Het protocol beschrijft een eenvoudige test om te identificeren van Drosophila melanogaster larven die hypoxie onder normale atmosferische zuurstofniveaus ondervindt. Dit protocol staat hypoxische larven te onderscheiden van andere mutanten die aantonen dat overlappende fenotypen zoals traagheid of trage groei.
Zuurstof ontbering in dieren kan voortvloeien uit blootstelling aan lage atmosferische zuurstofniveaus of van interne weefselschade die met zuurstof distributie interfereert. Het is ook mogelijk dat afwijkend gedrag van zuurstof-sensing neuronen hypoxie-achtig gedrag in het bijzijn van normale zuurstofniveaus kan induceren. In D. melanogaster, ontwikkeling op lage zuurstofniveaus leidt tot remming van de groei en trage gedrag tijdens de larvale stadia. Echter, deze gevestigde uitingen van zuurstof tekort overlappen aanzienlijk met de fenotypen van vele mutaties die regelen van groei, stress reacties of motoriek. Als resultaat is er momenteel geen test beschikbaar om te identificeren i) cellulaire hypoxie geïnduceerd door een mutatie of ii) hypoxie-achtig gedrag wanneer veroorzaakt door abnormale neuronale gedrag.
Onlangs hebben wij twee kenmerkende gedragingen in D. melanogaster larven die zich bij normale zuurstofniveaus in reactie op interne opsporing van hypoxie voordoen vastgesteld. Eerst, in alle stadia Vermijd deze larven gravende in voedsel, vaak dwalen ver weg van een bron van voedsel. Ten tweede, tunneling in een zachte onderlaag, die normaal optreedt tijdens de dolende derde instar fase is volledig afgeschaft als larven hypoxische. De hier beschreven test is ontworpen om te detecteren en kwantificeren van deze gedragingen en dus een manier om te ontdekken van hypoxie geïnduceerd door inwendige schade in plaats van lage externe zuurstof te bieden. Test platen met een agar-substraat en een centrale stekker voor gist paste zijn gebruikt ter ondersteuning van dieren door het larvale leven. De standpunten en de staat van de larven worden dagelijks bijgehouden als zij uit eerste naar het derde instar voortkomen. De mate van tunneling in de agar substraat tijdens dolende fase is quantitated na met behulp van NIH ImageJ verpopt. De test zal worden van waarde om te bepalen wanneer hypoxie is een onderdeel van een mutant fenotype en dus inzicht geven in mogelijke locaties voor de actie van het betrokken gen.
De geavanceerde matrix voor moleculaire genetische tools beschikbaar in D. melanogaster maken het een waardevolle organisme voor de studie van de evolutionair geconserveerde biologische processen. Belangrijke moleculaire reacties op de beschikbaarheid van zuurstof hebben bewezen te worden geconserveerd over evolutie en voorafgaande studies in D. melanogaster hebben gegenereerd inzichten in de universele componenten van deze trajecten 1,2, signalering 3,4,5,6.
Als onderdeel van een onderzoek gericht op het ontleden van sensorisch neuron functie in D. melanogaster larven, vastgesteld we twee gedrags reacties die bleek te worden geactiveerd door weefsel hypoxie op normale zuurstof niveaus 7. Een van deze, niet ingraven in voedsel, is sterk verwant aan het antwoord op de lage zuurstofniveaus gemeld door Wingrove en O’Farrell 8. Het tweede gedrag, niet-tunnel in een zachte onderlaag tijdens de late derde instar zwerven fase, had niet eerder geïdentificeerd als hypoxie-gerelateerde. Wij vastbesloten dat bloot wild type dolende larven te lage zuurstofniveaus ook remt substraat tunneling 7, dus tot de oprichting van dat zowel deze gedragingen zijn afkomstig uit hypoxie – hetzij door weefselbeschadiging of door inname van lage zuurstof veroorzaakt. Hier beschrijven we een bepaling die we hebben ontwikkeld om te kwantificeren van deze twee hypoxie-geïnduceerde gedragingen, die met opmerkingen onmiddellijk na het larvale uitkomen begint.
Hypoxische reacties in de vroege larvale stadia niet eerder onderzocht zijn en daarom het uitvoeren van een analyse larvale levenslange is een waardevol onderdeel van onze test. De meeste voor de hand liggende uitingen van hypoxie – trage ontwikkeling, slechte groei en motorische traagheid – overlappen met larvale fenotypen geproduceerd door vele mutaties. Maar wij hebben gevonden dat alleen derde instar-larven met hypoxie Toon een complete mislukking om te tunnelen 7. Dus vastbesloten wij dat zelfs larven meer gecompromitteerd in termen van groei en motoriek dan onze hypoxische larven, nog steeds uitgevoerd sommige tunneling, overwegende dat hypoxische larven nooit tunnelverbinding 7. Een ander waardevol onderdeel van deze test is dus dat het biedt een manier om vast te stellen wanneer hypoxie de bron van een bepaalde set van pleiotropic fenotypen, in tegenstelling tot sommige andere stress of metabole storing is. Als een demonstratie van de bepaling, hier beschrijven we het gebruik ervan in het karakteriseren van de antwoorden van larven met verminderde tracheale uitdrukking van uninflatable, een gen dat de functies in de larvale airways 9.
We denken dat deze test van waarde aan onderzoekers die zich bezighouden zijn zal met het karakteriseren van larvale fenotypen waarin slechte groei en trage gedrag. Als een resultaat, nieuwe genen die invloed hebben op de distributie, gebruik of reacties op, kan zuurstof door het lichaam worden geïdentificeerd. Verder, opneming van deze bepaling in een mutant screening protocol zou zorgen voor een directe route naar identificatie van mutaties die produceren van hypoxie. Deze test zal ook waardevol in het analyseren van de circuits die de hypoxie-geïnduceerde aangeboren gedrag hier beschreven lokt. Neuraal netwerkanalyse van dit type is een focus van veel huidige onderzoek en het eenvoudig zenuwstelsel van de larve van de D. melanogaster is een waardevolle systeem voor het ontleden van geautomatiseerde gedrag. Sensorische neuronen betrokken bij larvale zuurstof perceptie zijn reeds geïdentificeerd, bieden een eerste stap naar de volledige circuits voor hypoxie-geïnduceerde reacties 10,11te definiëren. Met behulp van onze assay in combinatie met selectieve neurale knockdown via de GAL4-UAS systeem12 is een duidelijke route uitgezet verdere onderdelen van het neurale netwerk.
Hier hebben we een eenvoudige test ontworpen voor het opsporen van weefsel hypoxie in D. melanogaster larven gepresenteerd. Diagnose is gebaseerd op de verminderde gravende in voedsel terpen in larvale jeugd en de afwezigheid van substraat tunneling laat in het larvale leven. Larvale verdringing kan leiden tot vroegtijdige migratie uit de buurt van een bron van voedsel en een kritische aspect van de test is dus dat een klein aantal larven worden bepaald in aanwezigheid van een grote overtollig voedsel. Integratie van het fungicide methyl-p hydroxyl benzoaat (Nipagen) in de agar-platen is ook essentieel om te voorkomen dat schimmel groei tijdens de test.
Wij vinden dat de agar platen een bron van variabiliteit in de test kunnen. Larven van de dezelfde genotype, vanuit verschillende batches instellen van ouders of vanuit verschillende collecties van larven, tonen meestal relatief beperkte variatie in hun gedrag in de bepaling. In tegenstelling, agar platen gemaakt op verschillende dagen of met verschillende batches instellen agar verschillen bij tunneling kunnen opleveren. Een eis is daarom dat besturingselement en experimentele larven moeten allemaal worden getest met behulp van agar platen uit de dezelfde batch voorbereiding. Agar van verschillende fabrikanten of zelfs verzendingen van de dezelfde vervaardiging kunnen variëren in hun gelerend kracht, en zo kan het nodig zijn om het aanpassen van de concentratie van de agar omhoog van de 2,2% hier gebruikt om een optimale gel. We hebben gevonden dat wild type larven gemakkelijk door 3% agar gels kunnen ingraven.
Om aan te tonen van de waarde van deze test, wij zijn gewend het onderzoeken van potentiële weefsel hypoxie in larven met onderdrukte functie van uninflatable in de tracheae. Onze bevindingen sterke ondersteuning biedt voor de hypothese dat verlies van tracheale uitdrukking van dit gen hypoxie produceren kan: btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larven blijkt ingraven in voedsel en volledige afwezigheid van substraat tunneling tijdens de derde instar. In onze eerdere studies van andere genotypen, we waargenomen dat hypoxie-geïnduceerde verlies van voedsel gravende niet zo volledig verlies van het substraat tunneling en de btl is-Gal4 > UAS –uif RNAi larven studeerde hier op dezelfde manier gedragen. De mislukte tunneling component van deze bepaling biedt daarom de sterkste indicatie van hypoxie.
Hoewel de btl-Gal4 > uif RNAi larven toonde gedrags eigenschappen diagnostische van hypoxie, de gesneden(ue)-Gal4 > UAS –uif RNAi deed niet deze afwijkingen vertonen. De btl en gesneden(ue) stuurprogramma’s worden uitgedrukt in verschillende stadia en in verschillende patronen, binnen het larvale tracheae Gal4. De btl-Gal4 bestuurder wordt uitgedrukt in de trachea systeem beginnen van haar ontwikkeling in embryogenese en verder door het larvale leven. In contrast, Gal4-expressie aan vanaf de gesneden(ue)-Gal4 bestuurder alleen begint aan het einde van embryonaal leven, na de morfogenese van het tracheae, en is beperkt tot de extreme posterieure secties van de dorsale stam, grote longitudinale vaartuigen van De tracheale systeem. UIF knockdown met deze Gal4-lijn mogen daarom niet verlagen voor uif expressie vroeg genoeg of breed genoeg voor de productie van sommige drempel van hypoxie nodig om te activeren het gedrag gemeten in deze test.
Een voorafgaande studie vond dat derde instar-larven blootgesteld aan lage (10%) zuurstofniveaus Toon verminderde groei en vertraagd begin van pupariation 14. De btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larven studeerde hier stapte over naar de derde instar, maar de gevolgen voor hun groei en verpopt tarieven waren meer uitgesproken: zij waren aanzienlijk kleiner dan besturingselementen met weinig vetweefsel onder de epidermis (Figuur 3) en slechts een kleine fractie (~ 10%) geprobeerd pupariation. Deze verschillen stellen voor de btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larven ervaren een grotere mate van hypoxie, omdat uif knockdown in de tracheae was aanwezig tijdens hun hele larvale leven, of omdat het een meer geproduceerd ernstige zuurstof ontbering in derde instar. Hoe verlies van uif functie in de tracheae misschien voorkomen dat zuurstoftransport is onduidelijk op dit punt. De tracheae van de btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larven waarneembaar door de cuticle (Figuur 3), een indicatie dat ze lucht opgenomen en niet tot het punt dat vloeibare vermelding gecompromitteerd functie werden beschadigd waren. Daarom is het formeel mogelijk dat de tracheale schade gemaakt door verlies van uif functie niet uitlokken doet hypoxie maar eerder enkele andere gebrek dat tunneling remt. Voor de genotypen studeerde eerder, vastbesloten wij dat niet-tunnel geassocieerd met verhoogde niveaus van LDH mRNA7, de canonieke indicator van de glycolyse en hypoxie in eind derde instar larven 15 wordt. Dus, definitieve bevestiging van hypoxie voor de btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larven (en larven onderzocht in de toekomst gebruik van deze test) zou betekenen dat RT-PCR voor de beoordeling van LDH mRNA niveaus of gebruik van een commercieel beschikbare indicator om te meten intracellulaire zuurstofniveaus (bijvoorbeeld Zie 16).
The authors have nothing to disclose.
Karen M. Qiang was de 2016-ontvanger van de George J. Schroepfer Research Award aan de Rice University. Fanli Zhou is de ontvanger van een Teaching Fellowship van de Universiteit van de rijst. De diensten van de Bloomington Drosophila voorraad Center, de Harvard reis faciliteit, het Wenen Drosophila Resource Center worden dankbaar erkend.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |