Summary
Vi presenterar en effektiv metod att studera lins boende med hjälp av en manuell lins bår. De protokoll härmar fysiologiska boende genom att dra zonules ansluten runt linskapseln, därmed, stretching linsen.
Abstract
Målet med detta protokoll är att efterlikna biomekanik av fysiologiska boende på ett kostnadseffektivt och praktiskt sätt. Boende uppnås genom sammandragning av ciliarkroppen och avkoppling av zonule fibrer, vilket resulterar i förtjockning av linsen nödvändigt för nära vision. Här presenterar vi en roman, enkel metod där boende replikeras av spänna de zonules ansluten till linskapseln via en manuell lins bår (MLS). Denna metod övervakar den radiella stretching uppnås genom en lins när de utsätts för en konsekvent kraft och möjliggör en jämförelse av tillmötesgående linser, som kan sträckas, till icke-tillmötesgående objektiv, som inte kan sträckas. Båren par ännu viktigare, att zonules direkt, och inte sklera i ögat, vilket endast kräver linsen, zonules, och ciliarkroppen snarare än hela jordklotet provet. Denna skillnad kan avsevärt minska kostnaden för att förvärva givare cadaver linser med cirka 62% jämfört att förvärva en hela jordklotet.
Introduction
Boende är den process genom vilken det mänskliga ögat kan dynamiskt justera formen på dess kristallina linsen att se föremål på långt eller nära avstånd i skarpt fokus. Boende är en inneboende biomekaniska process. På neurala stimulans producera ciliär muskler en kraft på ciliarkroppen och till zonule fibrer som fäster på omkretsen av lins kapseln1,2. Medan det finns olika teorier bakom biomekanik av boende, är den mest accepterade hypotesen Helmholtz. Enligt hypotesen är linsen i en naturlig sträckt tillstånd, motsvarar den tunnaste formen av objektivet som är optimal för fokus för avlägsna objekt. För att ändra fokus till närmare objekt, ciliär muskler kontrakt och zonular fibrerna är avslappnad. I sin tur tjocknar linsen, öka de främre och bakre ytan krökningar. Detta motsvarar en ökning av dioptrisk effekt som är nödvändig för nära vision, därför en kortare brännvidd1.
Möjligheten att rymma äventyras över tid via ett tillstånd som heter presbyopi. Ålderssynthet drabbar alla av 50 år, och gör ögat inte dynamiskt ändra fokus från långt till nära avstånd3. För att bekämpa presbyopi, är nuvarande metoder passiva inklusive korrigerande linser och progressiva glasögon. Samtidigt ökar ens förmåga att fokusera på nära objekt på några plan, kan inte sådana passiva behandlingar återställa dynamiska fokus förmåga av linsen4,5. För att effektivt behandla ålderssynthet, eller möjligen förhindra det, finns det ett fortlöpande behov av att bättre förstå boende.
För att studera lins boende, har ett antal enheter utvecklats för att simulera fenomen ex vivo4,6,7,8,9. Spinning diskar först introducerades för att övervaka sträckningen av objektivet via centrifugalkraften8. För att mer troget efterbilda fenomenet, lins stretching enheter gradvis infördes och innovated. Använda en lins bår, Manns et al. kännetecknas den kraft som krävs för att rymma linsen medan korrelera sådan objektiv makt och ekvatorialdiameter9. Nuvarande uppfattning är att linsen stelnar med åldern, vilket resulterar i en minskad förändring i linsform som svar på en lika kraft från ciliarkroppen3,10,11,12.
Nuvarande objektiv bårar ofta innebär en komplex installation, genomförandet av elektronik och programmerbara stretching priser, och kräver hela cadaver ögongloben6,7,10,13. Detta krav ökar kostnaden per experiment till över $500.00 per öga och minskar prov tillgänglighet. Här presenterar vi en metod för att replikera lins boende till en låg kostnad som ögat bakre uppgår till cirka $200,00. Medan mindre sofistikerad än många enheter används idag, är tekniken mycket mer kostnadseffektiva och adoptable utan att kompromissa med resultatet. Denna metod är centrerad kring en manuell lins bår (MLS) avbildas i figur 1, och använder en unik fastspänningssystemet på zonular fibrer och en radiell vridande metod för att expandera diametern på linsen. Fysiologiska riktigheten av protokollet valideras av resultaten av Bernal et al., som studerat den vägen som främre och bakre zonular fibrerna är anslutna till objektiv kapsel14. Med utformningen av anpassade skor som endast kräver den lins, zonule och ciliarkroppen, vi syftar till att studera lins biomekanik genom att replikera fysiologiska boende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll accepteras enligt University of Marylands institutionella djur vård och användning kommittén samt de institutionella Review Board. Protokollen Följ federala, statliga och lokala normer och riktlinjer som anges av University of Maryland Policy om biosäkerhet.
1. dissektion av ögat prov
-
Få ett öga prov från lokala slakteriet eller vävnad bank. Om en hela ögat globe erhålls omedelbart extrahera den lins, bifogade zonules och glaskroppen.
Obs: De specifika detaljerna som beskrivs nedan avser både svin och mänskliga ögon.- Desinficeras kirurgisk sax och pincett, klippa och ta bort alla överflödiga vävnaden som omger sklera.
- Fast håller ögat på sin sida, och använda ett rakblad, göra ett litet snitt längs sidan av ögat 3 mm från hornhinnan. Göra den skära djupet nog ha nått glaskroppen inuti ögat.
- Använda sax, försiktigt skära ytterligare längs snittet runt omkretsen av ögat. Undvika punktering linsen. En representativ bild visas i figur 2A.
- När ögat utanför omkrets har skurits, ta bort den bakre vävnaden i ögat med hjälp av tången. Isolera linsen, zonules, ciliarkroppen och bifogade glaskroppen med pincett. En representativ bild visas i figur 2B.
- Med hjälp av sax och pincett, ta bort överflödig glaskroppen så linsen kan ligga platt på MLS.
Obs: I fall av hornhinnan transplantationen, korneal knappen används i kirurgi och resten av världen är tillgängliga för forskningsändamål. Här delvis världen kan dock fortfarande användas i vävnad utarbetandet av linsen bår setup. Om endast bakre erhålls, bara utföra steg 1.1.4–1.1.5.
- Desinficera alla begagnad utrustning efter dissektion i 15% blekmedel lösning för 30 min.
2. rättegång montering av manuella objektiv båren
- Sätt in 10 mm sko bottnarna och motsvarande sko toppar i bottenplattan i MLS så kvarstår ett 5 mm gap mellan den baksida väggen sko strecksatsen och skon själv.
- Rikta in de övre och nedre plattorna, knäppa plattorna tillsammans; enheten är nu i positionen utan töjning.
- Sätt plattorna i plattan fallet och propp skruven i hålet sitter på sidan av bottenplattan.
- Sätt plattan fallet i basen och placera skiftnyckeln i anpassat indrag.
- Vrida skiftnyckeln medsols tills den når stoppa skruven för att kontraktet skorna, och vrida tillbaka motsols tillbaka skorna till ursprungsläget utan töjning.
3. montering av linsen
- Sätt in 10 mm sko bottnarna i bottenplattan i MLS så att en 5 mm gap mellan förblir den baksida väggen av sko indraget och skon själv.
- Använda böjda pincetten, placera den extraherade objektiv uppåt på mitten av bottenplattan så att skorna stödja objektivet över centrala hålet.
- Snäpp motsvarande toppen av skorna på plats, klippning endast zonules och glaskroppen. Visuellt säkerställa att linsen förblir som centrerad som möjligt på bottenplattan.
- Upprepa steg 2,3 – 2.4.
4. mätning av linsen
- Placera en tänkbar system direkt ovanför apparaten för att fånga videor och bilder av stretching processen. Glöm inte att inkludera en linjal i ramen på bilden till exakt storlek och skala bilder i efterbehandlingen.
Obs: Någon lämplig imaging system är tillräcklig för detta steg; här använder vi en 12 megapixel, autofokus smartphone en fot från provet. - Fast ändå smidigt, rotera på skiftnyckeln i den medurs riktningen att sträcka objektivet. Figur 3 visar representativa bilder på tillståndet utan töjning och sträckt.
- Efter fotografering sträckt linsen, rotera på skiftnyckeln i moturs riktning för att återställa provet till dess vilotillstånd.
Obs: Det är viktigt att mätningen av linsen utförs i tid för att minimera dehydratisering av linsen. - Tydligt fotografera den slutliga vilotillstånd av linsen.
5. dataanalys
- Ladda upp bilden till ImageJ och välj minst 40 poäng runt omkretsen av linsen som visas i figur 4Amed funktionen ”point”. Använd alternativet ”mäta” → ”analysera” för att ge platsen för varje vald punkt.
- Passa (med programvara t.ex MATLAB) läge punkter för att ge en radie och chi-square passar som visas i figur 4B. Konvertera de Pixelradie och fel i mätvärden på fotograferade linjalen.
- Utföra Parat två tailed t-test att jämföra ett enskilt objektiv före och efter sträcker sig från MLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Svin ögon, ett vanligt prov för att studera presbyopi via linsen stretching4,15, erhölls, (n = 10) från ett lokalt slakteri och detta protokoll användes att iaktta boende möjligheten av linser. Figur 5 A visar jämförelsen av svin linsen före och efter stretching via MLS. Det fanns en genomsnitt 0,19 ± 0,07 mm radieökning linsen när den sträcks (p < 0.001), likställa en 4,2 ± 1,62% ökning från den ursprungliga radien. Boende är korrelerad med objektivet elasticitet, radiella skillnaden mellan utan töjning och sträckt ställning föreslår därför möjligheten att rymma. Vi hittade en konsekvent ökning i linsen radie efter stretching, som är överens med liknande studier16,17. Konsekvens och relativt låga avvikelsen inom studien ytterligare validerar vårt protokoll.
Detta protokoll tillåter jämförelse av både tillmötesgående och unaccommodating linser. Större radiella skillnaden mellan dess utan töjning tillstånd indikerar en större förmåga att rymma. För att ytterligare validera protokollet, observerat vi människors boende förmågor som en funktion av ålder. Vi testade en 21-åring och en 60 årig mänskliga ögat (The National sjukdom forskning Interchange, Philadelphia, PA). Resultaten, visade som visas i figur 5B, en minskad förmåga att rymma med åldern. 21 år gamla objektiv radien ökade med 0.22 ± 0,13 mm eller 5,2% vid stretching jämfört med den 0.0059 ± 0.099 mm eller 0,14% ökningen av 60 år gamla linsen. Det har visat att människors linser successivt förlorar förmågan att rymma med age3. Dessa resultat visade en mindre skillnad mellan sträckt och utan töjning radie av 60 år gamla objektivet jämfört med 21-åriga linsen, som visar en förlust av boende förmåga. Äldre människors linsen visar en minskad förmåga att sträcka är överens med liknande studier på boende som en funktion av ålder8,18,20.
Figur 1 : Schematisk av manuell lins båren. (A) den monterade komponenter i MLS, inklusive skor, platta fall, övre plattan och bottenplattan. (B) representativa diagram över skorna radiellt ansluten till provet. (C) fastklämd sko där de zonules (ej avbildad) är ansluten och sträckt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa bilder av dissektion protokollet. (A), ögat provet har samlats och första snittet längs hela världen kommer att göras ca 3 mm från hornhinnan. (B) i ögat världen har skurits korrekt runt dess omkrets. (C), bakre sklera har varit helt separerade från Globen. (D) den linsen, glaskroppen, zonules och ciliarkroppen har isolerats från Globen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativ bild av utan töjning och sträckt objektivet via MLS. (A) linsen hålls inom enheten, före vridande, i positionen utan töjning. (B) enheten stängs radiellt via skiftnyckeln, som linsen sträcks till sin avlånga position. Skalstapeln = 10 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa bilder från dataanalys av linsen prover. (A), 50 utvalda punkter valdes på omkretsen av linsen provet med ImageJ programvara. (B), beräknade radien var 37.4955 pixlar och 0.77636 pixlar Chi2 värdet av passformen. Dessa resultat kommer att ändras från lins-till-lins och pixlarna måste konverteras till metriska enheter på fotograferade linjalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Lins radie före och efter sträckning via manuell lins båren. (A) den utan töjning och sträckt radierna av 10 svin linserna utsätts för MLS. (B) representativa diagram över uppmätt radierna av två mänskliga linser, 21 år och 60 år gamla, före och efter manuell lins stretching. Felstaplar i både del a och b representerar rapporterade felet i passande omkretsen av linsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utarbetat en ny metod för att ge ett korrekt och effektivt sätt att studera boende möjligheten av linsen genom att utnyttja en dual-bit fastspänningsmekanismen att båren till provet. Under boende, linsen slappnar och diametern minskar svar på avkoppling av zonular fibrer1,2,4,19. Metoden fokuserar på detta fenomen genom fastspänning och kontrollera spänningen av zonular fibrer. Av denna anledning måste intensivvård man klämma zonules inom skor att noggrant simulera fysiologiska lins boende. För att säkerställa korrekt fastspänning, bör objektivet vila plant mot mitten av botten skorna med minimal glaskroppen bifogas. Ytterligare försiktighet iakttas samtidigt rycks loss att säkerställa lika radiella stretching utförs runt omkretsen av linsen. Om linsen sträckningen verkar vara nonequivalent, eller om zonules lossna från klämmorna, måste provet vara återmonteras om möjligt.
Liknande objektiv stretching protokoll genomförs för närvarande för att studera boende och presbyopi4,6,7,9,12. Dessa protokoll är dock allmänt komplicerat och dyrt, som kräver invecklade maskineriet och programmering. Dessutom, kräver dessa tekniker hela ögat prover på över $500.00 per experiment som ytterligare minskar utbredd användning. Våra protokoll ökar genomförbarhet genom att ersätta den maskinen-programmeringen med en manuell lins stretching system och prov tillgänglighet av som endast kräver en bråkdel av provet. Den behövliga bakre delen av ögat kostnaderna betydligt mindre på $250.00 per experiment. Det finns dock vissa begränsningar som är associerade med våra protokoll. Som tidigare nämnts, feljusteringen av linsen eller ojämlika zonule spänning kommer att resultera i en tillämplig stretching. Dessutom den vridande kraft mäts inte och därmed bygger på konsekvensen av användaren att förhindra maskinpaletterna eller slita av zonules. Om zonules var att riva, måste provet kasseras eftersom MLS skorna inte skulle kunna tillräckligt klämma. Framtida insatser inriktas på att kvantifiera den tillämpliga kraften att säkerställa samstämmighet och fysiologiska betydelse. Dessutom innebär protokollet sträckningen för att ökas tills stoppades av stoppa skruven. Den stretching inte, därför, kan ändras eller varierade mellan prover och snarare visar ett binärt fullt sträckt eller utan töjning tillstånd.
Förebygga eller innovativ behandling för presbyopi är en brännpunkt okulär forskning, som villkora för närvarande är oundvikliga och behandlingsbart. Biomekanik av boende och presbyopi är dock inte helt klarlagda. Presenterade protokollet möjliggör en exakt simulering av linsen stretching under boende samtidigt som kräver mindre provmaterial, konstruktion och tid. Genom att öka tillgängligheten, möjliggör metoden fler laboratorier för att observera och studera biomekanik av linsen boende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB har ägarandel i Bioniko Consulting LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Manual Lens Stretcher | Bioniko | MLS | Different animal species will require different shoe sizes |
| Porcine Eye Samples | George G. Ruppersberger; slaughterhouse | N/A | Whole eyeballs were obtained |
| Human Eye Samples | The National Disease Research Interchange | N/A | Posterior poles without corneas were ordered |
| Dissecting Scissors (5 1/2'' Straight) | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| Tissue Forceps (4 1/2'') | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| iPhone 6s | Apple | N/A | Any imaging system with ~0.1 mm resolution will work |
| Sodium Hypochorite | Clorox | Clorox Regular-Bleach | Any disinfectant will work |
References
- Von Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthal. 1, 1-74 (1855).
- Schachar, R. A., Black, T. D., Kash, R. L., Cudmore, D. P., Schanzlin, D. J. The mechanism of accommodation and presbyopia in the primate. Ann Ophthalmol. 27, 58-67 (1995).
- Glasser, A., Campbell, C. W. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Reilly, M. A., Hamilton, P. D., Perry, G., Ravi, N. Comparison of the behavior and natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88, 483-494 (2009).
- Langenbucher, A., Huber, S., Nguyen, N. X., Seitz, B., Gusek-Schneider, G. C., Küchle, M. Measurement of accommodation after implantation of an accommodating posterior chamber intraocular lens. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 677-685 (2003).
- Ehrmann, K., Ho, A., Parel, J. Biomechanical analysis of the accommodative apparatus in primates. Clin Exp Optom. 91 (4), 411 (2008).
- Pinilla Cortés, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926 (2015).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Eppig, T., et al. Biomechanical eye model and measurement setup for investigating accommodating intraocular lenses. Z Med Ohys. 23 (2), 144-152 (2013).
- Manns, F., Parel,, et al. Response of Human and Monkey Lenses in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (7), 3260 (2007).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Besner, S., Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. -H. In Vivo Brillouin Analysis of the Aging Crystalline Lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5093 (2016).
- Cortes, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926-2932 (2015).
- Bernal, A., Parel, J. -M., Manns, F. Evidence for Posterior Zonular Fiber Attachment on the Anterior Hyaloid Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (11), 4708 (2006).
- Kammel, R., Ackermann, R., Mai, T., Damm, C., Nolte, S. Pig Lenses in a Lens Stretcher. Optom Vis Sci. 89 (6), 908-915 (2012).
- Hahn, J., et al. Measurement of Ex Vivo Porcine Lens Shape During Simulated Accommodation, Before and After fs-Laser Treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- D'Antin, J. C., Cortes, L. P., Montenegro, G. A., Barraquer, R. I., Michael, R. Evaluation of a portable manual stretching device to simulate accommodation. Acta Ophthalmol. 93 (255), (2015).
- Pierscionek, B. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Marussich, L., et al. Measurement of Crystalline Lens Volume During Accommodation in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4239 (2015).
- Martinez-Enriquez, E., Pérez-Merino, P., Velasco-Ocana, M., Marcos, S. OCT-based full crystalline lens shape change during accommodation in vivo. Biomed Opt Exp. 8 (2), 918-933 (2017).
