Protokollen beskriver en simpel analyse for at identificere Drosophila melanogaster larver, der oplever hypoxi under normale atmosfæriske ilt niveauer. Denne protokol tillader hypoksiske larver kan skelnes fra andre mutanter, der viser overlappende fænotyper som træghed eller langsom vækst.
Iltmangel hos dyr kan skyldes eksponering for lav atmosfæriske ilt niveauer eller fra indre vævsskade, der forstyrrer ilt distribution. Det er også muligt, at afvigende adfærd af ilt-sensing neuroner kunne fremkalde hypoxi-lignende adfærd i overværelse af normal ilt niveauer. I D. melanogasterresultater udvikling på lavt iltindhold i hæmning af væksten og træg adfærd under de larve faser. Men disse etablerede manifestationer af ilt underskud overlapper betydeligt med fænotyper af mange mutationer, der regulerer vækst, stress svar eller bevægelse. Som resultat er der i øjeblikket ingen tilgængelige til at identificere i) cellulære hypoxi forårsaget af en mutation eller ii) hypoxi-lignende opførsel når induceret af unormal neuronal opførsel analyse.
Vi har for nylig identificeret to karakteristiske opførsel i D. melanogaster larver, der finder sted på normale iltindholdet i svar på intern registrering af hypoxi. Først, undgå sådanne larver på alle stadier, gravende ind i maden, ofte forvilde sig langt væk fra en fødekilde. For det andet er tunnelføring i en blød undergrundens, som normalt opstår i vandrer tredje instar fase helt afskaffet hvis larver er hypoksiske. Analysen beskrevet her er designet til at detektere og kvantificere disse adfærdsmønstre og dermed til at give en måde at opdage hypoxi induceret af indre skader i stedet for lave eksterne ilt. Assay plader med en agar-substrat og en central plug gær pasta bruges til at understøtte dyr gennem larve liv. Holdninger og tilstand af larver registreres dagligt, når de går videre fra første til tredje instar. Omfanget af tunnelføring i agar undergrundens vandrer fase er quantitated efter pupation ved hjælp af NIH ImageJ. Analysen vil være af værdi med at afgøre hvornår hypoxi er en komponent af en mutant fænotype og dermed give indsigt i mulige steder for det pågældende gen.
Den sofistikerede vifte af molekylær genetiske værktøjer til rådighed i D. melanogaster gør det en værdifuld organisme for studiet af evolutionært bevarede biologiske processer. Centrale molekylære svar til ilt tilgængelighed har vist sig at være bevaret på tværs af evolution og forudgående undersøgelser i D. melanogaster har genereret indsigt i de universelle komponenter af disse signalering veje 1,2, 3,4,5,6.
Som led i en undersøgelse med henblik på dissekere sensoriske neuron funktion i D. melanogaster larver, identificeret vi to adfærdsmæssige reaktioner, der viste sig at blive aktiveret af væv hypoxi på normale ilt niveauer 7. En af disse, undladelse af at graver sig ned i maden, er stærkt relateret til svar på lav ilt niveauer rapporteret af Wingrove og O’Farrell 8. Den anden adfærd, manglende tunnel i en blød undergrundens under den sene tredje instar vandrer fase, havde ikke tidligere identificeret som hypoxi-relaterede. Vi besluttet at udsætte vildtype vandrer larverne til lavt iltindhold også hæmmer undergrundens tunneling 7, således om oprettelse af at begge disse adfærdsmønstre stammer fra hypoxi – enten induceret af vævsskader eller lavt iltindhold indtag. Her beskriver vi en analyse, vi har udviklet for at kvantificere disse to hypoxi-induceret opførsel, som starter med observationer umiddelbart efter larve udklækningen.
Hypoksiske svar i de tidlige larve faser er ikke undersøgt tidligere og derfor udfører en analyse i hele larve liv er en værdifuld del af vores analyse. De fleste af de åbenlyse manifestationer af hypoxi-langsom udvikling, dårlig vækst og bevægeapparatet træghed-overlapper med larve fænotyper produceret af mange mutationer. Men vi har fundet, at kun tredje instar larver med hypoxi viser en total mangel på tunnel 7. Dermed, vi besluttet at selv larver mere kompromitteret vækst og bevægelse end vores hypoksiske larver, stadig udført nogle tunneling, hvorimod hypoksiske larverne aldrig tunnelforbindelsen 7. Et andet værdifuldt element af denne analyse er således, at det giver en måde at etablere når hypoxi er kilden til et bestemt sæt af pleiotrope fænotyper, i modsætning til nogle andre stress eller metaboliske funktionsfejl. Som en demonstration af analysen her beskriver vi dets anvendelse i kendetegner svar af larver med reduceret trakeal udtryk for uninflatable, et gen, der fungerer i larve airways 9.
Vi forestiller os, at denne analyse vil være af værdi for forskere involveret i kendetegner larve fænotyper, der omfatter dårlig vækst og træg adfærd. Som et resultat, nye gener, der har indflydelse på distribution, forbrug eller svar til, kunne ilt rundt i kroppen identificeres. Yderligere, indarbejde denne analyse i en mutant screening protokol ville give en direkte rute til at identificere mutationer, der producerer hypoxi. Denne analyse vil også være værdifulde i at analysere det kredsløb, der fremkalder hypoxi-induceret medfødte adfærd beskrevet her. Neurale netværksanalyse af denne type er fokus for megen Aktuel forskning og enkel nervesystemet af D. melanogaster larve er et værdifuldt system til dissekere ud automatiseret adfærd. Sensoriske neuroner involveret i larve ilt opfattelse er allerede konstateret, at give et første skridt i retning af definere den komplette kredsløb for hypoxi-induceret svar 10,11. Ved hjælp af vores analyse i kombination med selektiv neurale knockdown via GAL4-UAS system12 er en klar rute for afgrænse yderligere komponenter af neurale netværk.
Vi har præsenteret her en simpel assay designet til at påvise væv hypoxi i D. melanogaster larver. Diagnosen er baseret på nedsat gravende ind i mad gravhøje i larve opvækst og fraværet af undergrundens tunneling sent i larve liv. Larve fortrængning kan forårsage for tidlig migration fra en fødekilde og dermed et kritisk aspekt af analysen er at et lille antal larver er analyseret i overværelse af et stort overskydende mad. Inkludering af fungicid methyl-p hydroxyl benzoate (Nipagen) i agar plader er også afgørende for at forhindre skimmelvækst under analysen.
Vi finder, at agar plader kan være en kilde til variation i analysen. Typisk, larver af den samme genotype, fra forskellige partier af forældre eller fra forskellige samlinger af larver, Vis relativt begrænset variation i deres adfærd i analysen. Derimod agar plader lavet på forskellige dage eller med forskellige batches af agar kan give forskelle i tunneling. En betingelse er derfor at kontrol og eksperimentelle larver bør alle være testet ved hjælp af agar plader fra den samme batch forberedelse. Agar fra forskellige producenter eller endda forsendelser fra samme fremstilling kan variere i deres geldannende styrke, og så kan det være nødvendigt at justere agarkoncentration opad fra 2,2% bruges her til at opnå en optimal gel. Vi har fundet, at vildtype larver kan let graver gennem 3% agar geler.
For at vise værdien af denne analyse, har vi brugt det til at undersøge potentielle væv hypoxi i larver med undertrykt funktion af uninflatable i tracheae. Vores resultater giver stærke støtte til den hypotese, at tab af luftrør udtryk for dette gen kan producere hypoxi: btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver viste manglende graver sig ned i fødevarer og komplette fravær af undergrundens tunneling under den tredje instar. I vores forudgående undersøgelser af andre genotyper, konstaterede vi, at hypoxi-induceret tab af mad gravende ikke er så komplet som tab af undergrundens tunneling og btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver studerede her opførte sig på samme måde. Den mislykkede tunneling komponent af denne analyse giver derfor det stærkeste tegn på hypoxi.
Selv om btl-Gal4 > uif RNAi larver viste adfærdstræk diagnostiske af hypoxi, de skære(ue)-Gal4 > UAS –uif RNAi ikke udstille disse abnormiteter. Btl og skære(ue) Gal4 drivere er udtrykt på forskellige stadier, og i forskellige mønstre, inden de larve tracheae. Btl-Gal4 driver kommer til udtryk i hele trakeal systemet med udgangspunkt i sin udvikling i embryogenese og fortsætter gennem larve liv. I kontrast, Gal4 udtryk fra de skære(ue)-Gal4 driver kun begynder i slutningen af embryonale liv, efter morfogenese af tracheae, og er begrænset til de ekstreme bageste afsnit af de dorsale kufferter, den store langsgående fartøjer luftrør systemet. UIF knockdown med denne Gal4 kan ikke reducere uif udtryk derfor tidligt nok eller stort nok til at producere nogle tærskelniveauet for hypoxi kræves for at udløse opførsel målt i denne analyse.
En forudgående undersøgelse fandt, at tredje instar larver udsat for lav (10%) ilt niveauer viser nedsat vækst og forsinkede debut af pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver studerede her udviklet sig til den tredje instar men virkningerne på deres vækst og pupation satser var mere udtalt: de var betydeligt mindre end kontrol med meget lidt fedtvæv under den epidermis (figur 3) og kun en mindre fraktion (~ 10%) forsøgt pupariation. Disse forskelle tyder btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver oplevet en større grad af hypoxi, enten fordi uif knockdown i tracheae var til stede hele livet hele larve, eller fordi det er produceret en mere svær iltmangel i tredje instar. Hvordan tab af uif funktion i tracheae kan forhindre ilt transport er uklare på dette punkt. Tracheae af btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver var let synlige gennem neglebånd (figur 3), tegn på at de indeholdt luft og blev ikke skadet til det punkt, at væske post kompromitteret funktion. Derfor er det formelt muligt at luftrør skade lavet af tab af uif funktion ikke fremkalde hypoxi, men derimod nogle andre fejl, der hæmmer tunneling. For genotyper undersøgt tidligere, vi har besluttet at undladelse af at tunnel er forbundet med forhøjede niveauer af LDH mRNA7, de kanoniske indikator af glykolyse og hypoxi i slutningen tredje instar larver 15. Således endelig bekræftelse af hypoxi for btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver (og i larver undersøgt fremover bruge dette assay) ville indebære RT-PCR for at vurdere LDH mRNA niveau eller brug af et kommercielt tilgængelige indikator til at måle intracellulære ilt niveauer (for eksempel Se 16).
The authors have nothing to disclose.
Karen M. Qiang var 2016 modtageren af George J. Schroepfer Research Award på Rice University. Fanli Zhou er modtageren af en undervisning stipendium fra Rice University. Tjenester af Bloomington Drosophila Stock Center, Harvard tur facilitet, Wien Drosophila Resource Center er taknemmeligt erkendt.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |