Summary
यह प्रोटोकॉल Drosophilaमें न्यूरॉन वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) के मात्रात्मक विश्लेषण पर केंद्रित है, जिसका इस्तेमाल वृक्ष morphogenesis के अध्ययन के लिए किया जा सकता है ।
Abstract
Dendrites एक ंयूरॉन के शाखाई अनुमानों हैं, और वृक्ष आकृति विज्ञान तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान synaptic संगठन को दर्शाता है । Drosophila लार्वा न्यूरॉन वृक्ष arborization (डीए) तंत्रिका तंत्र के विकास में तंत्रिका morphogenesis और जीन समारोह के dendrites अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है. डीए न्यूरॉन्स की चार कक्षाएं हैं । चतुर्थ श्रेणी के एक शाखाकरण पैटर्न है कि लार्वा शरीर की दीवार के लगभग पूरे क्षेत्र को कवर के साथ सबसे जटिल है । हम पहले के प्रभाव की विशेषता है मुंह बंद करने के Drosophila ortholog पर SOX5 की कक्षा चतुर्थ न्यूरॉनी वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) का उपयोग कर चार पैरामीटर: dendrites की लंबाई, dendrite कवरेज की सतह क्षेत्र, शाखाओं की कुल संख्या, और शाखाकरण संरचना । इस प्रोटोकॉल NDAC मात्रात्मक विश्लेषण के कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है, लार्वा विच्छेदन, फोकल माइक्रोस्कोपी से मिलकर, और छवि विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रक्रियाओं । इसके अलावा दा ंयूरॉन विकास और उसके अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि और न्यूरॉन्स की समझ में सुधार होगा कार्य और स्नायविक और neurodevelopmental विकारों के बुनियादी कारणों के बारे में सुराग प्रदान करते हैं ।
Introduction
Dendrites, जो एक ंयूरॉन के शाखाई अनुमानों रहे हैं, क्षेत्र है कि ंयूरॉन संवेदी और अंय ंयूरॉंस से synaptic जानकारी शामिल कवर1,2। Dendrites synapse गठन के एक महत्वपूर्ण घटक है और synaptic आदानों को एकीकृत करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, साथ ही साथ एक ंयूरॉन में विद्युत उत्तेजना का प्रचार । वृक्ष arborization (da) एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा न्यूरॉन्स नए वृक्ष पेड़ और शाखाओं के रूप में नए synapses बनाने के लिए फार्म. इस तरह के शाखा घनत्व और समूहीकरण पैटर्न के रूप में दा, के विकास और आकृति विज्ञान, बहु कदम जैविक प्रक्रियाओं से परिणाम और उच्च ंयूरॉन समारोह के लिए संबंधित हैं । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य Drosophila में न्यूरॉन dendritric arborization जटिलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करना है .
dendrites की जटिलता synaptic प्रकार, कनेक्टिविटी, और भागीदार ंयूरॉंस से आदानों निर्धारित करता है । पैटर्न शाखाकरण और dendrites के घनत्व संकेत है कि वृक्ष क्षेत्र3,4पर एकाग्र प्रसंस्करण में शामिल हैं । Dendrites विकास में समायोजन के लिए लचीलापन है । उदाहरण के लिए, synaptic संकेतन विकासात्मक चरण के दौरान और परिपक्व तंत्रिका प्रणाली5में somatosensory ंयूरॉन में dendrite संगठन पर एक प्रभाव है । न्यूरॉन कनेक्टिविटी की स्थापना morphogenesis और dendrites की परिपक्वता पर निर्भर करता है । dendrites की कुरूपता बिगड़ा ंयूरॉन समारोह के साथ जुड़ा हुआ है । अध्ययनों से पता चला है कि दा न्यूरॉन morphogenesis की विषमता कई neurodegenerative रोगों के etiologies में योगदान दे सकती है, जिनमें अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington की बीमारी (एचडी), और लो Gehrig की बीमारी/ पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS)६,७,८. Synaptic परिवर्तन विज्ञापन के प्रारंभिक चरण में दिखाई देते हैं, संगीत समारोह में गिरावट और हानि के साथ ंयूरॉन7,8। हालांकि, इन neurodegenerative रोगों में रोगजनन के लिए कैसे dendrite विकृति योगदान के विशिष्ट मायावी रहता है ।
dendrites के विकास के जीन है कि नियामकों के एक जटिल नेटवर्क में सांकेतिक शब्दों में बदलना,9प्रोटीन के Wnt परिवार के रूप में,10, प्रतिलेखन कारकों, और सेल सतह रिसेप्टर्स11,12 पर लाइगैंडों द्वारा विनियमित है . Drosophila दा न्यूरॉन्स चार वर्गों (वर्ग मैं, द्वितीय III, iv) से मिलकर बनता है, जो कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स सबसे जटिल बंटी पैटर्न है और बेहतर समझ के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में नियोजित किया गया है13morphogenesis, 14. प्रारंभिक morphogenesis के दौरान, कम से कम और/या RNAi मुंह बंद करने वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन्स में जीन का परिणाम शाखाओं में बंटी पैटर्न में परिवर्तन और dendrite13छंटाई. यह ंयूरॉन वृक्ष arborization के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
हम पहले से पता चला है कि मुंह बंद करने के Drosophila ortholog के SOX5, Sox102F, कम से कम dendrites के नेतृत्व में डा न्यूरॉन्स और कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स में कमी जटिलता15. यहां, हम Drosophilaमें ंयूरॉन वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) के लिए मात्रात्मक विश्लेषण की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल, पिछले वर्णित पद्धति से अनुकूलित, एक संक्षिप्त विधि प्रदान करता है परख के विकास के लिए संवेदी ंयूरॉंस । यह मजबूत छवि लेबलिंग और तीसरी instar लार्वा शरीर की दीवार16,17,18,19में दा ंयूरॉन दिखाता है । वीवो मेंNDAC और विकासात्मक मतभेदों की जांच की चाहत रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए यह एक बहुमूल्य प्रोटोकॉल है ।
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Protocol
1. प्रायोगिक तैयारी
- निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें: Dulbecco के फास्फेट बफर खारा (पंजाब); ट्राइटन X-१००; ०.२% PBST (पंजाब + ०.२% ट्राइटन X-१००); ३२% paraformaldehyde (पीएफए), उपयोग करने से पहले 4% में पतला; सिलिकॉन elastomer बेस और इलाज एजेंट; antifade बढ़ते मध्यम (जैसे, लम्बा सोना); और नख पॉलिश.
- निंनलिखित उपकरण तैयार करें: विच्छेदन माइक्रोस्कोप, दो तेज संदंश और microdissection के लिए कैंची की एक जोड़ी, microdissection के लिए पिन की एक संख्या, विच्छेदन पकवान, माइक्रोस्कोप स्लाइड और coverslips, एक फोकल माइक्रोस्कोप बनाने के लिए एक पेट्री डिश, और एक फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर स्थापित के साथ कंप्यूटर ।
2. लार्वा संग्रह
- मेट यूएएस-Sox102F-RNAi यूएएस के साथ मक्खियों-GFP, ppk-GAL4, या डब्ल्यू१११८ जंगली प्रकार मक्खियों, क्रमशः । संस्कृति 25 डिग्री सेल्सियस पर मानक शर्तों में मक्खियों ।
- ~ 5-6 दिनों में, यूएएस-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4, यूएएस-GFP या यूएएस-GFP, और ppk-GAL4 के तीसरे instar लार्वा एकत्र करें और विच्छेदन के लिए संदंश के साथ नियंत्रण सावधानीपूर्वक करें ।
3. लार्वा का विच्छेदन
नोट: इस खंड में सभी प्रक्रियाओं एक microdissection माइक्रोस्कोप के तहत संचालित कर रहे हैं । आवर्धन जांचकर्ताओं तक है । इष्टतम दृष्टि देखने के लिए समायोजित करने के लिए प्रयास करें । ~ 4-6X आवर्धन की सिफारिश की है ।
- सिलिकॉन elastomer बेस और एक टिशू कल्चर पेट्री डिश से बने एक विच्छेदन डिश पर एक लार्वा रखें ।
- लार्वा मुंह हुक पिन पृष्ठीय पक्ष की अनुमति के लिए ऊपर का सामना करने के लिए, और फिर लार्वा की पूंछ पिन । midline को बेनकाब करने के लिए जितना संभव हो बीच में पृष्ठीय पक्ष रखें, जो खुले मार्कर होगा ।
- लार्वा को पंजाब के २०० µ एल जोड़ें शरीर की नमी बनाए रखने के लिए ।
- दो tracheas के बीच पृष्ठीय midline साथ कैंची की एक जोड़ी के साथ एक कट बनाओ, caudal से rostral के लिए । लार्वा शरीर के चार कोनों में से प्रत्येक पर एक छोटी सी कटौती करें ।
- शरीर के चार कोनों में से प्रत्येक पर एक पिन रखें ताकि शरीर फ्लैट झूठ ।
- कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए 4% पीएफए में लार्वा शरीर की दीवार को ठीक करें ।
- 5 मिनट के लिए PBST में धो दो बार और अधिक दोहराएं ।
- ऊतक से पिन निकालें । तो एक गिलास स्लाइड पर ऊतक हस्तांतरण, antifade बढ़ते माध्यम के साथ कवर, और एक कवर पर्ची के साथ माउंट । 1 घंटे के लिए हवा सूखी और नाखून पोलिश के साथ किनारों सील ।
4. इमेजिंग प्रोसेसिंग
नोट: छवियां एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर लिया गया । उपयोगकर्ता एक 20X उद्देश्य (अनुशंसित) का उपयोग कर नमूना तस्वीर कर सकते हैं ।
- Z-श्रृंखला छवियों पर कब्जा । फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में "कब्जा Z-श्रृंखला" संवाद बॉक्स खोलें । Z श्रृंखला छवियों पर कब्जा करने के लिए सीमा का निर्धारण ।
- "ऊपर और नीचे" बटन पर क्लिक करें । ऊपर और नीचे की स्थिति और इनपुट के लिए मान निर्धारित करें "नीचे:" और "शीर्ष:" बक्से । सेट "चरण" में "Z-श्रृंखला कैप्चर करें" संवाद बॉक्स के रूप में ०.५ µm । फिर Z-श्रृंखला छवियां प्राप्त करने के लिए "अब चलाएं" बटन क्लिक करें ।
- प्राप्त छवियों *. tiff या *. nd2 फ़ाइलों के रूप में सहेजें ।
- इमेजिंग के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे धारक में स्लाइड स्टोर ।
5. Dendrite मूल्यांकन
नोट: GFP प्रोटीन सह यूएएस-GFP में व्यक्त किया गया था और ppk-GAL4 GFP प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण के लिए दा ंयूरॉंस में मक्खियों । थर्ड instar लार्वा में डीए न्यूरॉन्स की लंबाई, ब्रांचिंग और स्ट्रक्चर को quantified गया था । विश्लेषण पैरामीटर्स में dendrites की लंबाई (µm), सतह क्षेत्र (µm2), शाखाओं की कुल संख्या, और शाखाकरण संरचना (%) चित्र 1 विश्लेषण पैरामीटर्स को विस्तार से दिखाता है ।
-
Dendrites की लंबाई
नोट: dendrites की लंबाई सभी अनुरेखक प्लगइन में लेबल dendrites का योग है.- सेटअप और भागो फिजी ImageJ (https://fiji.sc/)20 सॉफ्टवेयर । छवियों के कई चैनलों रहे हैं तो फिर, अलग चैनलों में छवियों को विभाजित.
नोट: इस प्रोटोकॉल में छवि केवल GFP का एक चैनल है । - भागो "छवि । पोट | जेड परियोजना "एक जेड प्रक्षेपण पाने के लिए; ' Z-प्रोजेक्शन ' नाम से एक नई विंडो दिखाई देगी । प्रक्षेपण के प्रकार के लिए "अधिकतम तीव्रता" पर क्लिक करें, और व्यक्तिगत वरीयताओं पर निर्भर करता है शुरू टुकड़ा और बंद करो स्लाइस के बीच संख्या का आयोजन । क्लिक करें "ठीक है." एक Z-प्रक्षेपण छवि स्पष्ट रूप से dendrite प्रक्षेपण पेश दिखाई देगा ।
- ट्रेस neurites ।
- चुनें "Plugins । फॉल्ट | सरल Neurites अनुरेखक "विंडो में dendrites का पता लगाने के लिए. ंयूरॉन सोमा खोजें, और फिर एक बिंदु पर क्लिक करें एक dendrite से शुरू सेल शरीर, और इस dendrite की नोक पर एक और बात ।
नोट: कार्यक्रम एक नीली रेखा के साथ दो अंक कनेक्ट करेगा । - पथ स्पष्ट है, तो प्लग-इन विंडो में "Y" दबाएँ; dendrite पथ दृश्य छवियों में चयनित पथ के अंतिमबिंदु तक traced है । एक ही प्लगइन विंडो पर "पूरा पथ" पर क्लिक करें; खंड (चित्रा 2) पूरा हो गया है ।
नोट: कुछ dendrites शुरू अंक, जिसमें मार्ग छोटे क्षेत्रों में विभाजित किया गया था से आगे समाप्त हो गया । खंड अनुरेखक के लिए एक पूर्ण पथ प्रदान करने के लिए संयुक्त थे.
- चुनें "Plugins । फॉल्ट | सरल Neurites अनुरेखक "विंडो में dendrites का पता लगाने के लिए. ंयूरॉन सोमा खोजें, और फिर एक बिंदु पर क्लिक करें एक dendrite से शुरू सेल शरीर, और इस dendrite की नोक पर एक और बात ।
- कोई पथ पूर्ण होने के बाद, एक नए बिंदु पर वापस जाएं जहां शाखाएं हैं । नए रास्ते पर बनाया जा सकता है; "सभी रास्तों" खिड़की बॉक्स दिखाएगा सभी रास्तों की लंबाई मूल्यों (चित्रा 3) । ट्रेसिंग फ़ाइल सहेजें, और चित्र 2में दिखाए गए के रूप में अपूर्ण ट्रैस के साथ जारी रखें ।
- क्लिक करके dendrite लंबाई डेटा निर्यात, "फ़ाइल । ' प्लगइन विंडो में *. सीवी ' के रूप में निर्यात करें । फिर सभी पथ लंबाई का योग करें, और डेटा को एक डेटा विश्लेषण/स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में निर्यात करें । (चित्रा 3) ।
- सेटअप और भागो फिजी ImageJ (https://fiji.sc/)20 सॉफ्टवेयर । छवियों के कई चैनलों रहे हैं तो फिर, अलग चैनलों में छवियों को विभाजित.
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दा न्यूरॉन्स की सतह क्षेत्र
- ' फ़िजी का ImageJ ' विंडो में मुक्तहस्त आरेखण उपकरण का चयन करें । पथ का पता लगाएँ, और उसके बाद अंतिमबिंदु से कनेक्ट करें । ' विश्लेषण ' मेनू से, का चयन करें "माप सेट । क्षेत्र. " ' विश्लेषण ' मेनू से "माप" पर क्लिक करें. परिणाम में चयनित क्षेत्र के लिए मान के साथ एक नए बॉक्स में प्रकट होता है (चित्रा 4) । यह डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर की प्रतिलिपि बनाएं ।
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शाखाओं की कुल संख्या और मंहगाई न्यूरॉन्स के शाखाकरण संरचना
- "विश्लेषण" खोलकर शाखाओं की कुल संख्या की गणना करें और फिर "रेंडर | (चित्रा 5) अनुरेखण के प्लगइन विंडो में कंकाल रास्तों का विश्लेषण करें ।
नोट: आर्बर की संरचना शाखाओं के स्तर का योग है । पथ को कक्ष के मुख्य भाग और dendrite युक्तियों के बीच निर्धारित किया गया था, और एक पथ में एकाधिक शाखाएं शामिल हो सकती हैं, जैसे प्राथमिक arbors ंयूरॉन कक्ष निकाय से dendrites हैं । माध्यमिक arbors प्राथमिक और इतने पर तृतीयक, चतुर्धातुक, और quinary arbors के साथ शाखाओं से कर रहे हैं । शाखाओं के स्तरों के आधार पर dendrite शाखाकरण की संरचना पृथक की जाती है । उदाहरण के लिए, प्राथमिक% शाखाओं में बंटी की कुल संख्या, और इसी तरह की संख्या के आधार पर विभाजित है ।
- "विश्लेषण" खोलकर शाखाओं की कुल संख्या की गणना करें और फिर "रेंडर | (चित्रा 5) अनुरेखण के प्लगइन विंडो में कंकाल रास्तों का विश्लेषण करें ।
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Representative Results
दा न्यूरॉन्स के dendrites को सह-एक्सप्रेस GFP (यूएएस-GFP; ppk-GAL4) में दा तंत्रिका सोमा और वृक्ष arbors फॉर GFP प्रतिदीप्ति इमेजिंग एनालिसिस के लेबल थे. दा ंयूरॉन dendrites की आकृति विज्ञान एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) द्वारा imaged था ।
फिजी ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए डीए न्यूरॉन्स के dendrites का पता लगाया गया । फ़ाइल dendrite लंबाई (चित्रा 3) का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । दा न्यूरॉन्स में Sox102F की मुंह बंद करने (N = 21) (यूएएस-Sox102F-RNAi/ppk-GAL4; यूएएस-GFP) dendrites की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी के लिए नेतृत्व किया और एक सरल संरचना के साथ एक छोटी शाखा लंबाई नियंत्रण की तुलना में (N = 20) (यूएएस-GFP; ppk-GAL4/+) तीसरे instar लार्वा (चित्रा 6) में । विशेष रूप से, मक्खियों जिसमें Sox102F १२७ µm करने के लिए औसत dendrite लंबाई में कमी प्रदर्शित किया गया था (पी = ०.०२) नियंत्रण में २४९ µm की तुलना में, और ५५२,४७६ आर्बर2 की एक छोटी औसत µm सतह क्षेत्र में ८४७,५७१ µm2 की तुलना में नियंत्रण (p = ०.०४) । इसके अतिरिक्त, Sox102F की मुंह बंद करने शाखाओं की एक छोटी संख्या में हुई और 17 (१७.३ ± ६.७) की कुल शाखाओं के साथ arbors की एक सरल शाखाकरण संरचना, 28 के साथ तुलना में (२८.४ ± ९.५) नियंत्रण में (p = ०.०४). छात्र टी परीक्षण समूहों के बीच मतभेदों की तुलना करने के लिए प्रदर्शन किया गया था, और महत्व स्तर ०.०५ करने के लिए सेट किया गया था ।
चित्रा 1 : Drosophila दा ंयूरॉन के dendrite विश्लेषण मापदंडों के योजनाबद्ध । पैनल (क) एक दा ंयूरॉन की मूल छवि है । (ख) Dendrite लंबाई सभी मापा दा ंयूरॉंस में सभी Dendrite लंबाई का औसत था । (ग) दा ंयूरॉन dendrite की सतह क्षेत्र ImageJ मुक्तहस्त उपकरण द्वारा मैंयुअल रूप से परिभाषित किया गया था । (घ) इस योजनाबद्ध कैसे शाखाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए और एक दा ंयूरॉन के शाखाकरण संरचना का विश्लेषण दिखाता है । 1: प्राथमिक आर्बर । 2: माध्यमिक आर्बर । 3: तृतीयक आर्बर । ४: चतुर्धातुक आर्बर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : एक दा ंयूरॉन के dendrites के प्रतिनिधि अनुरेखण । एक दा ंयूरॉन एक फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ imaged था । (a) पहली त्रुटि कक्ष के मुख्य भाग से एक प्रारंभ बिंदु और एक dendrite के अंत बिंदु के साथ प्लगइन/फॉल्ट उपकरण का उपयोग करके बनाया गया था । नीली रेखा (सफ़ेद तीर) निर्धारित पथ का प्रतिनिधित्व करती है । "हां" (लाल तीर) क्लिक करने के बाद, रेखा नीले से लाल रंग में बदल जाती है । (ख) "खत्म पथ" पर क्लिक करने से यह बैंगनी (C)दिखाई देगा । (A-C) एक एकल dendrite अनुरेखण की प्रक्रिया से पता चलता है; (घ) पूर्ण ट्रेस की गई छवि. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : ट्रेस रास्तों का माप. बाईं तरफ की छवि से पता चलता है कि कैसे "विश्लेषण । उपाय पथ. " एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में पथ लंबाई मान निर्यात करें, और लंबाई के योग की गणना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : dendrite सतह क्षेत्र को मैंयुअली परिभाषित करने का एक उदाहरण । ImageJ विंडो मेनू में मुक्तहस्त उपकरण का उपयोग करके एक निर्धारित छवि प्राप्त की गई थी (लाल तीर द्वारा दिखाया गया). क्षेत्र का चयन करके माप सेट करें । लाल बॉक्स में दिखाए गए क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए "माप" फ़ंक्शन चलाएँ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : बंटी के विश्लेषण का एक उदाहरण है. रन "Analysis_Render | "विभाजन" प्लगइन विंडो में कंकाल रास्तों का विश्लेषण. रेंडर किए गए पथ और उनकी संख्या "सभी पथ रेंडर करें" का चयन करके प्राप्त की गईं । सारांश प्राप्त करें. " पथ को कक्ष निकाय और dendrite युक्तियों के बीच परिभाषित किया गया था, और एक पथ में एकाधिक शाखाएं शामिल हो सकती हैं; उदाहरण के लिए, प्राथमिक arbors ंयूरॉन कोशिका शरीर से dendrites थे; माध्यमिक arbors प्राथमिक और इतने पर तृतीयक, चतुर्धातुक, और quinary arbors के साथ शाखाओं थे । शाखाओं के स्तरों के आधार पर dendrite शाखाकरण की संरचना अलग की गई । उदाहरण के लिए, प्राथमिक% शाखाओं की कुल संख्या के आधार पर बंटी की संख्या थी, और इतने पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6 : डा न्यूरॉन्स में Sox102F के मुंह बंद करने के प्रतिनिधि परिणाम. दा न्यूरॉन्स में Sox102F की मुंह बंद करने (यूएएस-Sox102F-RNAi/यूएएस-GFP; ppk-GAL4) के नेतृत्व में काफी कम dendrite लंबाई और तीसरे instar लार्वा में सरल संरचना के साथ कम शाखाओं में बंटी करने के लिए नियंत्रण की तुलना में. Sox102F-RNAi मक्खियों के बीच अंतर (यूएएस-Sox102F-RNAi/यूएएस-GFP; ppk-GAL4, n = 21) और नियंत्रण (यूएएस-GFP; ppk-GAL4/+, n = 20) मक्खियों पर थे (A) dendrite लंबाई (B) आर्बर सतह क्षेत्र (C) शाखाओं की कुल संख्या, और (D, E ) दा न्यूरॉन्स के शाखाकरण संरचना. सांख्यिकी विश्लेषण के लिए छात्र टी-टेस्ट perfomed थे । * सांख्यिकीय महत्व (p < 0.05) इंगित करता है । त्रुटि पट्टियों मतलब ± मानक विचलन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
Dendrites कि अंदर आना एपिडर्मिस न्यूरॉन्स के इनपुट क्षेत्रों रहे हैं, और उनके morphologies कैसे जानकारी प्राप्त की है और व्यक्तिगत ंयूरॉंस द्वारा संसाधित है निर्धारित करते हैं । विकास dendrite आकृति विज्ञान dendrite संगठन के जीन मॉडुलन को दर्शाता है । परिधीय तंत्रिका तंत्र के Drosophila लार्वा डा न्यूरॉन की वजह से dendrite विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है: 1) स्तनधारियों के साथ कार्यात्मक समानता11,12; 2) dendrite संरचना11,12के आधार पर चार वर्ग भेद; और 3) आनुवंशिक कारकों है कि morphogenesis को विनियमित । इस प्रोटोकॉल में, हम Drosophila दा न्यूरॉन्स की छवि विश्लेषण करने के लिए लार्वा तैयारी से कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं. विधियां दा न्यूरॉन्स में विस्तार से dendrites विश्लेषण के लिए चार महत्वपूर्ण मापदंडों का वर्णन है, जो dendrites की लंबाई, सतह क्षेत्र, शाखाओं की कुल संख्या, और शाखाकरण संरचना कर रहे हैं. महत्वपूर्ण कदम के रूप में लार्वा शरीर की दीवार से कई ऊतकों को पूरी तरह से इमेजिंग और विश्लेषण के लिए दा ंयूरॉंस को बेनकाब करने के लिए हटा दिया गया था । वहां कुछ छोटी शाखाओं क्योंकि Z-प्रक्षेपण छवियों की सीमित संख्या में कटौती हो सकती है । इस विधि के रूप में नियंत्रण के साथ तुलना में dendrites लंबाई के सापेक्ष माप है, दा न्यूरॉन्स के प्रत्येक समूह के लिए छवियों की एक बड़ी संख्या Z-प्रक्षेपण छवियों के कवरेज क्षेत्रों में वृद्धि करने के लिए लिया जाना चाहिए.
Drosophila कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स dendrite आर्बर आकृति विज्ञान15,21,22,23के विषय में अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है. Morphogenesis वृक्ष आर्बर विकास के नुकसान या जीन समारोह के लाभ से बाधित हो सकता है, प्रदर्शन है कि डा ंयूरॉन विकास आनुवंशिक परिवर्तन24के प्रति संवेदनशील है । आनुवंशिक अध्ययन के लिए, यह विज्ञान सही का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है क्रम में दा न्यूरॉन्स पर इसके प्रभाव को समझने के लिए. वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन्स जटिल लेकिन अभी भी उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए सुलभ हैं, क्योंकि वे सिर्फ अर्द्ध पारदर्शी शरीर की दीवार और शाखा के नीचे स्थित हैं, लगभग पूरी तरह से दो आयामी अंतरिक्ष में. गतिशील GFP प्रतिदीप्ति त्यसपछि दा न्यूरॉन्स (ppk-GAL4; यूएएस-GFP) ंयूरॉन विकास की जांच करने के लिए एक आसानी से visualized मॉडल प्रदान करते हैं । आकृति विज्ञान परिवर्तन की दिशा बदलता है, arbors हो सकता है या अधिक से अधिक branched या सरलीकृत । यहाँ, हम quantitive पैरामीटर द्वारा इन रूपात्मक परिवर्तन वर्गीकृत, उदाहरण के लिए dendrite लंबाई, सतह क्षेत्र, शाखाओं की कुल संख्या, और दा न्यूरॉन्स के ब्रांचिंग संरचना. परिणामों के रूप में इस अध्ययन में दिखाया गया है, Sox102F अभिव्यक्ति के ंयूरॉन विकास को विनियमित करने में प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित ।
हमारे प्रोटोकॉल मक्खियों में कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स के रूपात्मक परिवर्तन दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था जिसमें SOX5, Sox102F के Drosophila ortholog, खामोश था, SOX5 विकास में dendrite की एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका का संकेत और morphogenesis । Wnt प्रोटीन्स के एक ऐसे परिवार हैं, जो सीक्रेटेड नच dendrite morphogeneis को विनियमित करने में फंसा हुआ है । Wnt2 और Wnt7b को बढावा दा और न्यूरॉन की जटिलता9,10. Wnt विहित मार्ग में, इस सक्रियण GSK3β के सक्रियकरण के बाद, एक serine-threonine कळेनासे, जो बारी में β-catenin मध्यस्थता प्रतिलेखन को सक्रिय करता है10,25. हम पहले पाया है कि मानव एसएच-SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं में SOX5 के मुंह बंद करने Wnt संकेतन गतिविधि का एक महत्वपूर्ण दमन के परिणामस्वरूप और Wnt β के एक व्यक्त सहित GSK3 जीन की एक संख्या की अभिव्यक्ति को विनियमित 15. GSK3β की बढ़ती अभिव्यक्ति स्मृति हानि, β-amyloid प्लेग, और ताऊ26के असामान्य hyperphosphorylation सहित विज्ञापन की पहचान विशेषताओं के साथ जुड़ा हुआ है । मुंह बंद करने SOX5 GSK3β अभिव्यक्ति, जो SOX5 और GSK3β के बीच एक कार्यात्मक लिंक का संकेत हो सकता है ।
कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स सभी संवेदी न्यूरॉन्स की सबसे उच्च जटिल dendrites है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक विधि सार को आर्बर और शाखाओं की जटिलता का विश्लेषण करने के लिए Drosophila में कक्षा चतुर्थ दा ंयूरॉंस की संपत्तियों पारंपरिक उपलब्ध plugins और सॉफ्टवेयर के आधार पर विकसित की है । छवियां है कि एक फोकल माइक्रोस्कोप से ले जाया गया विश्लेषण किया गया, और एक सरल neurite अनुरेखक के प्लगइन विभाजन dendrite शाखाओं का पता लगाने के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान की27,28. इसके अतिरिक्त, इस ठहराव विधि सोमा से शाखाओं में बंटी के विभिंन स्तरों के अनुपात को पेश करके dendrite जटिलता के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और अधिक दूर dendrite । इसके अलावा, इस विधि के लिए डा ंयूरॉंस के अंय वर्गों का विश्लेषण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, वर्ग मैं दा न्यूरॉन्स माध्यमिक dendrites शरीर की दीवार के एक तरफ करने के लिए विस्तार; द्वितीय श्रेणी चंदपूर शाखाओं सममित है; और वर्ग III दा न्यूरॉन्स बंटी और spikes के अधिक जटिलता है. संक्षेप में, हम Drosophilaमें ंयूरॉन dendrite विश्लेषण के लिए एक इमेजिंग और कक्षा चतुर्थ दा ंयूरॉंस के विश्लेषण के प्रोटोकॉल प्रदान की है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम इमेजिंग तकनीकी सहायता के लिए विलियम ए इयम् शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम चिकित्सा अल्जाइमर कोष द्वारा समर्थित किया गया था [to r. e. t], राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01AG014713 और R01MH60009 को आर. ई. टी.; R03AR063271 और R15EB019704 को अल], और राष्ट्रीय विज्ञान फाउण्डेशन [NSF1455613 to अल] ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
References
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