Summary
여기, 우리는 식물 성장 행동과 특히 고기를 공부 하 고 재현 가능한 방식에 대 한 프로토콜을 제시. 우리는 변수와 같은 시간 안정적인 조명 조건에서 제공 하는 방법을 보여줍니다. 적절 한 분석은 충분 한 샘플 번호 및 유효한 통계 평가에 따라 달라 집니다.
Abstract
식물 생물학 그들의 선택한 종족의 성장 동작을 관찰 해야 하는 경우가 종종. 이 위해, 식물 지속적인 환경 및 안정적인 조명 조건, 다른 설정을 연구 실시 될 수 있도록 가급적 수량 및 품질에 변수는 필요 합니다. 이러한 요구 사항은 갖춘 빛 발광 다이오드 (LED) 조명-형광등-달리 설정 될 수 있는 다른 파장을 기후 챔버에 의해 충족 됩니다. Led는 에너지 절약 및 방출 거의 열 빛 농도 에서도 종종 다른 광원으로 문제를 구성. 제시 프로토콜 가변 LED 조명 장착으로 성장 고기의 심층 분석에 대 한 몇 가지 방법을 설명 기후 챔버를 프로그래밍 하는 방법에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다. 실험 설정에 따라 성장 하는 식물의 다양 한 특성 관찰 하 고 분석 될 수 있습니다. 여기는 신선한 무게, 잎 지역, 광합성 활동, stomatal 조밀도 결정 하는 방법에 설명 합니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 얻을 하 고 통계적 평가 대 한 개인의 충분 한 번호를 사용 하는 유효한 결론을 설명 합니다. 높은 통계 오류에 분석 결과의이 종류에 대 한 몇 가지 식물을 복용 하 고 결과적으로 데이터의 더 적은 명확한 해석에서.
Introduction
애기 thaliana 십년 이상에 대 한 분자의 식물 연구의 모델 생물 되었습니다. 여러 특성에 게 브라 시카 가족의 작은 대표가 유전과 분자 연구를 위한 이상적인 후보자: 그것은 단지 5 개의 염색체 (24 염색체를 가진 예를 들면 Nicotiana tabacum 에 비해) 상대적으로 작은 게놈과 그것의 게놈 20001에 시퀀싱 완전히 했다. A. thaliana Agrobacterium 감염2 로 쉽게 유전자 변형 수 이며 심지어는 최신 유전 같은 도구 CRISPR/Ca3의무가 있습니다. 비록 작은, 성장 주기는 물질의 높은 금액 필요한 생화학 실험 가능 하 게 충분히 빨리 이다. 식물과 성장 한 천 배지 또는 토양에도 액체 문화4으로 경작 될 수 있다. 애기 는 기후 상으로 제어 찬 장, 예: 퍼시벌에서에서 성장 될 수 있다 기후 챔버 또는 온실에서. 성장 동작을 비교 하 고 분석 하는 돌연변이의 고기 수 재현 하 고 같은 시간 유연한 성장 조건5에서 제공 하는 중요 한입니다. 과학적 문제를 해결 하는 것입니다 따라 하나 다른 온도 일정 조명 조건, 다양 한 빛 농도 또는 동일한 온도에 다른 빛 질 수도 있습니다. 빛은 식물 성장에 매우 중요 한 매개 변수 그리고 그 영향력은 종종 다양 한 접근6공부. 재현성 및 comparability 얻은 데이터의 안정적인 출력을 보장 하 여 광원의 동일한 종류를 적용할 결정적 이다.
나트륨 수증기 또는 형광 램프를 만족 식물의 성장을 촉진 하지만 몇 가지 단점이 온실 및 기후 챔버에 일반적인 광원에 의하여 이루어져 있다. 첫째, 그들은 강도 뿐만 아니라 품질 (자신의 관측)에 스펙트럼 출력을 변경 하는 시간이 지나면서 나이. 그러나,만 강도 빛 품질에 변화를 수 들 키 지 하지만 여전히 상당한 효과 지속적으로 모니터링 일반적으로 이다. 둘째, 두 가지 유형의 램프 열 생성 높은 가벼운 강렬에 자체 식물 성장에 심오한 생리 적 영향이 고 어떤 종속 효과 마스크 수 있습니다. 셋째, 이러한 광원의 스펙트럼 출력 이며 불변 자연 햇빛7와 달리 꽤. Led의 경우 이러한 단점 극복 했습니다)8,9,,1011. 그들은 긴 수명을 방출에서 거의 어떤 변경으로도 매우 높은 가벼운 강렬에 폐 열을 생산 하지 않습니다 그리고 그들은 매우 유연 그들의 스펙트럼 출력에 관한.
여기 우리는 빨강, 파랑 및 백색 빛에 대 한 별도 LED 조명을 갖춘 기후 챔버를 설정 하 고 식물의 성장 시간이 지남에 따라 다른 매개 변수를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 신선한 무게, 잎 지역, stomata 밀도, 그리고 광합성 성능을 측정합니다. 같은 시간에 제대로 통계 평가를 설정의 중요성을 설명 합니다.
Protocol
이 프로토콜에는 A. thaliana 식물의 성장 행동을 분석 하는 방법의 몇 가지 예제가 있습니다.
1입니다. 준비
- 시작 하기 전에, 얼마나 많은 식물 실험의 신뢰할 수 있는 통계 분석 하 고 필요한 것입니다 그리고 다음 냄비의 적절 한 금액을 준비에 대 한 주의 깊은 계획을 확인 합니다.
참고: 항상 일부 씨앗 발 아 하지 수 가능성에 대 한 허용. - 다른 개별적으로 프로그래밍 가능 LED 수준의 기후 챔버를 사용 하 여 동일한 일반적인 환경 조건 (자료 테이블)에서 식물 성장 비교.
2. 식물 성장 및 LED 조명의 설정
- 6 x 7 cm 화분 토양의 (따라서 다른 조건 및 돌연변이 분석) 적절 한 수를 준비 하 고 그들의 각 하나의 씨를 설치.
참고:이 경우에, 조건 당 36 식물 했다 뿌려. - 4 ° c.에 2 일 vernalize
- 설정 상대적 공기 습도 65%와 온도를 22 ° C/16 ° C 16 h 하루 / 8 h 밤 주기. 모든 레벨 200 µ M/c m2/s1의 강렬의 빛을 조정 합니다. 이렇게 기후 상공 회의소의 전면에 터치 스크린을 통해 프로그램에 각각 값을 입력 합니다. 표 1에 제공 된 4 개의 다른 가벼운 질을 비교 하려면 다음 매개 변수를 Led를 설정 합니다.
| Identifyier | 395 nm [%] | 440 nm [%] | 3 K [%] | 660 nm [%] | 770 nm [%] |
| "햇빛" | 100 | 11 | 100 | 15 | 100 |
| 빨간색과 파란색 (RB) | 100 | 15 | 25 | 10 | 100 |
| 파랑 (B) | 100 | 15 | 25 | 2 | 25 |
| Red (R) | 90 | 2 | 25 | 10 | 100 |
표 1: Led에서 방출 하는 가벼운 강렬의 구성
- 스펙트럼 출력, 예를 들어 기본 제공 보정된 분석기를 사용 하 여 모니터링 합니다.
- 다른 수준에 기후 챔버에 식물을 배치 하 고 발달된 cotyledons 표시 될 때까지 투명 한 탑으로 덮여 유지. 식물은 충분히 물을 뿌린 다는 것을 확인 하십시오.
- 모니터와 문서 식물 눈으로 그리고 자주, 예: 2 일 마다 선택한 조건에서 얼마나 빨리 식물 성장에 따라 적절 한 사진으로. 카메라와 모든 사진에 대 한 개체 사이 동등한 거리를 확인 하 고 그로 인하여 비교를 사용 하는 카메라 삼각대를 사용 해야 합니다. 경우 적절 한 눈금 막대를 사용 합니다.
참고: 용어 DAS (파 종 후 일) vernalization를 포함 한 씨의 실제 설치를 말합니다.
3입니다. PSII의 결정
- 펄스 변조 fluorimeter를 사용 합니다. 설정 적절 한 거리에서 카메라 머리를 공장에서 완전 한 장미 라이브 윈도우에서 볼 수 있습니다.
- 소프트웨어 시작에 "선택 단위" 창이 나타납니다. "미니" 및 다음 "ok."를 체크 다음 팝업 창에서 "파란" 색을 선택 합니다. 클릭 "ok."
참고: 펄스 변조 형광 빛 측정은 자동으로 전환 됩니다. 모니터에서 이미지 창이 나타납니다 형광 매개 변수 Ft를 보여주는. 카메라 아래에 배치 하는 식물 이제 오렌지를 이미지로 볼 수 있습니다. - 이미지를 집중 하는 식물의 특정 영역을 선택, "라이브 비디오" 박스에 체크 함으로써 라이브 비디오를 전환 하 고 대물 렌즈의 조정 링을 설정 합니다. 라이브 비디오 창 오른쪽 상단에 있는 종료 상자를 클릭 하 여 종료 합니다.
- 광합성 매개 변수를 측정, 관심 (아오이)의 영역을 정의 합니다. 기본 설정을 사용 하 여이 자동으로 화면에 나타나는 원입니다. 그것의 옆에 빨간색 상자가 아오이 내의 모든 픽셀의 평균된 피트 값을 나타냅니다. 오른쪽 패널에서 다른 형태를 사용할 수 있는 아오이 상자에서 선택 하 여 적절 한 아오이 정의 합니다. 아오이 탭에서 "추가"를 클릭 하 고 리프 지역 내 원 장소. 잎 당 5 회를 반복 한다.
- 제조업체 (표 2)에서 제공 하는 기본 값 (오른쪽 탭) 설정을 유지 합니다.
| 측정 빛 | Int. | 주파수 | |
| 1 | 1 | ||
| 행동. 빛 | Int. | 너비 | |
| 8 | 0 | ||
| 이미지 수정 | 미니 | ||
| 이미지 변환 | 배터리 | ||
| 16.7V | |||
| 이득 | 5 | ||
| 댐핑 | 1 | ||
| 토 펄스 | Int. | 아니요 | 간격 s |
| 8 | 1 | 30 | |
| 천천히 유도 | 지연 s | 시계 s | 기간 s |
| 40 | 20 | 315 | |
| Absortivity | 빨간 이득 | 빨간 강도 | NIR 강도 |
| 340 | 25 | 13 | |
| 디스플레이 | 색 | ||
| 추 신: 제한 | 50 | ||
| Inh입니다. 참고. 아오이 | 1 | ||
| Fm 요소 (진드기) | 1,030 |
표 2: PAM 측정 제조 업체에 의해 제공에 대 한 기본 설정.
- 형광 분석 (채도 펄스)를 냉각 하 여 광합성 매개 변수 측정을 수행 하는 saturating 라이트 플래시를 적용 합니다. 그 전에, dark-adapted 식물의 최소 및 최대 형광 수확량을 측정 하 여 냉각 계수를 결정 합니다. 이 위해, (예를 들면 서랍 또는 어두운 상자) 몇 분 동안 어둠 속에서 공장을 놓습니다. 다음 카메라 머리 아래 공장, 확인란을 측정 및 ML (빛) 측정, 이미지 선택 "Fv/Fm"는 원으로를 클러킹 하 여 행 아래에 놓고 Fo, Fm 화면 하단의 클릭 합니다.
참고: Fo/Fm dark-adapted 식물의 PSII 수익률을 나타냅니다. 따라서, 그것은 빛을 적용 한 후 측정 정규화 된 값입니다. 현재 Fo/Fm 측정 새 레코드 활성화 될 때까지 유지 됩니다. 모든 F와 Fm' 채도 펄스에 의해 결정 값 Fo/Fm 관련 및 냉각 매개 변수 따라 계산 됩니다. - 보고서 탭에서 이러한 결과 찾아서 확인란 모든 오른쪽에 실험 (예관련 된. Y(II), qP, qN, 등).
- 분석 소프트웨어 예를 결과 내보냅니다. 왼쪽된 상단에 있는 내보내기 버튼을 클릭 하 여 및 적절 한 파일 이름 저장 합니다. 잎 당 적어도 5 개의 AOIs를 생성 하 고 동일한 식물의 여러 가지 잎을 측정 (잊지 마세요 곧 어두운 각 측정 후 다시 공장을 적응), 한 상태에서 몇 가지 식물 뿐만 아니라 있는 다음 통계적으로 평가.
- 통계 분석에 대 한 평균값 및 표준 편차에서에서 생성 모든 AOIs 모든 적어도 3 개의 독립적인 식물 포인트/조건 시간 하 고 학생의 t-테스트 데이터는 중요 한12평가를 수행. 데이터는 p-값이 0.05 이하로 크게 다른 것으로 평가 됩니다.
4입니다. Stomata 밀도의 결정
- 수집 3 완전히 확장 장미 잎 조건 당 3 개별 공장에서 엽록소를 추출 하 고 유리 페 트리 접시에 70% 에탄올으로. 하룻밤 실 온 이나 4 ° c.에가 게에서이 용 매에 품 어
- 안료에서 전체 클리어런스 chloral 하이드 레이트 솔루션에서 품 어 (chloral 하이드 레이트: 물: 글리세롤 = 8: 2: 1 w/v/w) 단풍이 완전히 흰색 나타날 때까지.
- 40 X 확대에서 미분 간섭 현미경 검사 법 (DIC) 이미지의 abaxial 표면을 가져가 라. Stomata 시야에 고 ² 당 stomata 눈금 막대의 도움으로 추정. 조건 당 단풍 4 적어도 위한이 절차를 반복 합니다. 한 조건의 모든 잎에 대 한 평균 값을 계산 하 여 통계 분석을 수행 하 고 평균 오차를 계산 하는이.
5입니다. 신선한 무게의 결정
- 면도날으로 조건 당 6 개의 식물에서 근 엽에서 자루를 포함 한 모든 잎을 제거 합니다. 즉시 모든 잎 무게 있으며 데이터 통계 분석을 위에서 설명한 대로.
6입니다. 장미 잎 지역 결정
- 조건 당 8 개의 식물에서 그림을 사용 하 여 리프 영역을 그래픽으로 분석. 하나의 이미지에서 한 조건에 대 한 그림을 결합 하 고 *.jpeg으로 저장 또는 *.tiff.
- 적절 한 소프트웨어 (자료 테이블)를 다운로드 합니다.
참고: 그것은, 물론,이 작업을 수행할 수 있는 다른 프로그램을 적용 하입니다. - 이미지 파일을 엽니다. 선택 도구 "무료 손을 선택." 잎을 자루의 한 장미를 포함 하 여 둘러싸십시오 "분석-측정 설정된" 클릭 "영역", "최소 및 최대 회색 값"을 체크 하 고 "통합된 밀도," 및 "평균 회색 값입니다." 적절 한 소수 장소, 최고의 2 또는 3을 선택 하 고 클릭 하십시오 "확인."
- M m를 픽셀 대신2 "규모 설정" 명령을 사용 합니다. 이미지의 눈금 막대에서 계산 다음 비율 설정 대화 상자를 열고이 정의 된 거리 및 단위를 입력 하기 쉽게 떠나 직경 예: 알려진된 거리에 해당 하는 라인 선택 하도록 직선 선택 도구 적용 측정입니다. 그런 다음 돌아가서 "분석" 하 고 "측정"을 클릭
- 새로운 창이 권리 "결과" 현재 장미에 대 한 관련 데이터를 포함 하는 나타납니다. 이미지에서 모든 식물을 가진이 절차를 반복 하 고 Ctrl + M 모든 새로운 공장에 대 한 측정 영역을 초기화 합니다.
참고: 겹치지 않는 잎을 가진 작은 식물에 대 한 "선택 도구"는 빠르고 쉽게 과정을 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 잎 서로 취재 시작,이 도구는 신뢰할 수 있는 결과 제공 하지 않습니다. - 또는, 모든 잎을 잘라 고 개요 그림 반입할 수 있습니다 및 다음 선택 도구를 사용 하 여 방법에 그들을 배치 합니다. 고려 때이 메서드를 사용 하 여 더 많은 식물 필요는.
- "파일"-"다른 이름으로 저장" 결과 창에서 컴퓨터 디렉터리에 적절 한 파일 이름 및 위치를 생성 하 고. Excel 형식으로 파일을 자동으로 저장 됩니다.
7입니다. RNA의 준비
- 모든 조건에 대 한 10 개의 개별 공장에서 3 샘플을 수확. 공장 제조 업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 전체 RNA를 추출 합니다. bioanalyzer을 사용 하 여 RNA 농도, 순도, 및 무결성을 확인 합니다. RNA 다음 예: RNASeq13여 qRT-PCR 또는 유전자 표정 분석 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
Representative Results
관찰 및 분석 식물의 성장과 특히 고기 돌연변이 식물에서의 안정적이 고 재현 가능한 환경 조건에 의존합니다. 이러한 기후 실에서 제공 될 수 있습니다. 수량을 빛 특히 품질은 비판적으로 고용된 광원 LED 조명에 의해 제공 된이 연구에는에 따라 달라 집니다.
그림 1 은 LED 패널을 갖춘 기후 챔버의 예가 나와 있습니다. 그림 1A 는 모든 기후 및 조명 상태를 조정할 수 있습니다 제어판의 화면을 보여 줍니다. 24 시간 이내 20 다른 시간 프레임을 설정할 수 있습니다. 이 예제에서는 16 빛/8 h 어두운 긴 하루 조건 프로그램 되어 있다. 이 챔버는 식물 성장에 4 개의 다른 가벼운 설정 정확 하 게 동일한 환경 조건 하에서 공부 될 수 있다 따로따로 프로그램 될 수 있는 4 개의 레벨을 갖추고 있습니다. 수준 왼쪽 위 기술적으로 가능한 만큼 햇빛을 흉내 낸 스펙트럼 출력 설정, 상단 오른쪽 수준 대표 상승 레드 (660 nm)와 라이트 블루 (440 nm) 하얀 빛 (3k) 감소. 왼쪽된 하위 수준 높은 푸른 빛을 주로 붉은 빛을 낮은 오른쪽 수준 설정 했다. 그림 1B (중간 패널)에 대 한 개요와 해당 확대/축소 기능 (외부 작은 패널)로 서 다른 설정에서 Led를 보여 줍니다. 빛 자질에 차이 눈으로 쉽게 볼 수 있습니다.
Inbuilt 분석기 지속적으로 측정, 모니터링, 고 스펙트럼 출력을 조정 합니다. 그림 2 상단 왼쪽된 수준에서 1.1, 태양 빛을 모방 하기 위해 설정 된 스펙트럼을 보여준다. 표준 형광 전구에 비해 자외선과 파란 빛의 부분 많은 더 높은7이다.
A. thaliana 의 예를 들어 그림 3 식물은 모든 4 개의 조건 10, 13, 17 일, 각각, 묘사는 파 종 후. 모든 식물은 삼각대에 카메라를 장착 하 여 같은 거리에서 촬영 했다. 눈금 막대는 1 cm를 나타냅니다. 10 일 후, 크기 또는 색상 별로 차이 분별 수 있습니다, 하지만 후 17 일 빨간 불빛 아래 빠른 성장을 분명 합니다. 이 시각적 분석 뿐만 아니라 여러 가지 생리 적 분석을 수행 했다.
그림 4 팸 측정의 다른 단계 분석 예: 광합성 능력을 따릅니다. 그림 4A 에서 라이브 비디오의 화면에 표시 됩니다, 초점으로 공장을 데 려에 대 한 설정입니다 측정의 최적의 품질을 보장. 전체 식물에 초점을, 대신 하나 분석을 단일 잎을 선택할 수도 있습니다. 그림 4B 실제 측정을 시작 하기 전에 현재 형광 수확량 dark-adapted 식물의 보여 줍니다. 이 경우 관심 (AOIs)의 5 개의 원형 영역 선정 됐다. 각 아오이 옆에 빨간 상자에 있는 숫자는 직접 테이블의 형태로 저장 될 수 있는 숫자 결과 제공 합니다. 광합성 매개 Fo의 측정을 시작, Fm 설정 해야 합니다. 이렇게 후 피트의 화면 그림 4C에 그려져 있습니다. Note는 지금 버튼 "Fo, Fm" 더 이상 활성화 하지 않습니다. 새로운 측정을 시작, "새로운 기록" 이전 정규화를 지우려면 클릭 해야 합니다. 마지막으로, 그림 4D saturating 빛 펄스 ("토-펄스")를 주고 효과적인 PSII 양자 수율 Y(II)를 보여 줍니다. 모범적인 데이터의 정량화는 그림 5에 표시 됩니다. 200 µ M/c m2/s1 (그림 5A)에 햇빛에서 성장 된 식물은 각각 12, 21, 28 일 파 종, 후 분석 되었다. 우리의 데이터 PSII 수율은 12 일 보다 3 주 동안 성장 식물에서 잎에 상당히 높은 보여줍니다. 28 12 일 사이의 차이점은 아직도 중요 한, 하지만 p-값이 큽니다. 그림 4B, 다른 빛 자질에서 2 주 동안 성장 하는 식물에서 PSII 수익률 비교 되었다. 흥미롭게도, 푸른 빛의 높은 부분을 포함 하는 빛의 밑에 영구 성장을 PSII의 상당히 큰 항복 이끌어 낸다. 풍부한 붉은 빛 아래에서 재배 하는 식물에 대 한 비슷한 효과 관찰 했지만 증가 약간 낮은.
다른 빛 질 효과 stomata 개발14에 표시 했다. 따라서, stomatal 밀도 조사 했다. 그림 6 에서는 색소 추출 후 잎 모양을 보여 줍니다. 단일 표 피 세포는 잘 구분할 수 있습니다, 그리고 stoma 쉽게 계산 하실 수 있습니다. 그림에서 개별 stomata는 별표로 표시 됩니다. 다른 조명 설정에서 식물의 stomatal 조밀도 대 한 자세한 데이터 다른9를찾을 수 있습니다.
육안 검사 (그림 3) 신선한 무게 제공 성장 발전의 좋은 측정을 합니다. 이 예제에서 후 파 종, 8, 10, 그리고 12 일 후 각각, "햇빛"에서 성장 된 식물에서 잎 무게 했다. 이러한 데이터의 통계적 평가 그림 7에서 볼 수 있습니다. 예상 했던 대로, 신선한 무게는 시간이 증가 합니다.
신선한 무게, 외 잎 지역 성장 위한 좋은 측정 이다. 여기, 공장 개발 (그림 8A) 파 종 후 10, 13, 17 일에서 뒤를 이었다. 6 개별 공장 신뢰할 수 있는 통계 자료를 정기적으로 평가 했다. 높은 샘플 크기의 중요성을 보여, 각각, 2 및 6 개의 식물 분석에서 평균 값의 백분율 오차 계산 되었다 (그림 8B). 즉, 평균 값에 대 한 표준 편차 비율 결정 했다. 작은 샘플 크기를 경우 오류 5-10% 보다 더 높은 샘플 크기의 경우는 매우 분명 하다. 평가 되는 식물의 수를 늘림으로써 오류 최소화할 수 있습니다, 훨씬 명확 하 게 데이터를 해석 하 게 하.
그림 1: 다른 빛 질 Led에 의해 제공 됩니다. A) LED 챔버의 컨트롤 패널에서 화면 캡처. 하루 길이 16 h (오른쪽 상단)에 설정 되 고 빛의 강도 200 µmol c m-2의 -1로 설정 됩니다. 빛 품질은 모든 4 개 수준에 다른: 1.1으로 가능한 기술적으로 햇빛에 비슷한 스펙트럼을 나타냅니다, 1.2 나타내는 빨간색과 파란색 파장 (RB) 빛의 높은 백분율, 2.1은 주로 파란색 (B), 2.2 대표 주로 빨간색 설정 빛 (R)입니다. B) 중간 패널; 모든 레벨에 대 한 개요를 보여 줍니다 외부 패널 높은 줌에서 개별 레벨을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시뮬레이션된 햇빛 설정에서 파장 스펙트럼. 1.1 수준 배치 했다 LED 챔버에 inbuilt 분석기에서 화면이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 주 발전 공장. 대표 A. thaliana 10, 13, 17 DAS에서 모든 4 개의 조명 조건에서 식물. 식물은 삼각대에 디지털 반사 카메라와 함께 촬영 했다. 눈금 막대는 모든 이미지에 대 한 1 cm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: A. thaliana 식물의 팸 측정의 대표적인 단계에서 스크린샷. A) 이미지 초점을 조정 될 수 있다 "비디오 라이브" 보기에서 화면 캡처. B) 어떤 광 펄스의 응용 프로그램 전에 현재 형광 항복 피트. C) Fo/변조가의 설정 후 현재 형광 항복 피트 D) saturating 빛 펄스를 설정한 후 효과 PSII 양자 수율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 효과 PSII 양자 수율 (YII)의 그래픽 표현. A) 에서 데이터 식물 파 종 후 12, 21, 28 일 및 성장된 미만 200 µ / cm2/s1 시뮬레이션된 태양 빛 아래에서 ("햇빛") 팸 분석 대상이 통계적으로 평가 했다. 5 일 당 5 개의 AOIs의 평균 값은입니다. 1 별표 나타냅니다 p-값이 상당한 차이 < 하루 12, 그리고 두 개의 별표 표시는 p-값이 매우 중요 한 차이에 비해 0.05 < 학생의 t-검정에 따라 0.02. B) 블루 200 µ / cm2 /s1 시뮬레이션된 햇빛 (SL), 아래 풍성 하 게 자란 식물 (B) 또는 빨간색 (R)에서 데이터 빛, 각각 통계적으로 평가 했다. 5 일 당 5 개의 AOIs의 평균 값은입니다. "햇빛"에 비해 상당한 차이 계산
그림 6: A. thaliana 잎의 abaxial 측에 stomata의 대표 이미지. 잎 위에서 설명한 대로 준비 하 고 시각적으로 DIC 설정 40 X 확대 가벼운 현미경 분석 했다. Stomata 조건 당 최소 4 잎의 가시 영역에 계산 됩니다. 그림이는 현미경 tubus에 연결 된 디지털 카메라와 함께 찍은. ² 당 stomata의 수는 눈금 막대의 도움으로 계산 됩니다. 별 하나의 stoma를 나타냅니다. 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: A. thaliana 식물에 성장에서 신선한 무게의 그래픽 표현을 시뮬레이션 햇빛/200 µ / cm2/s1. 장미 잎 10, 그리고 12 일 파 종 후 8, 식물에서 절단 했다. 하루 6 식물에서 mg에 평균값 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: A. thaliana 잎 지역 다른 조명 조건 하에서 성장 된 식물에서의 통계 평가. A) A. thaliana 10, 13, 17 일에 대 한 성장에서 리프 지역 ImageJ와 n 에서 데이터 그래픽 결정 했다 6 = 식물 통계적으로 평가 했다. 각 조건에서 모든 6 개의 근 엽에서 리프 지역 정리 되었고 평균 값을 6으로 나눈. 이 값과 표준 편차를 계산 하 고이 오차 막대에 의해 표시 됩니다. B) 잎 지역 ImageJ와 중 n 에서 데이터 그래픽 결정 했다 = 2 또는 n = 6 식물, 각각, 패널 A. 설명한 대로 통계적으로 분석 되었다 다음 평균 값의 %에서 오류 계산 하 고 그래픽으로 묘사 했다. N 의 분석에서 백분율 오류를 표시 하는 녹색 막대 = 6, n 에서 바 블루 = 2 식물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
식물 성장을 공부 하는 첫 번째 단계는 원하는 조건에 따라 기후 챔버 설정 합니다. 이것은 쉽게 (그림 1A) 해당 소프트웨어의 프로그램 마스크에 모든 변수를 입력 하 여 이루어집니다. 이 단계에서 많은 수정 빛 체제 또는 온도 변경 하 여 구현할 수 있습니다. 온도, 습도, 조명 조건 (그림 2) 실험을 망치고에서 기술적인 실패를 방지 하기 위해 지속적으로 모니터링 해야 합니다. 이것은 재현 가능한 결과 얻기위한 중요 한 포인트 이다. 이 설정 많은 변수를 제공 하 고 유연 하 게 조정 될 수 있다, 그것은 한계가 있다. 현재 사용할 수 있는 LED 조명은 백 % 햇빛을 모방 수 없습니다 그리고 기후 챔버 내부 기후 조건 결코 완전 하 게 반영 하 고 있습니다 외부15일어나.
널리 사용에 비해 형광 전구 LED 빛은 더 다재 다능 한, 더 적은 에너지를 필요로 하 고 거의 아니 열 방사선 표시. 이러한 장점을 기후 챔버와 Led16온실 장비 실내 농업의 큰 산업을 이끌어 왔습니다. 이 분야에서 보고 거 대 한 성공을 고려 LED 기술을 확실 하 게 많은 더 많은 애플 리 케이 션을 찾을 것입니다.
표현 형을 관찰 하 고 특히 고려 하는 것이 중요 하다 잎 면적의 결정에 대 한 이전 식물에 있는 잎 오버랩 (그림 3). 따라서, 전체 근 엽의 그래픽 평가 정확 하 경향이 있다. 이 경우, 그것은 훨씬 더 정확 하 게 하 고 거기에서 모든 잎을 잘라입니다.
성장 행동의 평가 성장 및 다른 조건 하에서 개발의 차이 특히 충분 한 샘플 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 6 식물 예: 광합성 수확량 (그림 5), 신선한 무게 (그림 7)의 결정에 대 한 사용 되 고 보장 하기 위해 연구의 시작에서 리프 지역 (그림 8A) 하지만 30 개별 씨앗 심어 그 첫 번째, 충분 한 씨앗 발 아 하 고 둘째, "전형적인" 식물의 선택 할 수 있다. 동일한 인구, 즉 정확한 동일한 조건 하에서 동일한 트레이 단일 냄비에 공장 내 에서도 다양 한 고기를 보여주었다. 이 다음 과정에 반영 됩니다 표준 편차 통계 분석 중 하지만 데이터의 해석 때 일반적으로 더 신뢰할 수 있는 작은 통계 오류 (그림 8B) 관찰 된다.
여러 매개 변수에 대 한 PAM (그림 4, 그림 5)에 의해 광합성 성능 측정을 할 수 있습니다. 이 경우에, 초점은 PSII 수율 예를 들어 Y(II)에 했지만 그것은 또한 예를 들어 비 광화학 냉각, 레 귤 레이트 및 비 레 귤 레이트 된 에너지 소비 또는 빛 면제의 양자 수율을 확인할 수 있습니다. 여기 잎 잎 표면에 균등 하 게 분산 당 적어도 5 개의 AOIs를 선택 하 고 다음 다른 식물에서 적어도 6 개의 잎을 측정 하는 중요 한. 이 방법의 단점은 PSI에 어떤 영향을 감지할 수 없습니다; 그 목적을 위해 다른 장비는 필요 하다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
F.S. 인정이 연구의 부분을 통해 Rhenac 그린 Tec AG에서 지원 합니다. 제와 B.B. DFG (SFB TR175)에서 자금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
| Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
| Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
| Software ImageJ | Free download from website | ||
| Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |
References
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