجينيسيس ومستمرة من خلال حياة اليرقات. وفي المقابل، التعبير Gal4 من قطع(ue)-سائق Gal4 يبدأ في نهاية الحياة الجنينية، بعد morphogenesis تركي، ويقتصر على المقاطع الخلفي المتطرفة من جذوع الظهرية، سفن الطولية الرئيسية فقط النظام الرغامى. وحدة الاستخبارات المالية ضربة قاضية مع هذا الخط Gal4 قد لا يقلل ذلك التعبير وحدة الاستخبارات المالية وقت كاف أو على نطاق واسع يكفي لإنتاج بعض مستوى العتبة لنقص اللازمة لتحريك السلوكيات المقاسة في هذا التحليل.
دراسة سابقة وجدت أن يرقات الطور الثالث تتعرض لمستويات منخفضة من الأكسجين (10%) تظهر انخفاض النمو وتأخير ظهور بوبارييشن 14. زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات درس هنا تقدم إلى الطور الثالث ولكن آثار على معدلات النمو وبوبيشن وكانت أكثر وضوحاً: أنهم كانوا أصغر بكثير من الضوابط مع القليل جداً من الأنسجة الدهنية تحت وحاول بوبارييشن البشرة (الشكل 3) وسوى جزء طفيف (~ 10%). وتشير هذه الاختلافات إلى زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات شهدت قدرا أكبر من نقص، أما سبب ضربة قاضية وحدة الاستخبارات المالية في تركي كان حاضرا طوال حياتهم اليرقات كاملة، أو لأنها تنتج أكثر الحرمان من الأكسجين شديدة في الطور الثالث. كيف فقدان وظيفة وحدة الاستخبارات المالية في تركي قد يمنع نقل الأكسجين من غير الواضح في هذه المرحلة. تركي من زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات بالعيان من خلال بشرة (الشكل 3)، إشارة إلى أنهم الواردة الهواء وأضرار لا لدرجة أن دخول السائل للخطر الدالة. ولذلك فمن الممكن رسميا أن الرغامى الأضرار الناشئة عن فقدان وظيفة وحدة الاستخبارات المالية لا تحظى بنقص ولكن بدلاً من ذلك بعض الآخرين العيب الذي يمنع الاتصال النفقي. للأنماط الجينية التي درست سابقا، عقدنا العزم على أن الفشل في نفق يرتبط بمستويات مرتفعة من رابطة حقوق الإنسان مرناً7، المؤشر المعياري لتحلل ونقص في يرقات الطور الثالث مساء 15. وهكذا، تأكيد نهائي من نقص زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات (وفي يرقات درست في المستقبل استخدام هذا الفحص) ستشمل RT-PCR لتقييم مستويات مرناً رابطة حقوق الإنسان أو استخدام مؤشر المتاحة تجارياً لقياس مستويات الأوكسجين داخل الخلايا (انظر على سبيل المثال 16).
The authors have nothing to disclose.
وكانت كارين م. تشيانغ متلق 2016 جائزة جورج ج. شروبفير البحوث في جامعة رايس. زهو فانلي هي المستفيدة من زمالة التدريس من جامعة رايس. خدمات مركز الأسهم المورفولوجية بلومينغتون، مرفق “رحلة جامعة هارفارد”، مركز الموارد المورفولوجية فيينا العرفان.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |