Protokollen beskriver en enkel analyse for å identifisere Drosophila melanogaster larver som opplever hypoksi under normalt atmosfærisk oksygen nivåer. Denne protokollen tillater hypoxic Larvene skilles fra andre mutanter som viser overlappende fenotyper som treghet eller langsom vekst.
Oksygenmangel i dyr kan resultere fra eksponering for atmosfærisk oksygen nivåer eller interne vevsskade som forstyrrer oksygen distribusjon. Det er også mulig at Avvikende atferd av oksygen-sensing neurons kan indusere hypoksi-lignende oppførsel i nærvær av normal oksygennivået. I D. melanogaster, utvikling på lavt oksygennivå resulterer i Hemming av vekst og svak oppførsel fra larver faser. Men overlapper disse etablerte manifestasjoner av oksygen underskudd betydelig av fenotyper av mange mutasjoner som regulerer vekst, stressresponser eller bevegelse. Som resultat er det ingen analysen tilgjengelig for å identifisere i) mobilnettet hypoksi indusert av en mutasjon eller ii) hypoksi-lignende oppførsel når indusert av unormal neuronal atferd.
Vi har nylig funnet to atskillelse opptreden i D. melanogaster larver som oppstår ved normal oksygennivået svar på interne påvisning av hypoksi. Først i alle stadier unngå slike Larven grave inn mat, ofte avvik langt borte fra mat. Andre fjernes tunnelering i en myk undergrunnen, som vanligvis oppstår under den vandrende skikkelsen scenen helt hvis larver hypoxic. Analysen beskrevet her er utviklet for å oppdage og quantitate disse atferd og dermed til å oppdage hypoksi indusert av interne skader i stedet for eksterne oksygen. Analysen plater med en agar undergrunnen og en sentral plugg gjær lim brukes til å støtte dyr gjennom larver liv. Posisjonene og delstaten Larvene spores daglig de går videre fra første til tredje. Omfanget av tunnelering i agar undergrunnen under vandring fase er quantitated etter pupation med NIH ImageJ. Analysen vil være av verdi i å bestemme når hypoksi er en komponent i en mutant fenotypen og dermed gi innsikt i mulige områder av genet i spørsmålet.
Sofistikert utvalg av molekylær genetisk verktøyene i D. melanogaster gjør det en verdifull organisme for studier av evolusjonært bevarte biologiske prosesser. Nøkkel molekylær svar oksygen tilgjengelighet har vist seg å være bevart over utviklingen og tidligere studier i D. melanogaster har generert innsikt i universell komponentene av disse signalnettverk trasé 1,2, 3,4,5,6.
Som en del av en studie rettet mot dissekerende sensoriske Nevron funksjon i D. melanogaster larver, identifisert vi to atferdsdata svar som viste seg å være aktivert av vev hypoksi på normal oksygen nivåer 7. En av disse, unnlatelse av å hule i mat, er svært knyttet til svaret lavt oksygennivå rapportert av Wingrove og O’Farrell 8. Det andre opptreden, manglende tunnel til en myk undergrunnen under den sene tredje skikkelsen vandring fase, hadde ikke tidligere identifisert som hypoksi-relaterte. Vi bestemt at utsette vill type vandrende Larvene til lavt oksygennivå hemmer også undergrunnen tunnelering 7, dermed etablere at begge disse atferd kommer fra hypoksi – enten indusert vevsskade eller lavt oksygennivå inntak. Her beskriver vi analysen har vi utviklet for å quantitate disse to hypoksi-indusert atferd, som starter med observasjoner umiddelbart etter larver.
Hypoxic svar i de tidlige larver stadiene har ikke blitt undersøkt tidligere og derfor utfører en analyse gjennom larver livet er en verdifull del av analysen vår. De fleste av de åpenbare manifestasjoner av hypoksi-langsom utvikling, dårlig vekst og locomotor treghet-overlapper med larver fenotyper produsert av mange mutasjoner. Men vi har funnet at bare tredje skikkelsen Larvene med hypoksi viser en fullstendig fiasko til tunnel 7. Derfor vi funnet ut at selv Larvene mer kompromittert vekst og bevegelse enn våre hypoxic larver, fortsatt utført noen tunnelering, mens hypoxic Larvene aldri tunnelerte 7. En annen verdifull element av denne analysen er at det gir en måte å opprette når hypoksi er kilden til et bestemt sett av pleiotropic fenotyper, i motsetning til noen andre stress eller metabolske funksjonsfeil. Som en demonstrasjon av analysen, her vi beskriver bruken karakteriserer svarene på Larvene med redusert tracheal uttrykk for uninflatable, et gen som fungerer i larver airways 9.
Vi ser at denne analysen vil være av verdi for forskere i karakteriserer larver fenotyper med dårlig vekst og svak atferd. Som et resultat, nye gener som påvirker distribusjon, bruk, eller svar til kan oksygen i kroppen identifiseres. Videre ville omfatter denne analysen i en mutant screening protokoll gi en direkte rute til identifisere mutasjoner som produserer hypoksi. Denne analysen vil også være verdifull i å analysere kretsene som utløser hypoksi-indusert medfødte atferd beskrevet her. Nettverk analyse av denne typen er fokus for mye aktuell forskning og enkel nervesystemet av D. melanogaster Larven er en verdifull system for dissekere ut automatisert atferd. Sensoriske neurons involvert i larver oksygen oppfatning har allerede blitt identifisert, gir et første skritt mot å definere komplett kretskobling for hypoksi-indusert svar 10,11. Bruke analysen vår i kombinasjon med selektiv nevrale knockdown via GAL4-UAS systemet12 er en klar rute for skildre ytterligere komponenter av nettverk.
Vi har presentert her en enkel analysen utviklet for å oppdage vev hypoksi i D. melanogaster larver. Diagnosen er basert på redusert grave inn mat hauger i larver oppvekst og fravær av undergrunnen tunnelering sent i larver liv. Larver stimlet kan forårsake tidlig migrasjon fra mat og dermed en viktig del av analysen er at et lite antall Larvene er assayed et stort overskudd mat. Inkludering av soppdreper metyl-p hydroksyl benzoate (Nipagen) i agar platene er også avgjørende for å hindre muggvekst under analysen.
Vi finner at agar platene kan være en kilde til variasjoner i analysen. Larver av samme genotype, fra ulike grupper av foreldre eller fra ulike samlinger av larvene, viser vanligvis relativt begrenset variasjon i deres atferd i analysen. Derimot agar plater laget på ulike dager eller med ulike grupper av agar kan gi forskjeller i tunnelering. En fastsettelse derfor er kontrollen og eksperimentelle Larvene bør alle være testet med agar plater fra samme batch forberedelse. Agar fra forskjellige produsenter eller selv forsendelser fra samme produksjon kan variere i sin gelling styrke, og så det kan være nødvendig å justere agar konsentrasjonen oppover fra 2.2% brukt her for å oppnå en optimal gel. Vi har funnet at wild type Larvene kan lett hule gjennom 3% agar gels.
For å demonstrere verdien av denne analysen, har vi brukt den for å undersøke mulige vev oksygenmangel i Larvene med undertrykt funksjon av uninflatable i tracheae. Våre funn gir sterk støtte for hypotesen at tap av tracheal uttrykk for dette genet kan produsere hypoksi: btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver viste å hule i mat og fullstendig fravær av undergrunnen tunneling under den tredje skikkelsen. I vår tidligere studier av andre genotyper, observerte vi at hypoksi-indusert tap av mat gravende ikke er så komplett som tap av undergrunnen tunnelering og btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver studert her oppførte seg på samme måte. Den mislykkede tunnelering komponenten av denne analysen gir derfor den sterkeste tegn på hypoksi.
Selv om btl-Gal4 > uif RNAi larver viste opptreden personlighetstrekk diagnostiske av oksygenmangel, i cut(ue)-Gal4 > UAS –uif RNAi ikke viser disse unormalt. Btl og kuttet(ue) Gal4 sjåførene uttrykkes på ulike stadier, og i ulike mønstre, innenfor de larver tracheae. Btl-Gal4 sjåfør uttrykkes gjennom tracheal systemet fra utviklingen i embryogenesis og fortsetter gjennom larver livet. I kontrast, Gal4 uttrykk i kuttet(ue)-Gal4 driveren bare begynner på slutten av embryonale liv, etter morphogenesis av tracheae, og er begrenset til ekstreme bakre deler av dorsal stammene, store langsgående blodårene i tracheal systemet. UIF knockdown med denne Gal4-linjen kan ikke derfor redusere uif uttrykk tidlig nok eller bredt nok til å produsere viss terskel hypoksi for å utløse atferd målt i denne analysen.
En tidligere studie fant at tredje skikkelsen Larvene utsatt for lavt oksygennivå (10%) viser redusert vekst og forsinket utbruddet av pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver studert her kommet til den tredje skikkelsen men virkningene på sine vekst og pupation priser var mer uttalt: de var betydelig mindre enn kontroller med lite fettvev under den overhuden (Figur 3) og bare en liten brøkdel (~ 10%) forsøkte pupariation. Disse forskjellene foreslå btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver opplevde en større grad av hypoksi, enten fordi uif knockdown i tracheae var til stede gjennom hele larver livet, eller fordi det produsert mer alvorlig oksygenmangel i tredje skikkelsen. Hvordan tap av uif funksjon i tracheae kan hindre oksygen transport er uklare på dette punktet. Tracheae av btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver var synlig gjennom cuticle (Figur 3), en indikasjon på at de inneholdt luft og var ikke skadet til punktet at væske oppføring kompromittert funksjon. Det er derfor formelt mulig at tracheal skaden opprettet av tap av uif funksjon ikke framprovosere hypoksi men heller noen andre feil som hemmer tunnelering. For genotyper studerte tidligere, fastslått vi at unnlatelse av å tunnel er forbundet med forhøyede nivåer av LDH mRNA7, den kanoniske indikatoren på Glykolysen og hypoksi i slutten tredje skikkelsen Larvene 15. Dermed endelig bekreftelse av oksygenmangel for btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver (og larver undersøkt i fremtiden bruke denne analysen) ville innebære RT PCR å vurdere LDH mRNA nivåer eller bruk av en kommersielt tilgjengelig indikator for å måle intracellulær oksygen nivåer (for eksempel se 16).
The authors have nothing to disclose.
Karen M. Qiang var 2016 mottakeren av George J. Schroepfer forskning prisen ved Rice University. Fanli Zhou er mottakeren av en undervisning Fellowship fra Rice University. Tjenestene til Bloomington Drosophila lager sentrum, Harvard tur anlegget, Wien Drosophila Resource Center er takknemlig anerkjent.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |