Summary
Presentiamo un metodo efficiente per studiare lens alloggio utilizzando una barella lente manuale. Il protocollo imita fisiologico alloggi tirando il zonules collegato intorno alla capsula di obiettivo, quindi, che allunga la lente.
Abstract
L'obiettivo del presente protocollo è quello di imitare la biomeccanica del fisiologico alloggio in maniera efficiente, pratico. Alloggio avviene attraverso la contrazione del corpo ciliare e rilassamento delle fibre zonule, che provoca l'ispessimento della lente necessaria per la visione da vicino. Qui, presentiamo un romanzo, un semplice metodo in cui alloggio è replicato da tensing zonules collegato alla capsula del cristallino tramite una barella di lente manuale (MLS). Questo metodo controlla l'allungamento radiale raggiunto da una lente quando sottoposti a una forza coerenza e consente un confronto di accogliere lenti, che possono essere allungati, a lenti non accomodante, che non possono essere allungati. D'importanza, le coppie di barella il zonules direttamente e non la sclera dell'occhio, così richiedendo solo la lente, zonules e corpo ciliare anziché il campione di tutto il globo. Questa differenza può ridurre notevolmente il costo di acquisto di lenti di donatore cadavere di circa 62% rispetto all'acquisizione di un intero globo.
Introduction
Alloggio è il processo mediante il quale l'occhio umano è in grado di regolare dinamicamente la forma del suo cristallino per vedere gli oggetti a distanze lontane o vicine a fuoco. Alloggio è un processo intrinsecamente biomeccanico. Su stimolo neurale, muscoli ciliari producono una forza sul corpo ciliare e per le fibre di zonule che applicare alla circonferenza della capsula di obiettivo1,2. Mentre ci sono diverse teorie dietro la biomeccanica di alloggi, il più ampiamente accettata è l'ipotesi di Helmholtz. Secondo l'ipotesi, la lente è in uno stato naturale allungato, corrispondente alla forma più sottile della lente che è ottimale per la messa a fuoco di oggetti distanti. Per cambiare messa a fuoco oggetti vicini, i muscoli ciliari si contraggono e si distendono le fibre zonulare. A sua volta, l'obiettivo si addensa, aumentando le curvature di superficie anteriore e posteriore. Questo corrisponde ad un aumento nel potere diottrico che è necessario per la visione, di conseguenza, una più breve lunghezza focale1da vicino.
La capacità di ospitare è compromessa nel tempo tramite una condizione denominata presbiopia. Interessa tutti entro i 50 anni, la presbiopia rende l'occhio in grado di modificare dinamicamente la messa a fuoco da lontano per chiudere distanze3. Per combattere la presbiopia, gli attuali metodi sono passivi tra cui lenti bifocali e lenti correttive. Aumentando la capacità di concentrarsi su oggetti vicini a alcuni aerei, tali trattamenti passivi non possono ripristinare la capacità di fuoco dinamico della lente4,5. Al fine di trattare in modo efficiente la presbiopia, o possibilmente prevenirlo, c'è un bisogno costante di comprendere meglio alloggi.
Per studiare lens alloggio, un numero di dispositivi è stato sviluppato per simulare il fenomeno ex vivo4,6,7,8,9. Dischi di filatura sono stati introdotti per monitorare l'allungamento della lente via forze centrifughe8. Per replicare più fedelmente il fenomeno, dispositivi di stretching lente sono stati gradualmente introdotti e innovati. Utilizzando una lente barella, Manns et al. caratterizzato la forza necessaria per accogliere la lente mentre correlando tale obiettivo potenza e diametro equatoriale9. Comprensione corrente è che la lente si irrigidisce con l'età, con conseguente cambiamento ridotto a forma di lente in risposta ad una forza uguale dal corpo ciliare3,10,11,12.
Corrente lente barelle spesso comportano un'installazione complessa, attuazione elettronica e programmabili tassi d'allungamento e richiede il cadavere intero bulbo oculare6,7,10,13. Questo requisito aumenta il costo per esperimento a oltre $500.00 per l'occhio e diminuisce la disponibilità del campione. Qui presentiamo un metodo per replicare lens alloggio a basso costo come l'occhio posteriore ammonta a circa $200,00. Mentre meno sofisticato rispetto a molti dispositivi utilizzati oggi, la tecnica è molto più redditizio e adottabile senza compromettere i risultati. Questo metodo è centrato intorno una barella di lente manuale (MLS), raffigurata in Figura 1e utilizza un esclusivo sistema di bloccaggio sulle fibre zonulare e un metodo di torsione radiale per espandere il diametro della lente. La precisione fisiologica del protocollo viene convalidata dai risultati di Bernal et al., che ha studiato il percorso attraverso il quale le fibre zonulare anteriori e posteriori sono collegate al capsula lente14. Utilizzando il design di scarpe personalizzate che richiedono solo la lente, zonule e corpo ciliare, abbiamo mirato a studiare lente biomeccanica replicando alloggi fisiologico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I protocolli seguenti sono accettati sotto l'Università del Maryland istituzionale Animal Care e Comitato di uso, nonché l'Institutional Review Board. I protocolli di seguono le norme federali, statali e locali, e gli orientamenti stabiliti dalla politica dell'Università del Maryland sulla biosicurezza.
1. dissezione del campione di occhio
-
Ottenere un campione di occhio dalla banca locale del macello o del tessuto. Se si ottiene un globo intero occhio, estrarre immediatamente la lente, annesso zonules e vitroso.
Nota: I dettagli specifici descritti di seguito si riferiscono agli occhi sia suini e umani.- Utilizzando le pinze e le forbici chirurgiche disinfettate, tagliare e rimuovere tutto il tessuto in eccesso che circondano la sclera.
- Tenere saldamente l'occhio sul suo lato e, utilizzando una lametta, praticare una piccola incisione lungo il lato dell'occhio 3 mm dalla cornea. Fare il taglio profondo abbastanza per aver raggiunto il vitreo all'interno dell'occhio.
- Utilizzando le forbici, tagliare con cura ulteriormente lungo l'incisione attorno alla circonferenza dell'occhio. Evitare di perforare la lente. Un'immagine rappresentativa è illustrata nella Figura 2A.
- Una volta che la circonferenza esterna dell'occhio è stata tagliata, rimuovere il tessuto posteriore dell'occhio usando il forcipe. Isolare la lente, zonules, corpo ciliare e il vitroso allegato con il forcipe. Un'immagine rappresentativa è illustrata nella Figura 2B.
- Usando le forbici e pinze, rimuovere vitroso in eccesso in modo che la lente può porre piatto sul MLS.
Nota: In caso di trapianto di cornea, il tasto corneale viene utilizzato in chirurgia e il resto del globo è disponibile per scopi di ricerca. Tuttavia, questo globo parziale ancora utilizzabile nella preparazione dei tessuti dell'apparato di barella lente. Se solo la parte posteriore è ottenuto, eseguire solo il passaggio 1.1.4–1.1.5.
- Disinfettare tutte le post-dissezione attrezzature usate in soluzione di candeggina al 15% per 30 min.
2. prova di montaggio della barella lente manuale
- Inserire i fondi di scarpa di 10 mm e il corrispondente scarpa top nella piastra inferiore della MLS così ci rimane un gap di 5 mm tra la parete posteriore del trattino scarpa e scarpa stessa.
- Allineare le piastre superiore e inferiore, scattare le piastre insieme; il dispositivo è ora in posizione di distenderla.
- Inserire le piastre nel caso la piastra e la vite di arresto nel foro situato sul lato della piastra di fondo.
- Inserire il caso di piastra base e inserire la chiave i trattini allineati.
- Ruotare la chiave in senso orario fino a raggiungere la vite di arresto per contratto le scarpe e torsione indietro in senso antiorario per restituire le scarpe nella posizione originale non stirata.
3. montaggio della lente
- Inserire il fondo scarpa 10 mm la piastra inferiore nella MLS affinché una 5 mm distanza tra rimane la parete posteriore del trattino la scarpa e la scarpa stessa.
- Usando il forcipe curvo, posizionare estratti lente a faccia in su al centro della piastra inferiore in modo che le scarpe stanno sostenendo la lente sopra il foro centrale.
- Incastrarsi parte superiore corrispondente delle scarpe, ritaglio solo gli zonules e vitroso. Verificare visivamente che la lente rimane come centrato possibile sulla piastra inferiore.
- Ripetere i passaggi da 2.3 – 2.4.
4. misurazione della lente
- Posizionare un sistema di imaging direttamente sopra l'apparato al fine di catturare video e immagini del processo d'allungamento. Assicurarsi di includere un righello nella cornice dell'immagine con precisione dimensioni e adattare le immagini in post-elaborazione.
Nota: Qualsiasi sistema di imaging adatto è sufficiente per questo passaggio; Qui usiamo un 12 megapixel, messa a fuoco automatica smartphone un piede dal campione. - Con fermezza ma senza intoppi, ruotare la chiave in senso orario per allungare la lente. La figura 3 Mostra immagini rappresentative allo stato distenderla e allungato.
- Dopo aver fotografato la lente allungata, ruotare la chiave in senso antiorario per ripristinare il campione al suo stato di riposo.
Nota: È indispensabile che la misura della lente viene eseguita in modo tempestivo al fine di ridurre al minimo la disidratazione della lente. - Chiaramente fotografare lo stato di riposo finale della lente.
5. analisi dei dati
- Caricare l'immagine di ImageJ e, utilizzare la funzionalità di "punto" per selezionare almeno 40 punti sulla circonferenza della lente come mostrato in Figura 4A. Utilizzare l'opzione di "Misurare" → "Analizza" per ottenere la posizione di ogni punto selezionato.
- Va bene (utilizzando software ad esempio MATLAB) i punti di posizione al fine di produrre un raggio e chi-quadrato del fit come mostrato in Figura 4B. Convertire il raggio dei pixel e l'errore in metriche utilizzando il righello fotografato.
- Eseguire due munito test t accoppiato al confronto una singola lente prima e dopo lo stretching da MLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Porcini occhi, un campione comune per lo studio della presbiopia tramite lente stretching4,15, sono stati ottenuti, (n = 10) da un mattatoio e il presente protocollo è stato utilizzato per osservare la capacità di alloggio delle lenti. Figura 5 A Mostra il confronto della lente porcino prima e dopo l'allungamento tramite MLS. C'era un aumento media 0,19 ± 0,07 mm raggio di lente quando allungato (p < 0,001), equiparazione ad un aumento di 1,62% 4,2 ± dal raggio originale. Alloggio è correlata con elasticità di obiettivo, di conseguenza, la differenza radiale tra posizione distenderla e allungata suggeriscono la possibilità di ospitare. Abbiamo trovato un consistente aumento in raggio di obiettivo post-stretching, che è d'accordo con simili studi16,17. La coerenza e la relativamente bassa deviazione all'interno dello studio ulteriore convalida nostro protocollo.
Questo protocollo consente il confronto di lenti scontroso e accomodante. La maggiore differenza radiale tra stato distenderla indica una maggiore capacità di ospitare. Per convalidare ulteriormente il protocollo, abbiamo osservato le abilità umana alloggio in funzione dell'età. Abbiamo testato un 21 anni e un occhio umano di anni 60 (The National malattia ricerca Interchange, Philadelphia, PA). I risultati, come illustrato nella Figura 5B, hanno indicato una diminuzione nella capacità di accogliere con l'età. Il raggio di 21 anni lente aumentato da 0.22 ± 0,13 mm o 5.2% al momento della estensione rispetto all'aumento di 0,099 mm o 0,14% ± 0.0059 della lente anni 60. È stato dimostrato che lenti umane perdono progressivamente la capacità di ospitare con età3. Questi risultati hanno dimostrato una differenza minore tra raggio allungato e distenderla della lente 60 anni rispetto all'obiettivo 21-year-old, che indica una perdita di abilità della sistemazione. Il vecchio obiettivo umano dimostrando una diminuita capacità di allungare è in accordo con studi simili su alloggi in funzione di età8,18,20.
Figura 1 : Schematico della barella lente manuale. (A) montato componenti della MLS, incluse le scarpe caso piastra, piastra superiore e piastra inferiore. (B) diagramma rappresentativo delle scarpe radialmente collegato al campione. (C) scarpa serrato in cui zonules (non raffigurato) sono collegati e allungato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini rappresentative del protocollo dissezione. (A), il campione di occhio sono state raccolte e la prima incisione lungo il globo sarà effettuata circa 3 mm dalla cornea. (B) il globo oculare è stato tagliato correttamente intorno alla sua circonferenza. Sclera (C), il posteriore è stato completamente separato dal globo. (D) la lente, vitreo, zonules e corpo ciliare sono stati isolati dal globo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immagine rappresentativa della lente distenderla e allungata tramite MLS. (A) la lente è tenuta all'interno del dispositivo, prima di straziante, nella sua posizione non stirata. (B), il dispositivo è attivato radialmente via la chiave, come la lente è allungata nella sua posizione allungata. Barra della scala = 10 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Immagini rappresentative dall'analisi dei dati dei campioni di obiettivo. (A) 50 selezionati punti sono stati selezionati sulla circonferenza del campione lente utilizzando software ImageJ. (B), il raggio calcolato era 37,4955 pixel, e il valore del chi quadrato della fit era 0,77636 pixel. Questi risultati cambierà da lente a lente, e i pixel devono essere convertiti in unità metriche utilizzando il righello fotografato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Raggio lente prima e dopo l'allungamento tramite la barella lente manuale. (A) distenderla e allungato raggi di 10 lenti suine sottoposti alla MLS. (B) grafico rappresentante dei raggi misurati di due lenti umane, 21 anni di età e 60 anni di età, prima e dopo lo stretching manuale lente. Le barre di errore in entrambi parte (A) e (B) rappresentano l'errore segnalato nel raccordo il perimetro della lente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Abbiamo messo a punto un nuovo metodo per fornire un accurato ed efficiente modo di studiare la capacità di alloggio dell'obiettivo utilizzando un meccanismo di bloccaggio dual-pezzo di accoppiare la barella al campione. Durante il soggiorno, si distende la lente e il diametro diminuisce in risposta a rilassamento del fibre zonular1,2,4,19. Il metodo si concentra su questo fenomeno di bloccaggio e controllando la tensione delle fibre zonulare. Per questo motivo, critica di cura deve adottare per morsetto zonules entro le scarpe per simulare perfettamente fisiologico lens alloggio. Per assicurare un corretto bloccaggio, la lente deve poggiare piatta contro il centro delle scarpe fondo con vitroso minimo fissato. Ulteriori dovrebbe prestare attenzione mentre straziante per garantire uguale estensione radiale viene eseguita intorno alla circonferenza della lente. Se l'allungamento lente sembra essere antivalenti, o se il zonules staccarsi dai morsetti, il campione deve essere rimontato se possibile.
Protocolli di allungamento lente simili si articola attualmente allo studio alloggio e presbiopia4,6,7,9,12. Tuttavia, questi protocolli sono generalmente complesse e costose, che richiedono complessi macchinari e software di programmazione. Inoltre, queste tecniche richiedono campioni di tutto l'occhio a oltre $500,00 per esperimento che diminuisce ulteriormente l'adozione diffusa. Il nostro protocollo aumenta la fattibilità sostituendo la programmazione della macchina con una lente manuale che allunga la disponibilità del sistema e campione richiedendo solo una frazione del campione. Il posteriore necessari dei costi occhio significativamente inferiore a $250.00 per esperimento. Tuttavia, esistono alcune limitazioni connesse con il nostro protocollo. Come precedentemente accennato, disallineamento della lente o tensione disuguale zonule si tradurrà in un allungamento inapplicabile. Inoltre, la straziante forza applicata non è misurata e quindi si basa sulla coerenza dell'utente per evitare lo sbloccaggio o lacerazione del zonules. Se il zonules dovesse strappare, il campione dovrà essere scartato come le scarpe MLS non sarebbe in grado di fissare sufficientemente. Gli sforzi futuri si concentreranno su quantificare la forza applicata per assicurare coerenza e rilevanza fisiologica. Inoltre, il protocollo prevede l'allungamento per essere aumentato fino a quando interrotta tramite la vite di arresto. Lo stretching non può, pertanto, essere modificato o variato tra campioni e piuttosto Visualizza uno stato completamente allungato o distenderla binario.
Prevenire o innovativo trattamento per presbiopia è un punto focale della ricerca oculare, poichè la circostanza è attualmente incurabile e inevitabile. Tuttavia, la biomeccanica di alloggio e presbiopia completamente non è capita. Il protocollo presentato consente una simulazione accurata della lente allungamento durante l'alloggio pur richiedendo meno materiale campione, la struttura dell'apparecchio e il tempo. Aumentando la disponibilità, il metodo consente più laboratori osservare e studiare la biomeccanica del lens alloggio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB ha interesse di proprietà in Bioniko Consulting LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Manual Lens Stretcher | Bioniko | MLS | Different animal species will require different shoe sizes |
| Porcine Eye Samples | George G. Ruppersberger; slaughterhouse | N/A | Whole eyeballs were obtained |
| Human Eye Samples | The National Disease Research Interchange | N/A | Posterior poles without corneas were ordered |
| Dissecting Scissors (5 1/2'' Straight) | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| Tissue Forceps (4 1/2'') | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| iPhone 6s | Apple | N/A | Any imaging system with ~0.1 mm resolution will work |
| Sodium Hypochorite | Clorox | Clorox Regular-Bleach | Any disinfectant will work |
References
- Von Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthal. 1, 1-74 (1855).
- Schachar, R. A., Black, T. D., Kash, R. L., Cudmore, D. P., Schanzlin, D. J. The mechanism of accommodation and presbyopia in the primate. Ann Ophthalmol. 27, 58-67 (1995).
- Glasser, A., Campbell, C. W. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Reilly, M. A., Hamilton, P. D., Perry, G., Ravi, N. Comparison of the behavior and natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88, 483-494 (2009).
- Langenbucher, A., Huber, S., Nguyen, N. X., Seitz, B., Gusek-Schneider, G. C., Küchle, M. Measurement of accommodation after implantation of an accommodating posterior chamber intraocular lens. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 677-685 (2003).
- Ehrmann, K., Ho, A., Parel, J. Biomechanical analysis of the accommodative apparatus in primates. Clin Exp Optom. 91 (4), 411 (2008).
- Pinilla Cortés, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926 (2015).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Eppig, T., et al. Biomechanical eye model and measurement setup for investigating accommodating intraocular lenses. Z Med Ohys. 23 (2), 144-152 (2013).
- Manns, F., Parel,, et al. Response of Human and Monkey Lenses in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (7), 3260 (2007).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Besner, S., Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. -H. In Vivo Brillouin Analysis of the Aging Crystalline Lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5093 (2016).
- Cortes, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926-2932 (2015).
- Bernal, A., Parel, J. -M., Manns, F. Evidence for Posterior Zonular Fiber Attachment on the Anterior Hyaloid Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (11), 4708 (2006).
- Kammel, R., Ackermann, R., Mai, T., Damm, C., Nolte, S. Pig Lenses in a Lens Stretcher. Optom Vis Sci. 89 (6), 908-915 (2012).
- Hahn, J., et al. Measurement of Ex Vivo Porcine Lens Shape During Simulated Accommodation, Before and After fs-Laser Treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- D'Antin, J. C., Cortes, L. P., Montenegro, G. A., Barraquer, R. I., Michael, R. Evaluation of a portable manual stretching device to simulate accommodation. Acta Ophthalmol. 93 (255), (2015).
- Pierscionek, B. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Marussich, L., et al. Measurement of Crystalline Lens Volume During Accommodation in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4239 (2015).
- Martinez-Enriquez, E., Pérez-Merino, P., Velasco-Ocana, M., Marcos, S. OCT-based full crystalline lens shape change during accommodation in vivo. Biomed Opt Exp. 8 (2), 918-933 (2017).
