Este protocolo centra-se na análise quantitativa de complexidade arborização dendrítica neuronal (NDAC) em Drosophila, que pode ser usado para estudos da morfogênese dendrítica.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
Dentritos são as projeções ramificadas de um neurônio, e morfologia dendrítica reflete organização sináptica durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Drosófila larval neuronal dendrítica arborização (da) é um modelo ideal para o estudo de morfogênese de dendrites neurais e função dos genes no desenvolvimento do sistema nervoso. Existem quatro classes de neurônios da. Classe IV é a mais complexa, com um padrão de ramificação que cobre quase toda a área da parede do corpo larval. Nós anteriormente têm caracterizado o efeito de silenciamento da Drosophila ortholog de SOX5 na classe de complexidade de arborização dendrítica neuronal de IV (NDAC) usando quatro parâmetros: o comprimento de dendrites, a área de superfície de cobertura dendrito, o número total de galhos e a estrutura de ramificação. Este protocolo apresenta o fluxo de trabalho de análise quantitativa NDAC, consistindo de dissecação larval, microscopia confocal e procedimentos de análise de imagem usando o software ImageJ. Mais introspecção da desenvolvimento neuronal e seus mecanismos subjacentes irá melhorar a compreensão da função neuronal e fornecem pistas sobre as causas fundamentais da neurológicas e transtornos do desenvolvimento neurológico.
Introdução
Dendrites, que são as projeções ramificadas de um neurônio, cobrem o campo que engloba do neurônio sensorial e sináptica insumos de outros neurônios1,2. Dendritos são um componente importante da formação de sinapse e desempenham um papel fundamental na integração de entradas synaptic, bem como a propagação do estímulo eletroquímico em um neurônio. Arborização dendrítica (da) é um processo pelo qual os neurônios formam novas árvores dendríticas e galhos para criar novas sinapses. O desenvolvimento e a morfologia da da, tais como a densidade de ramo e padrões de agrupamento, resultam de processos biológicos de v....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. preparação experimental
- Preparem-se os seguintes reagentes: tampão fosfato de Dulbecco salino (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeído (PFA), diluído em 4% antes do uso; base de elastômero de silicone e agente de cura; meio de montagem antidesgaste (por exemplo, prolongar a ouro); e unha polonês.
- Preparar os seguintes equipamentos: microscópio de dissecação, dois afiada fórceps e um par de tesouras para microdissection, um número de pinos para microdissection, uma placa de Petri para fazer o prato de dissecação, corrediças do microscópio e lamelas, um microscópio confocal e um computador com software....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os dendritos dos neurônios da foram rotulados por co-superexpressão GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) no da soma neural e dendríticas mandris para fluorescência de GFP, análise de imagem. A morfologia dos dendritos do neurônio da foi fotografada por um microscópio confocal invertido (Figura 2).
Os dendritos dos neurônios da foram rastreados usando software ImageJ Fiji. O arquivo foi usado para estimar o compr.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Dendritos que inervam a epiderme são as regiões de entrada dos neurônios, e suas morfologias determinam como a informação é recebida e processada pelos neurônios individuais. Morfologia do dendrito de desenvolvimento reflete a modulação de gene da organização dendrito. Larval da drosófila neurônio do sistema nervoso periférico é um modelo importante para estudar o desenvolvimento dendrito por causa de: 1) a similaridade funcional com mamíferos11,12; 2) q.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer William A. Eimer para assistência técnica de imagem. Este trabalho foi financiado pelo fundo a cura a doença de Alzheimer [a R.E.T], o Instituto Nacional de saúde [R01AG014713 e R01MH60009 para R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 para A.L.] e a National Science Foundation [NSF1455613 para A.L.].
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina tamponada com fosfato(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldeído(PFA) | Microscopia Eletrônica Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 base de elastômero de silicone e agente de cura | Dow Corning Corportation | 3097366-0516; 3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Esmalte para unhas | CVS | 72180 | |
| Microscópio estéreo | Nikon | SMZ800 | |
| Microscópio confocal | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Placa de Petri | Fórceps | Falcon 353001 | |
| Dumont | 11255-20 | ||
| Tesoura | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Alfinetes de Insetos | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Lâminas de microscópio e lamínulas | Fisher Scientific | 15-188-52 |
Referências
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K.,....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
