프로토콜 정상적인 대기 산소 수준에서 산소를 발생 하는 초파리 melanogaster 애벌레를 식별 하는 간단한 분석 결과를 설명 합니다. 이 프로토콜에 hypoxic 애벌레를를 겹치는 고기 느린 성장 부진 등을 보여 주는 다른 돌연변이 구별 될 수 있습니다.
동물에 산소 박탈 산소 분포와 방해 하는 내부 조직 손상 또는 낮은 대기 산소 수준에 노출에서 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 산소 감지 뉴런의 탈 선 행동 정상적인 산소 수준 존재 hypoxia-같은 동작을 유도 수 가능. D. melanogaster, 낮은 산소 수준에서 개발 억제 성장 및 느린 동작의 애벌레 단계 동안에 발생합니다. 그러나, 산소 적자의 이러한 설립된 발현 상당히 많은 변이 성장, 스트레스 반응 또는 운동 조절의 고기와 중복. 결과, 현재 아무 분석 결과 돌연변이 나 비정상적인 신경 행동에 의해 유도 된 때 ii) hypoxia-같은 동작에 의해 유도 된 i) 세포 저 산소 증을 식별 하기 위해 사용할 수 있다.
우리는 최근 두 가지 독특한 동작이 D. melanogaster 애벌레 hypoxia의 내부 탐지에 대 한 응답의 정상적인 산소 수준에서 발생 하는 확인 했습니다. 첫째, 모든 단계에서 같은 애벌레 음식 근원에서 멀리 떨어져 straying 종종 음식으로 내 피하. 둘째, 부드러운 층으로 터널링, 방황 3 탈피 단계 동안 일반적으로 발생 하는 완전히 폐지 애벌레 hypoxic 있다면. 여기서 설명 하는 분석 결과 감지 하 여 이러한 동작을 quantitate 설계 및 따라서 내부 손상 보다는 낮은 외부 산소에 의해 유도 된 산소를 감지 하는 방법을 제공 하. 천 층 및 효 모 반죽의 중앙 플러그 분석 결과 접시 애벌레 생활을 통해 동물을 지원 하기 위해 사용 됩니다. 위치와 애벌레의 상태 추적 매일으로 그들은 제 3 먼저 탈피에서 진행 합니다. 방황 단계 천 층으로 터널링의 NIH ImageJ를 사용 하 여 pupation 후 quantitated입니다. 분석 결과 것입니다 결정에 때 hypoxia 돌연변이 표현 형의 구성 요소 값의 되며, 따라서 문제의 유전자의 행동의 가능한 사이트에 대 한 통찰력을 제공.
분자 유전 도구 D. melanogaster 에서 사용할 수 있는 정교한 배열 진화론 보존된 생물 학적 과정의 연구에 대 한 귀중 한 유기 체 게. 주요 분자 응답 산소 가용성을 진화에 걸쳐 보존을 입증 하 고 신호 경로 1,2, 이들의 보편적인 구성 요소에 대 한 통찰력을 생성 하는 D. melanogaster 사전 연구 3,4,,56.
D. melanogaster 애벌레에 감각 신경 기능 해 부 하기 위한 연구의 일환으로, 우리는 정상적인 산소 수준 7에서 조직 저 산소 증에 의해 활성화 될 입증 하는 두 행동 응답 확인. 음식, 뚫으, 이들 중 하나는 매우 Wingrove와 O’Farrell 8보고 낮은 산소 수준에 응답 관련. 두 번째 동작, 후반 3 탈피 단계, 방황 하는 동안 부드러운 층에 터널을 실패 하지 되었습니다 이전 발견 했다로 hypoxia 관련. 우리는 7, 터널링 하는 층을 억제 또한 낮은 산소 수준에 야생 타입 방황 애벌레를 노출 따라서 모두 hypoxia에서 발생 한 이러한 행동-중 유도 조직 손상 또는 낮은 산소 섭취 수준 수립 결정. 여기는 관측 애벌레 부 화 후 즉시 시작 되 분석 결과 우리는이 두 hypoxia 유발 행동을 quantitate를 개발에 대해 설명 합니다.
초기 애벌레 단계에 있는 hypoxic 응답 이전 검사 하지는 및 따라서 애벌레 생활 내내 분석을 수행 하는 것입니다 우리의 분석 결과의 중요 한 구성 요소. -느린 개발, 불 쌍 한 성장, 및 운동 부진-저 산소 증의 확실 한 발현의 대부분 겹칠 애벌레 고기 많은 돌연변이 의해 생산. 하지만 우리 hypoxia로만 세 번째 탈피 애벌레 터널 7완전 한 실패 보여 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 심지어 애벌레 우리의 hypoxic 애벌레 보다 더 성장 및 운동 손상, 여전히 수행 몇 가지 터널링 hypoxic 애벌레는 결코 7터널링 반면 결정. 이 분석 결과의 또 다른 중요 한 요소가입니다 따라서 때 산소는 다 면 발현 성 고기 몇 가지 다른 스트레스 나 변화 고장 아닌 특정 집합의 소스를 설정 하는 방법을 제공 합니다. 분석 결과의 데모, 여기 우리가 특성화의 감소 tracheal 식이 애벌레의 응답에 사용 설명 uninflatable, 애벌레 항공 9에서 작동 하는 유전자.
우리는이 분석 결과 가난한 성장 및 느린 동작을 포함 하는 애벌레 고기 특성화에 종사 하는 연구자에 게 가치가 있을 것입니다 정시. 결과, 유통, 사용, 또는, 응답을 좌우 하는 새로운 유전자를 몸 전체에 산소 수 식별 합니다. 추가, 프로토콜을 차단 하는 돌연변이에이 분석 결과 통합 산소를 생산 하는 돌연변이 확인 하는 직접적인 경로 제공할 것 이다. 이 분석 결과 또한 여기에 설명 된 hypoxia 유발 타고 난 행동 elicits 회로 분석에 귀중 한 것입니다. 이러한 종류의 신경 네트워크 분석은 많은 현재 연구의 초점 고 D. melanogaster 유 충의 간단한 신경 시스템은 자동화 된 동작 개 해 부에 대 한 중요 한 시스템. 감각 뉴런 애벌레 산소 인식에 관련 된 이미 확인 되었습니다, hypoxia 유발 응답 10,11에 대 한 완전 한 회로 정의 향한 첫 번째 단계를 제공 하. 우리의 분석 결과 사용 하 여 선택적 신경 최저 GAL4 UAS 시스템12 을 통해 함께 묘사 또한 신경 네트워크의 구성 요소에 대 한 명확한 경로입니다.
우리 여기에 D. melanogaster 애벌레 조직 hypoxia을 감지 하도록 설계 된 간단한 분석 결과 제시 했습니다. 진단 초기 애벌레 생활 및 애벌레 생활에서 늦게 터널링 하는 층의 부재에 음식 고 분으로 감소 내 기반으로 합니다. 애벌레 크롤 링 음식 소스에서 조 마이그레이션을 발생할 수 있으며 따라서 분석 결과의 하나의 중요 한 측면은 적은 수 애벌레의 큰 초과 음식 존재 분석 됩니다. 균 메 틸-p hydroxyl benzoate (Nipagen)의 한 천 배지를 포함 분석 결과 중 곰 팡이 성장을 방지 하기 위해 필수적 이기도 합니다.
보면 한 천 배지 분석 결과 있는 가변성의 원천이 될 수 있습니다. 일반적으로, 애벌레, 애벌레의 다른 컬렉션 또는 부모의 다른 배치에서 동일한 유전자의 분석 결과에 그들의 행동에 비교적 제한 된 변화를 보여줍니다. 반면, 한 천 배지 또는 다른 일에 만들어진 agar의 다른 배치와 터널링에 차이 얻을 수 있습니다. 한 규정 따라서 제어 하 고 실험적인 애벌레 모두 테스트 해야 동일한 배치 준비에서 한 천 배지를 사용 하 여. 다른 제조 업체에서 한 천 또는 동일한 제조에서 심지어 출하 고 그들의 힘에 다를 수 있습니다 하 고 그래서 여기 최적의 젤을 달성 하는 데 사용 하는 2.2%에서 위쪽으로 agar 농도 조정 해야 할 수 있습니다. 우리는 야생 타입 애벌레 3% 한 천 젤을 통해 쉽게 뚫 수 있습니다 나타났습니다.
이 분석 결과의 가치를 입증, 우리는 그것를 사용의 억제 기능을 가진 애벌레에 잠재적인 조직 hypoxia 조사 uninflatable . 기관에 우리의 발견이이 유전자의 tracheal 식의 손실 산소를 생산할 수 있는 가설에 대 한 강력한 지원을 제공: btl-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 음식과 층 동안 터널링의 완전 한 부재에 뚫으 보여 세 번째 탈피입니다. 우리의 이전 연구에서 다른 genotypes의, 우리는 hypoxia 유발 손실 음식 내 층 터널링의 손실 및 btl로 완전 하지 않습니다 관찰-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 공부 여기 유사 하 게 행동. 이 분석 결과의 실패 한 터널링 구성 요소는 그러므로 산소의 강한 표시를 제공 한다.
비록 btl-Gal4 > uif RNAi 애벌레 행동 특성을 보였다는 잘라(ue) 저 산소 증의 진단-Gal4 > UAS-uif RNAi이이 이상이 전시 하지 않았다. Btl 고 잘라(ue) Gal4 드라이버 다른 단계에서 그리고 애벌레 기관 내 다른 패턴에 표시 됩니다. Btl-Gal4 드라이버 embryogenesis에 그것의 개발에서 시작 하 고 애벌레 생활을 통해 계속 tracheal 시스템을 통해 표현 된다. 반면,는 잘라(ue)에서 Gal4 식-Gal4 드라이버만 한다의 morphogenesis 후 미 발달 생활의 끝에 시작 하 고 지 느 러 미 줄기의 주요 경도 혈관의 극단적인 후부 섹션으로 제한 됩니다 tracheal 시스템입니다. uif 최저 Gal4 줄으로 줄일 수 없습니다 따라서 uif 식 일찍 충분히 또는 광범위 하 게 동작을 실행 하는 데 필요한 산소의 일부 임계값을 생성 하기에 충분이 분석 결과 측정.
이전 연구 3 탈피 애벌레 (10%) 산소의 저급에 노출 감소 성장을 보여을 발견 하 고 pupariation 14의 발병을 지연. Btl-Gal4 > 세 번째 탈피에 UAS-uif RNAi 애벌레 여기 공부 진행 하지만 그들의 성장과 pupation 요금에 효과 더 발음 했다: 그들은 컨트롤과 아래 아주 작은 지방 조직 보다 상당히 작은 표 (그림 3) 피와 유일한 작은 분수 (~ 10%)는 pupariation을 시도 했다. 이 차이 제안 btl-Gal4 > uif 최저는 기관에 그들의 전체 애벌레 생활 내내 존재 했다 또는 그것을 더 생산 하기 때문에 UAS-uif RNAi 애벌레 hypoxia의 훌륭한 정도 경험 세 번째 탈피에 심각한 산소 박탈 합니다. 어떻게 uif 함수는 기관에서의 손실 되지 않도록 산소 운반은 불분명이 시점에서. Btl의 기관-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 표 피 (그림 3), 그들은 공기를 포함 하 고 액체 항목 기능 손상 지점 손상 되지 했다 표시를 통해 쉽게 볼 수 있었다. 그것은 공식적으로 가능한 그러므로 uif 기능의 손실에 의해 만들어진 tracheal 손상 hypoxia 하지만 오히려 몇 가지 다른 결함 억제 터널링을 유도 하지 않는. Genotypes 이전 공부, 우리가 늦은 제 3 탈피 애벌레 15에 터널 실패는 LDH mRNA7의 높은 수준, 분해 하 고 산소의 정식 표시기와 관련 된 결정. Btl에 대 한 산소의 따라서, 최종 확인-Gal4 > UAS-uif RNAi 애벌레 (와 나중에 검사 하는 애벌레에서이 분석 결과의 사용) RT-PCR LDH mRNA 수준 또는 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 표시기의 사용을 평가 하기 위해 포함 세포내 산소 수준 (예를 들어 참조 16).
The authors have nothing to disclose.
카 렌 M. 창족의 라이스 대학에 조지 J. Schroepfer 연구 수상 2016 받는 했다. Fanli 주 라이스 대학에서 가르치는 화목의 받는 사람입니다. 블루밍턴 초파리 재고 센터, 하버드 여행 시설 서비스 비엔나 초파리 리소스 센터는 기꺼이 인정 했다.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |