Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das Studium der Pflanze Wuchsverhalten und vor allem Phänotypen reproduzierbar. Wir zeigen wie Sie bieten Variable und in der gleichen Zeit stabilen Lichtverhältnissen. Richtige Analysen hängen ausreichend Probennummern und gültige statistische Auswertungen.
Abstract
Pflanze Biologen müssen oft Wuchsverhalten ihrer gewählten Arten beobachten. Zu diesem Zweck benötigen die Pflanzen konstant Umwelt- und stabile Lichtverhältnisse, die vorzugsweise variabel in Quantität und Qualität sind damit Studien unter verschiedenen Setups durchgeführt werden können. Diese Anforderungen werden durch Klimakammern mit Licht emittierenden Dioden (LED)-leuchten, die im Gegensatz zu Leuchtstoffröhren – auf verschiedenen Wellenlängen eingestellt werden können – erfüllt. LEDs sind Energie sparen und emittieren praktisch keine Wärme auch bei Lichtintensitäten, die oft ein Problem mit anderen Lichtquellen darstellt. Die vorgestellte Protokoll sieht eine schrittweise Anleitung zum Programmieren einer Klimakammer mit variabler LED-Leuchten ausgestattet sowie mehrere Ansätze für eingehende Analyse der Wachstum Phänotypen zu beschreiben. Je nach der Versuchsaufbau können verschiedene Eigenschaften der wachsenden Pflanzen beobachtet und analysiert werden. Hier beschreiben wir, wie Frischgewicht, Blattfläche, photosynthetische Aktivität und Stomata Dichte bestimmen. Wir zeigen, dass, um verlässliche Daten zu erhalten und gültige Schlüsse ist es zwingend erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Personen für die statistische Auswertung verwendet. Hohe statistische Fehler zu wenige Pflanzen für diese Art von Analyse-Ergebnisse an und folglich in weniger klaren Interpretation der Daten.
Introduction
Arabidopsis Thaliana wurde der Modellorganismus für Pflanzenforscher der molekularen Ära für mehr als zwei Jahrzehnten. Verschiedene Eigenschaften machen dieses kleine Vertreter der Familie der Brassica einen idealen Kandidat für die genetischen und molekularbiologischen Studien: Es hat ein relativ kleines Genom mit nur fünf Chromosomen (im Vergleich zu z.B. Nicotiana Tabacum mit 24 Chromosomen) und sein Genom wurde in 20001vollständig sequenziert. A. Thaliana durch Agrobacterium Infektion2 einfach genetisch modifiziert werden kann und sogar die neuesten genetischen Werkzeuge wie CRISPR/Cas3zugänglich ist. Obwohl klein, ist der Wachstumszyklus schnell genug, um biochemische Experimente möglich zu machen, wo eine höhere Menge an Material benötigt. Die Pflanzen wachsen auf Agarplatten oder am Boden und können sogar als flüssige Kulturen4kultiviert werden. Arabidopsis kann in klimatisch kontrollierten Schränke, z. B. von Percival, angebaut in Klimakammern oder in Gewächshäusern. Um zu vergleichen Wuchsverhalten und Phänotypen von Mutanten zu analysieren ist es wichtig, reproduzierbar und in der gleichen Zeit flexibles Wachstum Bedingungen5bieten. Je nach die wissenschaftliche Fragestellung, die angesprochen werden soll benötigen eine unterschiedliche Temperaturen und konstante Lichtverhältnisse, unterschiedlichen Lichtintensitäten oder verschiedenen Lichtqualitäten bei gleicher Temperatur. Licht ist ein sehr kritischer Parameter für das Pflanzenwachstum und seinen Einfluss ist oft in unterschiedlicher Ansätze6untersucht. Um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der erhobenen Daten ist es entscheidend eine stabile Leistung zu gewährleisten und die gleiche Art von Lichtquellen anwenden.
Die üblichen Lichtquellen in Gewächshäusern und Klimakammern bestehen aus Natrium-Dampf oder Leuchtstofflampen, die befriedigend Pflanzenwachstum zu fördern, sondern haben mehrere Nachteile. Erstens, Altern sie im Laufe der Zeit die spektrale Leistung ändert sich nicht nur in der Intensität, sondern in der Qualität (eigene Beobachtungen). Allerdings wird nur die Intensität in der Regel kontinuierlich überwacht, so dass eine Änderung der Lichtqualität könnte unbemerkt aber noch erhebliche Auswirkungen haben. Zweitens: beide Arten von Lampen erzeugen Wärme bei höheren Lichtintensitäten, die selbst hat einen großen physiologischen Einfluss auf das Pflanzenwachstum und könnte jeder abhängige Lichteffekt zu maskieren. Drittens ist die spektrale Ausgabe dieser Lichtquellen unveränderlich und ganz anders als das natürliche Sonnenlicht-7. Diese Nachteile sind bei LEDs überwunden)8,9,10,11. Sie haben eine lange Lebensdauer mit kaum Änderungen der Emission, produzieren keine Abwärme auch bei sehr hohen Lichtintensitäten und sie sind sehr flexibel bezüglich ihrer spektralen Leistung.
Hier zeigen wir, wie Einrichten einer Klimakammer mit separaten LED-Leuchten für rot, blau und weißes Licht und verschiedene Parameter des Pflanzenwachstums im Laufe der Zeit zu folgen. Wir messen Frischgewicht, Blattfläche, Spaltöffnungen Dichte und photosynthetischen Leistung. Zur gleichen Zeit zeigen wir, wie wichtig es ist, richtig einrichten statistische Auswertungen.
Protocol
Dieses Protokoll enthält einige Beispiele für Wuchsverhalten von A. Thaliana Pflanzen zu analysieren.
1. Vorbereitung
- Machen Sie bevor Sie beginnen einen sorgfältige Plan auf wie viele Pflanzen benötigt werden dafür eine zuverlässige statistische Analyse der Experimente und bereiten dann die entsprechenden Beträge von Töpfen.
Hinweis: Lassen Sie die Möglichkeit, die einige Samen nicht keimen können. - Verwenden Sie eine Klimakammer mit unterschiedlichen individuell programmierbare LED Pflanzenwachstum unter gleichen ökologischen Rahmenbedingungen (Materialtabelle) zu vergleichen.
2. Pflanzen Sie Wachstum und Aufbau der LED-Leuchten
- Bereiten Sie die entsprechende Anzahl (je nach unterschiedlichen Bedingungen und/oder Mutanten zu analysierenden) 6 x 7 cm Töpfe mit Erde und einen einzigen Samen in jedem von ihnen.
Hinweis: In diesem Fall wurden 36 Pflanzen pro Bedingungen ausgesät. - Vernalize für zwei Tage bei 4 ° C.
- Legen Sie die relative Luftfeuchte auf 65 % und die Temperatur auf 22 ° C/16 ° C für täglich 16 h / 8 h Nacht-Zyklus. Stellen Sie das Licht auf allen Ebenen zu einer Intensität von 200 µM/cm2/s1. Dazu geben die jeweiligen Werte in ein Programm über den Touchscreen auf der Vorderseite der Klimakammer. Um vier unterschiedliche Lichtqualitäten vergleichen stellen die LEDs auf folgende Parameter gemäß Tabelle 1.
| Identifyier | 395 nm [%] | 440 nm [%] | 3 K [%] | 660 nm [%] | 770 nm [%] |
| "Sonnenlicht" | 100 | 11 | 100 | 15 | 100 |
| Rot und blau (RB) | 100 | 15 | 25 | 10 | 100 |
| Blau (B) | 100 | 15 | 25 | 2 | 25 |
| Red (R) | 90 | 2 | 25 | 10 | 100 |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Lichtintensitäten von LEDs abgestrahlt wird
- Die spektrale Leistung kontinuierlich, z. B. mithilfe einer integrierten kalibrierten Spektrometer zu überwachen.
- Legen Sie die Pflanzen in der Klimakammer auf den verschiedenen Ebenen und halten sie mit einem transparenten Oberteil bedeckt, bis gut entwickelten Keimblätter sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die Pflanzen ausreichend bewässert werden.
- Überwacht und dokumentiert Pflanzen vom Auge und fotografisch so oft wie erforderlich, je nachdem, wie schnell die Pflanzen unter den gewählten Bedingungen, z.B. alle zwei Tage wachsen. Stellen Sie sicher, verwenden Sie ein Stativ für die Kamera zur Gewährleistung des gleiche Abstand zwischen Kamera und Objekt für alle Bilder und ermöglichen dadurch Vergleiche. Verwenden Sie eine Maßstabsleiste bei Bedarf.
Hinweis: Der Begriff DAS (Tage nach der Aussaat) bezieht sich auf die eigentliche Bepflanzung der Vernalisation einschließlich Samen.
3. Ermittlung der PSII Ertrag
- Verwenden Sie eine Puls-modulierten Fluorimeter. Der Kamerakopf in einem angemessenen Abstand von der Pflanze so richten Sie ein, dass die komplette Rosette auf das live-Fenster zu sehen ist.
- Nach dem Start der Software erscheint ein Fenster "ausgewählte Einheit". Kreuzen Sie "MINI" und dann "Ok". Wählen Sie die Farbe "blau" im folgenden Pop-up-Fenster. Klicken Sie auf "Ok."
Hinweis: Die Puls-modulierten Fluoreszenz Lichtmessung wird automatisch eingeschaltet. Auf dem Monitor erscheint das Bildfenster zeigt des Fluoreszenz-Parameters Ft. Eine Pflanze unter der Kamera platziert ist als orange Bild jetzt zu sehen. - Um das Bild zu konzentrieren und/oder wählen bestimmte Regionen der Pflanze, indem Sie das Kästchen "live-video" zu Live Video wechseln Sie und drehen Sie den Einstellring des Objektivs. Beenden Sie das LIVE-Video-Fenster durch Klicken auf die Exit-Box in der rechten oberen Ecke.
- Zur Messung der photosynthetischen Parameter definieren Sie einen Anwendungsbereich (AOI). Verwenden Sie die Standardeinstellung für das, was ein Kreis ist die automatisch in der Mitte des Bildschirms angezeigt wird. Das rote Feld daneben stellt den gemittelten Ft Wert alle Pixel innerhalb der AOI. Definieren Sie die entsprechenden AOI durch Auswahl aus der AOI-Box auf der rechten Seite, wo verschiedene Formen zur Verfügung stehen. Klicken Sie auf "hinzufügen" in der Registerkarte "AOI" und platzieren Sie den Kreis innerhalb der Blattfläche. Wiederholen Sie fünfmal pro Blatt.
- Pflegen Sie die Einstellungen (Registerkarte "auf der rechten Seite) auf die Standardwerte des Herstellers (Tabelle 2).
| MEAs Licht | Int. | Frequenz | |
| 1 | 1 | ||
| Handeln. Licht | Int. | Breite | |
| 8 | 0 | ||
| Bildkorrekturen | MINI | ||
| Bildtransformation | Akku | ||
| 16.7V | |||
| Zu gewinnen | 5 | ||
| Dämpfung | 1 | ||
| Sat-Puls | Int. | Nein | Intervall s |
| 8 | 1 | 30 | |
| Langsame Induktion | Verzögerung s | Uhr s | Dauer-s |
| 40 | 20 | 315 | |
| Absortivity | Rot Gain | Rot-Intensität | NIR-Intensität |
| 340 | 25 | 13 | |
| Anzeige | Farbe | ||
| PS Limit | 50 | ||
| Inh. Ref-AOI | 1 | ||
| FM-Faktor (ankreuzen) | 1.030 |
Tabelle 2: Standardeinstellungen für die PAM-Messungen, wie vom Hersteller vorgesehen.
- Wenden Sie eine Sättigung Lichtblitz um eine Messung der photosynthetischen Parameter durch fluoreszierende abschrecken Analyse (Sättigung Puls) durchzuführen. Davor bestimmen Sie abschrecken Koeffizienten durch Messung den minimalen und maximalen Fluoreszenz-Ertrag einer angepassten Pflanze. Stellen Sie zu diesem Zweck die Pflanze im Dunkeln (z.B. in einer Schublade oder dunklen Kasten) für ein paar Minuten. Dann stellen Sie die Pflanze unter den Kamerakopf, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Maßnahme und ML (Lichtmessung), in die Zeile darunter das Bild wählen "Fv/Fm" durch Taktung in den Kreis, und klicken Sie auf Fo, Fm am unteren Rand des Bildschirms.
Hinweis: Fo/Fm stellt die PSII Ausbeute einer angepassten Pflanze. So ist es der Wert, zu dem die Messung nach dem Auftragen Licht normalisiert ist. Die Strommessung Fo/Fm bleibt bis zur Aktivierung neuer Rekord. Alle F und Fm "durch Sättigung Impulse ermittelten Werte beziehen sich auf Fo/Fm und abschrecken Parameter werden entsprechend berechnet. - Finden Sie diese Ergebnisse in der Registerkarte "Bericht" zu und markieren Sie die Kästchen auf der rechten Seite, die relevant für das Experiment (zB. Y(II), qP, qN, etc.).
- Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Analyse Software zB. Zeichnen Sie sich durch einen Klick auf die Schaltfläche "exportieren" in der oberen linken Ecke und unter entsprechenden Dateinamen speichern. Mindestens fünf AOIs pro Blatt zu erzeugen und Messen Sie mehrere Blätter der gleichen Pflanze (vergessen Sie nicht zu kurz dunkel Anpassung die Pflanze wieder nach jeder Messung), sowie mehrere Pflanzen aus einer Bedingung, die können dann statistisch ausgewertet werden.
- Für statistische Analysen generieren Mittelwerte und Standardabweichungen von alle AOIs und mindestens drei unabhängige Anlagen für alle Zeit Punkte/Bedingungen und führen ein Student t-Test zu bewerten, ob die Daten erhebliche12sind. Daten werden als signifikant gewertet, wenn die p-Werte unter 0,05.
4. Bestimmung der Spaltöffnungen Dichte
- Sammle drei vollständig erweitert Rosette Blätter aus drei einzelnen Pflanzen pro Zustand zu 70 % Ethanol in einer Petrischale Glas und Chlorophyll zu extrahieren. In diesem Lösungsmittel über Nacht bei Raumtemperatur oder Shop bei 4 ° c inkubieren
- Für die volle Abfertigung von Pigmenten, brüten in Chloral Hydrate Lösung (Chloral Hydrate: Wasser: Glycerin = 8: 2: 1 w/V/w) bis Blätter komplett weiß erscheinen.
- Nehmen Sie differential Interferenz Mikroskopie (DIC) Bilder von der abaxial Oberfläche bei 40 X Vergrößerung. Zählen Sie Spaltöffnungen in das Blickfeld und mit Hilfe des Maßstabs zu Spaltöffnungen pro mm ² zu extrapolieren. Wiederholen Sie dieses Verfahren für mindestens 4 pro Bedingungen verlässt. Führen Sie statistische Analyse durch die Berechnung des Mittelwert für alle Blätter eine Bedingung und hieraus berechnet die mittleren Fehler.
5. Ermittlung der Frischgewicht
- Entfernen Sie alle Blätter einschließlich Blattstiele von Rosetten aus sechs Pflanzen pro Zustand mit einer Rasierklinge. Wiegen Sie alle Blätter sofort und unterwerfen Sie die Daten zu statistischen Analysen zu, wie oben beschrieben.
6. Bestimmung der Rosette Blattfläche
- Verwenden Sie Bilder aus acht Pflanzen pro Zustand, um die Blattfläche grafisch analysieren. Kombinieren Sie die Bilder für eine Bedingung in einem einzigen Bild und speichern Sie als *.jpeg oder * .tif.
- Laden Sie die entsprechende Software (Materialtabelle).
Hinweis: Es ist natürlich möglich ein anderes Programm in der Lage, diese Aufgabe anwenden. - Eine Image-Datei zu öffnen. Wählen Sie das Werkzeug "Freihand-Auswahl." Umschließen Sie Blätter einschließlich Blattstiele eine Rosette. Klicken Sie auf "Analyze - Set Messungen" und "Bereich", "Min & Max Grauwert" kontrollieren "Integrierte Dichte" und "Mittlere Grauwert." Wählen Sie geeignete Dezimal Plätze, am besten ist, zwei oder drei und klicken Sie auf "ok".
- Um mm zu erhalten2 anstelle von Pixeln mit dem Befehl "set Maßstab". Wenden Sie das geradlinige Auswahlwerkzeug um eine Zeilenauswahl zu treffen, die einem bekannten Abstand, z.B. Urlaub Durchmesser, der ist einfach entspricht zu berechnen aus der Maßstab der Bilder, dann öffnen Sie das Dialogfeld Maßstab gesetzt und geben diesem definierten Abstand und, an Messung. Dann gehen Sie zurück zu "analysieren" und klicken Sie auf "messen."
- Es erscheint ein neues Fenster berechtigt "Ergebnisse" enthält die relevanten Daten für die aktuelle Rosette. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei allen Pflanzen im Bild und initialisieren Sie Flächenmaße für jede neue Anlage mit Strg + M zu.
Hinweis: Für kleinere Anlagen mit nicht überlappenden Blätter das Zauberstab-Werkzeug lässt sich das Verfahren einfacher und schneller zu machen. Sobald die Blätter beginnen einander decken, geben dieses Tool nicht zuverlässige Ergebnisse. - Alternativ alle Blätter geschnitten Sie ab, und positionieren Sie diese in einer Weise, dass ein Übersichtsbild ergriffen werden können und verwenden Sie dann das Zauberstab-Werkzeug. Berücksichtigen Sie, dass bei Verwendung dieser Methode mehr Pflanzen benötigt werden.
- Wählen Sie "Datei"-"Speichern unter" im Ergebnisfenster und eine entsprechende Datei-Namen und einen Speicherort in das Computer-Verzeichnis erzeugen. Die Datei wird automatisch im Excel-Format gespeichert werden.
7. Vorbereitung der RNA
- Drei Proben aus zehn einzelnen Pflanzen für jeden Zustand zu ernten. Gesamt-RNS mit einer Pflanze RNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Bestimmen Sie RNA-Konzentration, Reinheit und Integrität mithilfe einer Bioanalyzer. RNA kann dann für downstream-Anwendungen wie z. B. qRT-PCR oder gen Expressionsanalyse von z.B. RNASeq13verwendet werden.
Representative Results
Beobachtung und Analyse von Pflanzenwachstum und vor allem Phänotypen von mutierten Pflanzen setzen auf stabile und reproduzierbare Umweltbedingungen. Diese können in Klimakammern werden zur Verfügung gestellt werden. Menge Licht und vor allem Qualität kritisch hängt von den eingesetzten Lichtquelle, die in dieser Studie von LED-Leuchten zur Verfügung gestellt wurde.
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Klimakammer mit LED-Panels ausgestattet. Abbildung 1A zeigt einen Screenshot des Control Panels wo alle klimatische und leichten Bedingungen angepasst werden kann. Innerhalb von 24 h können zwanzig verschiedenen Zeitrahmen festgelegt werden. In diesem Beispiel sind die langen Tag Bedingungen mit 16 Licht/8 h dunkel programmiert worden. Diese Kammer verfügt über vier Ebenen, die separat programmiert werden können, so dass Pflanzenwachstum bei vier verschiedenen Lichteinstellungen unter genau den gleichen Umweltbedingungen studiert werden kann. Die obere linke Ebene soll eine spektrale Leistung imitiert das Sonnenlicht so weit wie technisch möglich, die oberen rechten Ebene stellt erhöhte rot (660 nm) und blaues Licht (440 nm) mit weißes Licht (3K) reduziert. Die linke untere Ebene wurde auf erhöhte Blaulicht und der unteren rechten Ebene überwiegend rotes Licht gesetzt. Abbildung 1 b zeigt die LEDs mit den verschiedenen Einstellungen als eine Übersicht (mittlere Panel) und die entsprechenden Zoom-Plugins installieren (äußere kleine Platten). Die unterschiedliche Lichtqualitäten kann leicht mit dem Auge gesehen werden.
Eine eingebaute Spektrometer ständig misst, überwacht und passt die spektrale Leistung. Abbildung 2 zeigt das Spektrum von der oberen linken Ebene 1.1, die gegründet wurde, um Sonnenlicht zu imitieren. Im Vergleich zu einer standard-Glühbirne ist der Teil des UV- und Blaulicht viel höhere7.
In Abbildung 3 ein Beispiel von A. Thaliana Pflanzen aus allen vier Bedingungen 10, 13 und 17 Tagen bzw. nach Aussaat dargestellt wird. Alle Pflanzen wurden aus der gleichen Entfernung von Befestigung der Kamera auf einem Stativ fotografiert. Der Maßstabsbalken entspricht 1 cm. Nach 10 Tagen nicht viel Unterschied in der Größe oder Farbe, kann erkannt werden, aber nach 17 Tagen ein schnelleres Wachstum unter Rotlicht ist offensichtlich. Neben dieser visuellen Analyse wurden mehrere physiologische Untersuchungen durchgeführt.
Abbildung 4 folgt die verschiedenen Schritte der PAM-Messungen, die z. B. Photosynthesekapazität analysiert. In Abbildung 4A ist ein Screenshot von der live-Video gezeigt das ist die Einstellung für die Pflanze in den Vordergrund zu bringen, um optimale Qualität der Messungen zu gewährleisten. Anstatt die ganze Pflanze, kann man auch wählen, ein einzelnes Blatt zu analysieren. Abbildung 4 b zeigt die fluoreszierenden Stromausbeute Ft einer angepassten Pflanze vor die eigentliche Messung gestartet wurde. In diesem Fall wurden fünf Runden Interessensgebiete (AOIs) gewählt. Die Zahlen in den roten Kästchen neben jedem AOI gibt direkt das numerische Ergebnis, das auch in Form einer Tabelle gespeichert werden kann. Um eine Messung der photosynthetischen Parameter Fo einzuleiten, muss Fm festgelegt. Ein Screenshot von Ft nach auf diese Weise ist in Abbildung 4dargestellt. Beachten Sie, dass jetzt die Schaltfläche "Fo, Fm" nicht mehr aktiv ist. Um eine neue Messung zu starten, muss "Neuer Datensatz" angeklickt werden, um die vorherigen Normalisierung zu löschen. Abbildung 4 zeigt die effektive Quantenausbeute PSII Y(II) nach einem sättigbaren Lichtimpuls ("SAT-Pulse") geben. Quantifizierung der beispielhafte Daten ist in Abbildung 5dargestellt. Pflanzen unter Sonnenlicht bei 200 µM/cm2/s1 (Abb. 5A) wurden 12, 21 und 28 Tage nach der Aussaat bzw. analysiert. Unsere Daten zeigen, dass PSII Ausbeute deutlich höher in den Blättern von Pflanzen für drei Wochen als für 12 Tage. Der Unterschied zwischen 28 und 12 Tagen ist immer noch signifikant, aber der p-Wert ist höher. In Abbildung 4 bwurden PSII Erträge von Pflanzen für zwei Wochen von verschiedenen Lichtqualitäten verglichen. Interessanterweise führt ständige Wachstum unter Licht mit einem hohen Anteil an blauem Licht eine deutlich höhere Ausbeute an PSII. Ein ähnlicher Effekt wurde für unter angereicherten Rotlicht kultivierten Pflanzen beobachtet, aber der Anstieg war ein wenig niedriger.
Unterschiedliche Lichtqualitäten wurden Effekt Spaltöffnungen Entwicklung14gezeigt. Daher wurde die Stomata Dichte untersucht. Abbildung 6 zeigt, wie ein Blatt nach der Extraktion Pigment aussieht. Einzige Epidermiszellen gut unterschieden werden können, und Stoma leicht gezählt werden kann. In der Abbildung sind individuelle Spaltöffnungen durch ein Sternchen gekennzeichnet. Detaillierte Daten über die Stomata Dichte der Pflanzen aus den verschiedenen Lichteinstellungen finden Sie ebenfalls9.
Neben der Sichtkontrolle (Abbildung 3) bietet das Frischgewicht ein gutes Maß für den Fortschritt des Wachstums. In diesem Beispiel wurden die Blätter von Pflanzen unter "Sonnenlicht" nach 8, 10 und 12 Tage nach der Aussaat bzw. gewogen. Statistische Auswertung dieser Daten ist in Abbildung 7ersichtlich. Erwartungsgemäß steigt die Frischgewicht mit der Zeit.
Die Blattfläche ist neben Frischgewicht ein gutes Maß für Wachstum. Hier folgte die Pflanzenentwicklung aus 10, 13 und 17 Tage nach der Aussaat (Abb. 8A). Mindestens sechs einzelne Pflanzen wurden routinemäßig ausgewertet, um zuverlässige statistische Daten zu erhalten. Um die Bedeutung einer hohen Stichprobengröße zu demonstrieren, wurde der prozentualen Fehler des Mittelwertes, von zwei bis sechs Pflanzen, bzw. Analyse berechnet (Abbildung 8 b). Das bedeutet, dass der Prozentsatz der Standardabweichung in Bezug auf den Mittelwert ermittelt wurde. Es ist ganz klar, dass im Falle einer kleinen Stichprobe der Fehler zwischen 5-10 % höher als bei einer höheren Probengröße. Durch die Erhöhung der Anzahl der Pflanzen, die ausgewertet werden, kann die Fehler minimiert werden, wodurch die Interpretation der Daten viel klarer.
Abbildung 1: unterschiedliche Lichtqualitäten stammen von LEDs. (A) Screenshot aus dem Control Panel LED-Kammer. Tageslänge soll 16 h (oben rechts) und die Lichtintensität ist auf 200 µmol cm-2 s-1eingestellt. Die Lichtqualität ist anders auf allen vier Ebenen: 1.1 repräsentiert ein Spektrum als ähnlich wie das Sonnenlicht als technisch möglich, 1.2 stellt einen hohen Prozentsatz der roten und blauen Wellenlängen (RB) Licht, 2.1 befindet sich überwiegend auf blau (B), 2,2 stellt hauptsächlich rot Licht (R). B) der mittleren Spalte zeigt eine Übersicht über alle Ebenen; die äußeren Bereiche zeigen die einzelnen Ebenen in einem höheren Zoom. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Wellenlängenspektrum von simulierten Sonnenlicht Einstellungen. Ein Screenshot aus dem eingebauten Spektrometer in der LED-Kammer wird angezeigt, die Ebene 1.1 positioniert war. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Pflanzenentwicklung Tag(en). Repräsentative A. Thaliana Pflanzen aus allen vier Lichtverhältnissen von 10, 13 und 17 DAS. Pflanzen wurden mit einer digitalen Spiegelreflex-Kamera auf einem Stativ fotografiert. Maßstabsbalken entspricht 1 cm für alle Bilder. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Screenshots von repräsentativen Treppe von PAM-Messungen von A. Thaliana Pflanzen. A) Screenshot aus der "Live-Video" wo die Bildschärfe angepasst werden kann. B) Fluoreszenz-Stromausbeute Ft vor der Applikation Lichtimpulse. C) Fluoreszenz-Stromausbeute Ft nach Einstellung der Fo/zegit D) bewirken PSII Quantenausbeute nach Setzung einer Sättigung Lichtpuls. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: grafische Darstellung der bewirken PSII Quantenausbeute (YII). (A) Daten aus Pflanzen 12, 21 und 28 Tage nach der Aussaat und Anbau unter 200 µmol/cm2/s1 unter simulierten Sonnenlicht ("Sonnenlicht") PAM Analyse unterzogen wurden statistisch ausgewertet. Dargestellt sind die Mittelwerte von fünf Pflanzen und fünf AOIs pro Tag. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied mit einem p-Wert < 0,05 12 und zwei Sternchen sehr große Unterschiede mit einem p-Wert geben im Vergleich zu Tag < 0,02 laut Students' t-Test. B) Daten aus Pflanzen 200 µmol/cm 2/s1 unter simulierten Sonnenlicht (SL), bereichert blau (B) oder rot (R) Licht, bzw. wurden statistisch ausgewertet. Dargestellt sind die Mittelwerte von fünf Pflanzen und fünf AOIs pro Tag. Berechnet wurden signifikante Unterschiede im Vergleich zu "Sonne."
Abbildung 6: repräsentatives Bild der Spaltöffnungen abaxial seitlich ein A. Thaliana Blatt. Blätter wie oben beschrieben vorbereitet und wurden visuell unter einem Lichtmikroskop mit DIC Einstellungen bei 40 X Vergrößerung analysiert. Spaltöffnungen sind im sichtbaren Bereich mindestens 4 Blätter pro Zustand gezählt. Das Bild wurde aufgenommen mit einer digitalen Kamera an das Mikroskop Tubus angeschlossen. Die Anzahl der Spaltöffnungen pro mm ² errechnet sich mit Hilfe des Maßstabs. Sterne bedeuten ein einzelnes Stoma. Die Maßstabsleiste stellt 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: grafische Darstellung der Frischgewicht von A. Thaliana Pflanzen bei simuliert Sonnenlicht/200 µmol/cm2/s1. Rosette Blätter wurden aus Pflanzen, acht, zehn und zwölf Tage nach der Aussaat geschnitten. Mittelwerte in mg aus sechs Pflanzen pro Tag werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Statistische Auswertung von A. Thaliana Blattfläche von Pflanzen unter verschiedenen Lichtbedingungen. A) Blattfläche von A. Thaliana 10, 13 und 17 Tage lang gewachsen wurde grafisch ermittelt mit ImageJ und Daten von n = 6 Pflanzen wurden statistisch ausgewertet. Die Blattfläche aus allen sechs Rosetten aus jede Bedingung war fasste und geteilt durch sechs auf den Mittelwert zu erhalten. Mit diesem Wert die Standardabweichung berechnet wurde, und dies wird durch die Fehlerbalken dargestellt. B) Blattfläche wurde grafisch ermittelt mit ImageJ und Daten aus entweder n = 2 oder n = 6 Pflanzen, bzw. wurden statistisch analysiert, wie für Panel A. beschrieben Dann war der Fehler in Prozent des Mittelwertes berechnet und graphisch dargestellt. Grüne Balken zeigen die prozentuale Fehler aus der Analyse von n = 6, blau Bars von n = 2 Pflanzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Der erste Schritt bei der Untersuchung von Pflanzenwachstum ist die Einrichtung der Klimakammer nach den gewünschten Bedingungen. Dies geschieht ganz einfach indem Sie alle Variablen in der Programm-Maske der jeweiligen Software (Abbildung 1A) eingeben. Bei diesem Schritt können viele Änderungen implementiert werden, indem Sie ändern die vereinfachte Regelung und/oder Temperatur. Achten Sie darauf, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichtverhältnisse (Abbildung 2) zu verhindern, dass technisches Versagen ruinieren das Experiment ständig zu überwachen. Dies ist ein kritischer Punkt für reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Obwohl dieses Set-up viele Variablen bietet und flexibel angepasst werden kann, hat es seine Grenzen. Die derzeit verfügbaren LED-Leuchten können nicht dem Sonnenlicht eine hundertprozentige imitieren und die klimatischen Bedingungen in einer Klimakammer können nie vollständig reflektieren was außen15geht.
Im Vergleich zu den weit verbreiteten Leuchtstofflampen LED-Leuchten sind vielseitiger, benötigen weniger Energie und zeigen nahezu keine Wärmestrahlung. Diese Vorteile führten die Großindustrie innen Landwirtschaft, Klimakammern und Gewächshäuser mit LEDs16auszustatten. In Anbetracht der großen Erfolge berichtet in diesem Bereich die LED-Technik finden sicher viele weitere Anwendungen.
Bei der Beobachtung des Phänotyps und vor allem zur Bestimmung der Blattfläche ist es wichtig zu berücksichtigen Blätter, dass in älteren Anlagen Überlappung (Abbildung 3). Grafische Auswertung der gesamten Rosetten tendenziell so ungenau sein. In diesem Fall ist es sehr viel genauer auf alle Blätter abgeschnitten und gehen von dort aus.
Die Auswertung der Wuchsverhalten und vor allem die Unterschiede von Wachstum und Entwicklung unter verschiedenen Bedingungen hängt eine ausreichende Stichprobengröße. In dieser Studie mindestens sechs Pflanzen dienten zur Bestimmung von z.B. photosynthetischen Ertrag (Abbildung 5), Frischgewicht (Abbildung 7), und Blattfläche (Abb. 8A) aber 30 einzelne Samen gepflanzt wurden zu Beginn der Studie zu gewährleisten dass erstens genügende Samen keimen, und zweitens eine Auswahl der "typischen" Pflanzen erzielt werden. Sogar innerhalb der gleichen Bevölkerung, d.h. Pflanzen in einzelnen Töpfen in demselben Fach unter den exakten gleichen Bedingungen zeigten unterschiedliche Phänotypen. Dies spiegelt dann natürlich in die Standardabweichung bei der statistischen Analyse, aber die Interpretation der Daten ist in der Regel zuverlässiger, wenn kleine statistische Fehler (Abbildung 8 b) eingehalten werden.
Messung der photosynthetischen Leistungsfähigkeit von PAM (Abbildung 4, Bild 5) kann für mehrere Parameter erfolgen. In diesem Fall im Mittelpunkt standen PSII Ertrag Y(II) als Beispiel, aber es ist möglich, auch zu ermitteln, z. B. nicht photochemische abschrecken, die Quantenausbeute der regulierten und nicht regulierten Energie Verschwendung oder leichte Remission. Wichtig ist hier, wählen mindestens fünf AOIs pro Blatt gleichmäßig auf der Blattoberfläche verteilt und dann messen Sie mindestens sechs Blätter von verschiedenen Pflanzen. Der Nachteil dieser Methode ist, dass keine Auswirkungen auf die PSI nicht erkannt werden können; zu diesem Zweck braucht man verschiedener Geräte.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
F.s. räumt Unterstützung von Rhenac Green Tec AG durch Teile dieser Studie. J.s. und b.b. finanziell unterstützt von der DFG (SFB TR175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
| Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
| Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
| Software ImageJ | Free download from website | ||
| Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |
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