Summary
Dieses Protokoll konzentriert sich auf Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila, die für Studien der dendritischen Morphogenese verwendet werden können.
Abstract
Dendriten sind die verzweigten Projektionen eines Neurons und dendritischen Morphologie spiegelt synaptischen Organisation während der Entwicklung des Nervensystems. Drosophila Larven neuronalen dendritischen Arborization (da) ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese der neuronalen Dendriten und Genfunktion in der Entwicklung des Nervensystems. Es gibt vier Klassen von da Neuronen. Klasse IV ist das komplexeste mit einem verzweigten Muster, die fast den gesamten Bereich der Larven Körperwand abdeckt. Wir haben bisher die Wirkung der Stummschaltung der Drosophila Ortholog der SOX5 Klasse IV neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) mit vier Parametern charakterisiert: die Länge der Dendriten, die Fläche der Dendrit-Abdeckung, die Gesamtzahl der Filialen und der Verzweigungsstruktur. Dieses Protokoll stellt den Workflow der NDAC Quantitative Analyse, bestehend aus Larven Dissektion, konfokale Mikroskopie und Bild Analyseverfahren mit ImageJ-Software. Weitere Einblicke in da neuronale Entwicklung und ihre zugrunde liegenden Mechanismen verbessert das Verständnis der neuronalen Funktion und Aufschluss über die grundlegenden Ursachen der neurologischen und Entwicklungsstörungen des.
Introduction
Dendriten, die die verzweigten Projektionen eines Neurons sind, umfassen das Gebiet, das das Neuron sensorischen und synaptischen Eingänge von anderen Neuronen1,2umfasst. Dendriten sind ein wichtiger Bestandteil der Synapse Bildung und spielen eine kritische Rolle bei der Integration der synaptischen Eingänge, sowie die Vermehrung der elektrochemischen Stimulation in einem Neuron. Dendritische Arborization (da) ist ein Prozess, der durch den Neuronen neue dendritischen Bäume und Äste zum Erstellen neuer Synapsen bilden. Die Entwicklung und Morphologie der da, wie dichte Verzweigung und Gruppierung Muster ergeben sich aus mehrstufigen biologischen Prozessen und sind stark korreliert zu neuronalen Funktion. Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zur quantitativen Analyse der neuronalen Dendritric Arborization Komplexität in Drosophila.
Die Komplexität der Dendriten bestimmt die synaptischen Typen, Konnektivität und Eingänge von Partner-Neuronen. Verzweigung Muster und die Dichte der Dendriten engagieren sich bei der Verarbeitung der Signale, die auf die dendritischen Feld3,4konvergieren. Dendriten haben die Flexibilität zur Anpassung in der Entwicklung. Zum Beispiel wirkt sich synaptische Signalisierung auf Dendrit Organisation im somatosensorischen Neuronen in der Entwicklungsphase und in den Reifen Nervensystem-5. Die Einrichtung der neuronalen Vernetzung stützt sich auf die Morphogenese und Reifung von Dendriten. Fehlbildung der Dendriten ist Beeinträchtigung der neuronalen Funktion zugeordnet. Studien haben gezeigt, dass die Anomalie der da Neuron Morphogenese der Ätiologie von mehreren Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Gehrig Krankheit beitragen kann / Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)6,7,8. Synaptische Veränderungen erscheinen in der frühen Phase der AD, im Konzert mit den Niedergang und die Beeinträchtigung der Neuron Funktion7,8. Die Besonderheiten wie Dendrit Pathologie, Pathogenese in diese neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt bleibt jedoch schwer.
Die Entwicklung der Dendriten wird durch Gene reguliert, die ein komplexes Netzwerk von Regulierungsbehörden wie der Wnt-Familie von Proteinen9,10, Transkriptionsfaktoren und Liganden auf Zelle Oberfläche Rezeptoren11,12 kodieren . Drosophila da Neuronen bestehen aus vier Klassen (Klasse I, II, III, IV), von welcher, die Klasse IV da Neuronen haben die komplexesten Verzweigung Muster und als ein leistungsfähiges experimentelle System für besseres Verständnis Morphogenese13eingesetzt, 14. Während der frühen Morphogenese führen Überexpression und/oder RNAi-Stummschaltung von Genen in Klasse IV da Neuronen Änderungen in verzweigten Mustern und Dendrit Rebschnitt13. Es ist wichtig, eine praktische Methode zur quantitativen Analyse der neuronalen dendritischen Arborization zu entwickeln.
Wir haben bereits gezeigt, dass Schweigen der Drosophila Ortholog des SOX5, Sox102F, zu kürzeren Dendriten da Neuronen und reduzierte Komplexität in der Klasse IV da Neuronen15geführt. Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren der quantitativen Analyse für die neuronale dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila. Dieses Protokoll, adaptiert von der vorherigen beschriebenen Methodik bietet eine kurze Methode, um die Entwicklung der sensorischen Neuronen da assay. Die robuste Bild beschriften und da Neurons in Dritte Instar Larven Körperwand16,17,18,19veranschaulicht. Es ist eine wertvolle Protokoll für Forscher, die die NDAC und Entwicklungs Unterschiede in Vivozu untersuchen wollen.
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Protocol
(1) experimentelle Vorbereitung
- Die folgenden Reagenzien vorzubereiten: Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS); Triton x-100; 0,2 % PBST (PBS + 0,2 % Triton x-100); 32 % Paraformaldehyd (PFA), in 4 % vor Gebrauch verdünnt; Silikon-Elastomer-Basis und Härtemittel; Antifade Montage Medium (z. B.verlängern Gold); und Nagellack.
- Bereiten Sie die folgende Ausrüstung: Dissektion Mikroskop, zwei scharfe Pinzette und eine Schere für Mikrodissektion, eine Anzahl von Pins für Mikrodissektion, einer Petrischale zur Herstellung der Dissektion Gericht, Objektträger und Deckgläsern, ein confocal Mikroskop und eine Computer mit Fidschi ImageJ-Software installiert.
2. Larven Sammlung
- Paaren Sie FH-Sox102F-RNAi fliegen mit UAS-GFP, Ppk-GAL4 oder W1118 Wildtyp fliegen, bzw.. Kultur-fliegen in Standardbedingungen bei 25 ° C.
- In ca. 5-6 Tagen sammeln die dritte Instar Larven der FH-Sox102F-RNAi / Ppk-GAL4, UAS-GFP oder UAS-GFP und Ppk-GAL4 / + Kontrolle sorgfältig mit der Pinzette für Dissektion.
(3) Dissektion der Larven
Hinweis: Alle Verfahren in diesem Abschnitt werden unter dem Mikroskop Mikrodissektion betrieben. Die Vergrößerung ist bis zu den Ermittlern. Versuchen Sie, die optimale Sicht-Ansicht anpassen. ~ 4-6 X Vergrößerung wird empfohlen.
- Legen Sie eine Larve auf eine Dissektion Gericht aus Silikon-Elastomer Basis und einer Gewebekultur Petrischale.
- PIN des Larve Mund Hakens damit die dorsale Seite stellen kann, und dann Heften Sie das Ende der Larve. Ort der dorsalen Seite in der Mitte so weit wie möglich an die Mittellinie, die die öffnen-Marker werden aussetzen.
- Die Larve Körperfeuchtigkeit halten fügen Sie 200 µL PBS hinzu.
- Machen Sie einen Schnitt mit der Schere entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den zwei Tracheas von kaudalen, rostral. Machen Sie einen kleinen Schnitt in jeder der vier Ecken des Körpers Larve.
- Legen Sie eine Pin an jeder der vier Ecken des Körpers, damit der Körper flach liegt.
- Korrigieren Sie die Larve Körperwand in 4 % PFA für 25 min bei Raumtemperatur.
- Für 5 min. wiederholen zweimal mehr in PBST waschen.
- Die Pins aus dem Gewebe zu entfernen. Übertragen Sie dann das Gewebe auf einem Objektträger mit antifade Eindeckmittel bedecken und mit einem Deckglas montieren. An der Luft trocknen für 1 h und die Schnittflächen mit Nagellack versiegeln.
4. Bildgebung Verarbeitung
Hinweis: Bilder wurden mit einem invertierten confocal Mikroskop-System. Der Benutzer kann die Probe mit einem 20 X Objektiv (empfohlen) fotografieren.
- Z-Serie Bilder aufnehmen. Öffnen Sie das Dialogfeld "Capture Z-Serie" in der konfokalen Mikroskop-Software. Bestimmen Sie den Bereich für die Aufnahmen der Z-Serie.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Oben und unten". Oben und unten positionieren und die Eingabewerte zu bestimmen "unten:" und "Top:" Boxen. Legen Sie die "Step" im Dialogfeld "Capture Z-Serie" als 0,5 µm. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt ausführen", um die Z-Serie-Bilder zu erwerben.
- Speichern Sie die erhaltenen Bilder als *.tiff oder *.nd2-Dateien.
- Speichern Sie die Folien in einer dunklen Halterung bei 4 ° C nach dem Imaging.
(5) Dendrit Bewertung
Hinweis: GFP-Protein wurde in UAS-GFP co überexprimiert und Ppk-GAL4 fliegt da Nervenzellen für GFP Fluoreszenz imaging-Analyse. Länge, Verzweigung und Struktur von da Neuronen in die dritte Instar Larven wurden quantifiziert. Analyseparameter gehören Länge der Dendriten (µm), Fläche (µm-2), Anzahl der Filialen und verzweigte Struktur (%). Abbildung 1 zeigt die Analyseparameter im Detail.
-
Länge der Dendriten
Hinweis: Die Länge der Dendriten ist die Summe aller Dendriten in Tracer Plugin beschriftet.- Setup und Fidschi ImageJ (https://fiji.sc/)20 Software ausführen. Dann Bilder in separate Kanäle aufgeteilt, wenn es mehrere Kanäle von Bildern.
Hinweis: Das Bild in diesem Protokoll hat nur einen Kanal der GFP. - Führen Sie "Bild | Stapel | Z-Projekt"zu einer Z-Projektion; erscheint ein neues Fenster mit dem Namen "Z-Projektion." Klicken Sie auf "Max. Intensität" für Projektionstyp und organisieren Zahlen zwischen Slice Start und Stop Stück je nach individuellen Vorlieben. Klicken Sie auf "OK". Ein Z-Projektionsbild erscheint präsentiert die Dendriten Projektion deutlich.
- Verfolgen Sie die Neuriten.
- Wählen Sie "Plugins | Segmentierung | Einfache Neuriten Tracer"im Fenster" ", die Dendriten zu verfolgen. Finden Sie die Neuron Soma zu, und klicken Sie auf einen Punkt an einem Dendriten, Zellkörper und ein weiterer Punkt an der Spitze dieser Dendrit ab.
Hinweis: Das Programm verbindet die beiden Punkte mit einer blauen Linie. - Drücken Sie "Y" in das Plugin-Fenster, wenn der Pfad klar ist; der Dendrit-Pfad wird bis die Endpunkte des ausgewählten Pfads in den sichtbaren Bildern nachgezeichnet. Klicken Sie auf "vollständige Pfad" auf dem gleichen Plugin-Fenster; das Segment ist abgeschlossen (Abbildung 2).
Hinweis: Einige Dendriten endete weiter von den Ausgangspunkten, in denen der Weg in kleinere Segmente unterteilt war. Die Segmente wurden kombiniert, um einen vollständigen Pfad für die Tracer zur Verfügung zu stellen.
- Wählen Sie "Plugins | Segmentierung | Einfache Neuriten Tracer"im Fenster" ", die Dendriten zu verfolgen. Finden Sie die Neuron Soma zu, und klicken Sie auf einen Punkt an einem Dendriten, Zellkörper und ein weiterer Punkt an der Spitze dieser Dendrit ab.
- Nach ein Pfad abgeschlossen ist, gehen Sie zurück zu einem neuen Punkt, wo die Zweige sind. Der neue Pfad kann auf gebaut werden; "Alle Wege" Fenster-Box zeigt die Längenwerte aller Pfade (Abbildung 3). Speichern Sie die Ablaufverfolgung Datei, und fahren Sie mit unfertigen Spuren wie in Abbildung 2dargestellt.
- Die Dendrit Längendaten exportieren, indem Sie auf klicken, "Datei | Als *.cvs exportieren Sie"im Fenster"Plugin". Dann die Bahnlängen zusammenzufassen Sie, und exportieren Sie die Daten auf eine Daten-Analyse/Tabellenkalkulations-Software. (Abbildung 3).
- Setup und Fidschi ImageJ (https://fiji.sc/)20 Software ausführen. Dann Bilder in separate Kanäle aufgeteilt, wenn es mehrere Kanäle von Bildern.
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Fläche der da Neuronen
- Wählen Sie das Hilfsmittel "Freihand zeichnen" im Fenster "Fidschi ImageJ". Die Strecke, und schließen Sie die Endpunkte. Klicken Sie im Menü "Analyze" "Set Messungen | Area." Klicken Sie auf "Messen" aus dem Menü "Analyze". Das Ergebnis wird in einem neuen Feld mit dem Wert für den ausgewählten Bereich (Abbildung 4). Kopieren sie die Daten-Analyse-Software.
-
Total Anzahl der Äste und Verzweigungen Struktur der Neuronen da
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der Filialen mit der Eröffnung von "Analyse" und dann "Rendern | Analysieren Sie skelettiert Pfade"in das Plugin-Fenster (Abbildung 5) zu verfolgen.
Hinweis: Die Struktur der Laube ist die Summe der Ebenen der Zweige. Der Pfad zwischen den Zellkörper und Dendriten Tipps definiert wurde, und ein Pfad kann mehrere Verzweigungen enthalten, wie die primäre Dorne sind die Dendriten aus dem Neuron Zelle Körper. Die sekundäre Dorne sind Zweige von der primären und so weiter mit dem Tertiär, Quartär und quinary Lauben. Die Struktur der Dendrit Verzweigung ist abhängig von den Ebenen der Zweige getrennt. Beispielsweise ist die primäre % die Zahl der Filialen geteilt durch Anzahl der Verzweigungen, und so weiter.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der Filialen mit der Eröffnung von "Analyse" und dann "Rendern | Analysieren Sie skelettiert Pfade"in das Plugin-Fenster (Abbildung 5) zu verfolgen.
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Representative Results
Die Dendriten der Nervenzellen da waren da neuronale Soma und dendritischer Dorne für GFP Fluoreszenz imaging Analyse von co-überexprimierenden GFP (FH-GFP; Ppk-GAL4) bezeichnet. Die Morphologie der da Neuron Dendriten wurde von einem inversen confocal Mikroskop (Abbildung 2) abgebildet.
Die Dendriten der Nervenzellen da wurden mit Fidschi ImageJ-Software verfolgt. Die Datei wurde zur Schätzung der Dendrit-Länge (Abbildung 3). Stummschaltung des Sox102F in da Neuronen (N = 21) (FH-Sox102F-RNAi/Ppk-GAL4; UAS-GFP) führte zu einer deutlichen Verringerung der Zahl der Dendriten und eine kürzere Astlänge mit eine einfachere Struktur im Vergleich zu Kontrollen (N = 20) (FH-GFP; Ppk-GAL4 / +) in die dritte Instar Larve (Abbildung 6). Speziell, fliegen in der Sox102F zum Schweigen gebracht wurde einen Rückgang der durchschnittlichen Dendrit Länge bis 127 µm im Vergleich zu 249 µm in Steuerelementen ausgestellt (p = 0,02), und hatte eine kleinere durchschnittliche Arbor Fläche 552.476 µm2 im Vergleich zu 847.571 µm2 in Kontrollen (p = 0,04). Darüber hinaus in einer kleineren Anzahl von Filialen und eine einfachere verzweigte Struktur der Dorne mit insgesamt Zweigen der 17 (17.3 ± 6,7), verglichen mit 28 (28.4 ± 9,5) Kontrollen ergaben Schweigen der Sox102F (p = 0,04). Student-t-Tests wurden durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen, und das Signifikanzniveau wurde auf 0,05 festgelegt.
Abbildung 1 : Schaltpläne Dendrit Analyseparameter Drosophila da Neurons. Panel (A) ist das ursprüngliche Bild eines Neurons da. (B) Dendrit Länge betrug der Durchschnitt aller Dendrit Längen in allen gemessenen da Neuronen. (C) die Fläche von da Neuron Dendrit wurde manuell durch die ImageJ Hilfsmittel "Freihand" definiert. (D) dieser Schaltplan zeigt, wie die totale Anzahl der Zweige und verzweigte Struktur eines Neurons da analysieren. 1: primäre Laube. 2: sekundäre Laube. 3: tertiäre Laube. 4: quartäre Laube. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Rückverfolgung von Dendriten eines Neurons da. Eine Neuron da war mit einem konfokale Fluoreszenz-Mikroskop-System abgebildet. (A) die erste Verfolgung einen Startpunkt aus Zellkörper und den Endpunkt der einem Dendriten entstand mit dem Plugin/Segmentierung Tool. Die blaue Linie (weißer Pfeil) steht für den Pfad definiert. Nach Klicken auf "Ja" (roten Pfeil), ändert die Linie Farbe von blau zu rot. (B) klicken Sie auf"beenden" Es erscheint lila (C). (A-C) Zeigt den Prozess der Verfolgung einer einzigen Dendrit; (D) das komplette Bild verfolgt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Messung der verfolgte Wege. Das Bild auf der linken Seite zeigt, wie die Spur Wege nach Laufzeit messen die "Analyse | Pfade zu messen." Exportieren Sie Längenwerte Pfad in eine Kalkulationstabelle, und berechnen Sie die Summe der Länge. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Ein Beispiel für die Definition der Dendrit Fläche manuell. Eine definierte Bild wurde erhalten, mit dem Hilfsmittel "Freihand" in die ImageJ Menü "Fenster" (dargestellt durch den roten Pfeil). Die Messungen durch Auswahl Bereich festgelegt. Führen Sie die "Maßnahme" Funktion um den Bereich im roten Feld angezeigt zu erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Ein Beispiel für eine Analyse der Verzweigung. Führen Sie "Analysis_Render | Analysieren Sie skelettiert Pfade"im Fenster"Segmentierung"Plugin. Die gerenderten Pfade und ihre Zahl wurden erzielt durch die Auswahl "alle Wege zu machen | Erhalten Sie Zusammenfassung." Der Pfad zwischen den Zellkörper und Dendriten Tipps definiert wurde, und ein Pfad kann mehrere Verzweigungen enthalten; zum Beispiel waren die primären Dorne die Dendriten aus dem Neuron Zelle Körper; die sekundäre Lauben wurden Zweige von der primären und so weiter mit dem Tertiär, Quartär und quinary Lauben. Die Struktur der Dendrit Verzweigung trennte sich je nach der Zweige. Zum Beispiel lag primäre die Zahl der Filialen geteilt durch Anzahl der Verzweigungen, und so weiter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Repräsentative Ergebnisse der Stummschaltung des Sox102F in da Neuronen. Stummschaltung des Sox102F in da Neuronen (FH-Sox102F-RNAi/FH-GFP; Ppk-GAL4) führte zu signifikant reduzierte Dendrit Länge und kürzere Verzweigung mit einfacher Struktur in die dritte Instar Larve im Vergleich zu Kontrollen. Die Unterschiede zwischen Sox102F-RNAi fliegen (FH-Sox102F-RNAi/FH-GFP; Ppk-GAL4, N = 21) und Kontrolle (FH-GFP; Ppk-GAL4 / +, N = 20) fliegen waren auf (A) Dendrit Länge (B) Arbor Fläche (C) Gesamtzahl der Zweigniederlassungen und (D, E ) verzweigte Struktur der Neuronen da. Student T-Test wurde durchgeführt für statistische Analysen. * zeigt statistischen Signifikanz (p < 0,05). Die Fehlerbalken sind Mittelwert ± Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dendriten, die die Epidermis innervieren sind die Eingabe Regionen von Neuronen und ihre Morphologien bestimmen, wie Informationen empfangen und verarbeitet von einzelnen Neuronen. Entwicklung Dendrit Morphologie spiegelt gen Modulation der Dendrit-Organisation. Die Drosophila Larven da Neuron des peripheren Nervensystems ist ein wichtiges Modell für das Studium Dendrit Entwicklung: 1) die funktionale Ähnlichkeit mit Säugetieren11,12; (2) vier Klassenunterschiede basierend auf dendritischen Struktur11,12; und 3) die genetische Faktoren, die Morphogenese regulieren. In diesem Protokoll präsentieren wir den Workflow von der Larven Vorbereitung zur Bildanalyse von Drosophila da Neuronen. Die Methoden beschreiben die vier wichtigen Parameter für die Analyse von Dendriten in da Neuronen im Detail, die die Länge der Dendriten, die Fläche, die Gesamtzahl der Filialen und der Verzweigungsstruktur sind. Die entscheidende Schritt war es, möglichst viele Gewebe aus der Larve Körperwand möglichst vollständig aussetzen da Neuronen für Bildgebung und Analysen zu entfernen. Möglicherweise gibt es einige kurze Zweige abgeschnitten wegen der begrenzten Zahl von Z-Projektion von Bildern. Da diese Methode die relative Messung der Dendriten Länge im Vergleich zu den Kontrollen ist, sollte eine große Anzahl von Bildern für jede Gruppe von Neuronen da geachtet werden, um die Versorgungsgebiete der Z-Projektion von Bildern zu erhöhen.
Drosophila -Klasse IV da Neuronen wurden im Mittelpunkt der Forschung in Bezug auf Dendrit Arbor Morphologie15,21,22,23. Morphogenese der dendritischen Arbor Entwicklung könnte gestört werden, durch Verlust oder Gewinn der Genfunktion, zeigen, dass da Neuron Entwicklung auf genetische Veränderungen24reagiert. Für genetische Studien ist es wichtig, Morphologie genau analysieren, um deren Auswirkungen auf da Neuronen zu verstehen. Klasse IV da Neuronen sind komplex, aber immer noch zugänglich für qualitativ hochwertige Bildgebung, weil sie gerade unter der halbtransparenten Körperwand und Zweig, fast ausschließlich in zwei dimensionalen Raum befinden. Die dynamische GFP Fluoreszenz bezeichnet da Neuronen (Ppk-GAL4; UAS-GFP) ein leicht visualisierten Modell zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung bieten. Die Richtung der Morphologie Veränderung variiert, Dorne overbranched oder vereinfacht werden können. Hier wir kategorisiert diese morphologischen ändert durch quantitative Parameter, z.B. der Dendrit-Länge, Fläche, die Gesamtzahl der Filialen und der Verzweigungsstruktur da Neuronen. Die Ergebnisse spiegeln die Antwort in Sox102F Ausdruck Regulierung der neuronalen Entwicklung, wie in dieser Studie gezeigt.
Unser Protokoll wurde verwendet, um die morphologischen Veränderungen der Klasse IV da Neuronen in fliegen zeigen in die Drosophila Ortholog des SOX5, Sox102F, zum Schweigen eine wichtige funktionelle Rolle der SOX5 in Dendrit Entwicklung zeigt gebracht wurde, und Morphogenese. Die Wnt-Proteine sind eine Familie der sekretierten Glykoproteine, die bei der Regulierung der Dendrit Morphogeneis verwickelt waren. Wnt2 und Wnt7b fördern, da und neuronale Komplexität9,10. In dem Wnt kanonischen Weg folgt diese Aktivierung durch Aktivierung des GSK3β, eine Serin-Threonin-Kinase, die wiederum β-Catenin vermittelte Transkription10,25aktiviert. Wir haben bereits festgestellt, dass Schweigen der SOX5 in den menschlichen SH-SY5Y Neuroblastom-Zellen zu einer erheblichen Repression Wnt signalisieren Aktivität führte und reguliert die Expression von einer Anzahl von Wnt Genen einschließlich einer Überexpression des GSK3β 15. Erhöhte Expression von GSK3β wurde das Markenzeichen Merkmale der Werbeanzeige, einschließlich Gedächtnisverlust, β-Amyloid Plagen und abnorme Hyperphosphorylierung von Tau26zugeordnet. Stummschaltung des SOX5 erhöht GSK3β Ausdruck, der einen funktionalen Zusammenhang zwischen SOX5 und GSK3β hindeuten könnten.
Die Klasse IV da Neuronen haben die meisten hochkomplexen Dendriten aller sensorischen Neuronen. In diesem Protokoll haben wir eine Methode zur Analyse der Komplexität der Laube und Zweige, die Eigenschaften der Klasse IV da zu abstrahieren, die Neuronen in Drosophila anhand von konventionell verfügbaren Plugins und Software entwickelt. Bilder, die aus einem confocal Mikroskop aufgenommen wurden wurden analysiert, und die Plugin-Segmentierung eines einfachen Neuriten Tracers vorausgesetzt, ein ideales Werkzeug um die Dendriten zu verfolgen27,28Filialen. Darüber hinaus ermöglicht diese Quantifizierungsmethode für die detaillierte Analyse der Dendrit Komplexität durch die Verhältnisse der verschiedenen Ebenen der Verzweigung aus der Soma in den entfernteren Dendrit Vorlage. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um andere Klassen da Neuronen zu analysieren. Beispielsweise der Klasse I da Nervenzellen verlängern sekundäre Dendriten auf der einen Seite der Körperwand; Klasse II hat gabelartig Niederlassungen symmetrisch; und Klasse III da Neuronen haben mehr Komplexität von Verzweigungen und Spikes. Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir ein Protokoll der Bildgebung und Analyse der Klasse IV da Neuronen für neuronale Dendrit Analysen in Drosophilabereitgestellt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten William A. Eimer für bildgebende technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Heilung der Alzheimer Krankheit Fonds [R.E.T], das National Institute of Health [R01AG014713 und R01MH60009, R.E.T; R03AR063271 und R15EB019704, A.L.], und die National Science Foundation [NSF1455613, A.L.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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