Protokollet beskrivs ett enkelt test för att identifiera Drosophila melanogaster larver som upplever hypoxi under normala atmosfäriskt syrenivåer. Detta protokoll tillåter hypoxisk larverna skiljas från andra mutanter som visar överlappande fenotyper som tröghet eller långsam tillväxt.
Syrebrist hos djur kan resultera från exponering för lågt atmosfäriskt syrenivåer eller intern vävnadsskador som stör syre distribution. Det är också möjligt att avvikande beteende av syre-sensing nervceller kunde framkalla hypoxi-liknande beteende i närvaro av normala syrehalten. I D. melanogaster, utveckling på låga syrenivåer resulterar i hämning av tillväxt och trög beteende under larval faser. Dessa etablerade manifestationer av syrebrist överlappar dock avsevärt på fenotyperna av många mutationer som reglerar tillväxt, stressreaktioner eller locomotion. Som resultat finns det för närvarande inga tillgängliga för att identifiera i) cellulär hypoxi orsakas av en mutation eller ii) hypoxi-liknande beteende när induceras av onormalt neuronala beteende analys.
Vi har nyligen identifierat två distinkta beteenden i D. melanogaster larver som inträffar vid normala syrehalten i svar till interna upptäckt av hypoxi. Först, i alla skeden undvika sådana larver gräva in mat, ofta herrelösa långt bort från en näringskälla. Det andra avskaffas tunnel in i en mjuk underskikt som normalt inträffar under vandrande tredje instar scenen helt om larverna är hypoxisk. Den analysmetod som beskrivs här är utformad för att upptäcka och kvantifiera dessa beteenden och därmed ge ett sätt att upptäcka hypoxi som induceras av inre skador i stället för låg extern syre. Assay plattor med en agar underskikt och en centrala pluggen av jäst pasta används för att stödja djur genom larval livet. Positioner och delstaten larverna spåras dagligen när de går vidare från första till tredje instar. Omfattningen av tunneling in den agar underskikt under vandrande fasen är quantitated efter förpuppningen använder NIH ImageJ. Analysen kommer att vara av värde för att avgöra när hypoxi är en komponent av en mutant fenotyp och därmed ge inblick i möjliga platser för åtgärd av genen i fråga.
Det sofistikerade utbudet av molekylära genetiska verktyg tillgängliga i D. melanogaster gör det en värdefull organism för att studera evolutionärt bevarade biologiska processer. Viktiga molekylära Svaren till syre tillgänglighet har visat sig vara bevarad över evolution och tidigare studier i D. melanogaster har genererat insikter i de universella komponenterna av dessa signalering vägar 1,2, 3,4,5,6.
Som en del av en studie som syftar till att dissekera sensoriska neuron funktion i D. melanogaster larver, identifierade vi två beteendemässiga svar som visade sig bli aktiverat vid hypoxi på normala syre nivåer 7. En av dessa, underlåtenhet att burrow i mat, är starkt relaterat till låga syrenivåer som rapporterats av Wingrove och O’Farrell 8svar. Det andra beteendet, misslyckande till tunnel i en mjuk underskikt under den sena tredje instar vandrande fas, hade inte tidigare identifierats som hypoxi-relaterade. Vi fast beslutna att utsätta vildtyp vandrande larver till låga syrenivåer också hämmar underskikt tunneling 7, således upprättande att båda dessa beteenden kommer från hypoxi – antingen inducerad av vävnadsskada eller av låga syrenivåer intag. Här beskriver vi ett test som vi utvecklat för att kvantifiera dessa två hypoxi-inducerad beteenden, som börjar med observationer omedelbart efter larver kläckning.
Hypoxisk Svaren larval tidigt inte har granskats tidigare och därför utföra en analys hela larval liv är en värdefull del av vår analys. De flesta av de uppenbara manifestationerna av hypoxi – långsam utveckling, dålig tillväxt och rörelseapparaten tröghet – överlappar larval fenotyper produceras av många mutationer. Men vi har funnit att endast tredje instar larver med hypoxi visar ett fullständigt misslyckande till tunnel 7. Således är vi fast beslutna att även larver mer äventyras när det gäller tillväxt och locomotion än våra hypoxisk larver, fortfarande utförs vissa tunnel, medan hypoxisk larver aldrig tunneled 7. Ett annat värdefullt inslag i denna analys är således att det ger ett sätt att fastställa när hypoxi är källan till en viss uppsättning pleiotropiska fenotyper, i motsats till vissa andra stress eller metaboliska fel. Som en demonstration av analysen, här beskriver vi dess användning i kännetecknar Svaren av larver med reducerad luftrör uttryck för uninflatable, en gen som fungerar i larval airways 9.
Vi tänker oss att denna analys kommer att vara av värde för forskare bedriver kännetecknar larval fenotyper som inkluderar dålig tillväxt och trög beteende. Som ett resultat av nya gener som påverkar den distribution, användning eller svar till, kunde syre i hela kroppen identifieras. Ytterligare, införliva denna analys i en mutant som screening protokoll skulle ge en direktlinje till identifiera mutationer som producerar hypoxi. Denna analys kommer också vara värdefulla i att analysera de kretsar som framkallar de hypoxi-inducerad medfödda beteenden som beskrivs här. Neurala nätverksanalys av denna typ är ett fokus på mycket aktuell forskning och enkel nervsystemet av D. melanogaster larven är ett värdefullt system för dissekera ut automatiserade beteenden. Sensoriska nervceller inblandade i larval syre perception har redan identifierats, tillhandahåller ett första steg mot att definiera den kompletta kretsen för hypoxi-inducerad Svaren 10,11. Med vår analys i kombination med selektiv neurala knockdown via de GAL4-UAS system12 är en tydlig väg för avgränsar ytterligare komponenter av neurala nätverk.
Här har vi presenterat en enkel analys för att upptäcka hypoxi i D. melanogaster larver. Diagnosen bygger på minskad grävande i mat högar i larval uppväxt och avsaknad av underskikt tunneling sent i larval livet. Larval trängsel kan orsaka för tidig migrering från en näringskälla och således en kritisk aspekt av analysen är att ett litet antal larver är analyseras i närvaro av ett stort överskott mat. Införlivandet av de fungicid metyl-p hydroxyl bensoat (Nipagen) i agarplattor är också viktigt att förhindra mögeltillväxt under analysen.
Vi tycker att agarplattor kan vara en källa till variation i analysen. Larver av samma genotyp, från olika partier av föräldrar eller från olika samlingar av larver, visar vanligtvis, relativt begränsad variant i deras beteende i analysen. Däremot agarplattor gjort på olika dagar eller med olika partier av agar kan ge skillnader i tunnel. En bestämmelse är därför att kontrollen och experimentella larver ska alla testas med agarplattor från samma batch förberedelse. Agar från olika tillverkare eller även leveranser från samma tillverkning kan variera i deras gelbildande styrka, och så kan det vara nödvändigt att justera agar koncentrationen uppåt från den 2,2% används här för att uppnå en optimal gel. Vi har funnit att vildtyp larver kan lätt håla genom 3% agar geler.
För att påvisa värdet av denna analys, vi har använt det för att undersöka potentiella hypoxi i larver med undertryckta funktion av uninflatable i luftstrupar. Våra resultat ger starkt stöd för hypotesen att förlust av luftrör uttryck för denna gen kan producera hypoxi: btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver visade underlåtenhet att håla till livsmedels- och total avsaknad av underskikt tunnel under den tredje instar. I våra tidigare studier av andra genotyper har vi observerat att hypoxi-inducerad förlust av mat grävande inte är så fullständig som förlust av underskikt tunnlar och den btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver studerat här betedde sig på samma sätt. Den misslyckade tunneling komponenten i denna analys ger därför den starkaste indikationen av hypoxi.
Även om den btl-Gal4 > uif RNAi larver visade beteendemässiga egenskaper diagnostik av hypoxi, den skär(ue)-Gal4 > UAS –uif RNAi inte uppvisar dessa abnormiteter. Den btl och skär(ue), Gal4 drivkrafter uttrycks i olika skeden och i olika mönster, inom de larval luftstrupar. Den btl-Gal4 driver uttrycks i hela luftrör systemet start från dess utveckling i embryogenes och fortsätter genom larval liv. I kontrast, Gal4 uttryck från den skära(ue)-Gal4 driver bara börjar i slutet av embryonala liv, efter morfogenes av luftstrupar, och är begränsad till de extrema bakre delarna av dorsala stammarna, stora longitudinella fartyg trakeal systemet. UIF knockdown med denna Gal4 kan därför inte minska uif uttryck tillräckligt tidigt eller brett nog för att ge vissa tröskelnivå för hypoxi som krävs för att utlösa beteenden mätt i denna analys.
En tidigare studie fann att tredje instar larverna utsätts för låga (10%) oxygen nivåer visar minskad tillväxt och fördröjd debut av pupariation 14. Den btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver studerat här utvecklats till den tredje instar men effekterna på deras tillväxt och förpuppningen priser var mer uttalade: de var betydligt mindre än kontroller med mycket lite fettvävnaden under den försökte pupariation epidermis (figur 3) och endast en mindre del (~ 10%). Dessa skillnader tyder på btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver upplevt en ökad grad av hypoxi, eftersom uif knockdown i luftstrupar fanns runtom hela larval livet eller eftersom det produceras mer svår syrebrist i tredje instar. Hur uif funktionsförlust i luftstrupar kan hindra syretransporten är oklart i nuläget. Luftstrupar av den btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver var synlig genom nagelbanden (figur 3), en indikation att de innehöll luft och skadades inte till den punkt att vätska posten äventyras funktionen. Det är därför formellt möjligt att luftrör skadan skapad av förlust av uif funktion inte framkalla hypoxi men hellre några andra fel som hämmar tunneling. För de genotyper som studerat tidigare, vi fast beslutna att underlåtenhet att tunnel är förknippad med förhöjda nivåer av LDH mRNA7, den kanoniska indikatorn på glykolys och hypoxi i sena tredje instar larver 15. Således, slutlig bekräftelse av hypoxi för den btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larver (och i larver granskas i framtiden utnyttja denna analys) skulle innebära RT-PCR för att bedöma LDH mRNA nivåer eller användning av ett kommersiellt tillgängliga indikatorn för att mäta intracellulära syrenivåer (till exempel se 16).
The authors have nothing to disclose.
Karen M. Qiang var 2016 mottagare av utmärkelsen George J. Schroepfer forskning vid Rice University. Fanli Zhou är mottagare av en undervisning stipendium från Rice University. Tjänster av stadens Bloomington Drosophila lager, Harvard resa anläggningen, Wien Drosophila Resource Center är erkänt tacksamt.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |