Summary
Presenteren we een efficiënte methode van het bestuderen van lens accommodatie met behulp van een manuele lens brancard. Het protocol nabootsers fysiologische accommodatie door te trekken van de zonules rond de capsule van de lens, waardoor aangesloten, zich uitstrekt van de lens.
Abstract
Het doel van dit protocol is na te bootsen de biomechanica van fysiologische accommodatie op een kostenefficiënte en praktische wijze. Accommodatie wordt bereikt door de samentrekking van het straalvormig lichaam en ontspanning van zonule vezels, wat in de verdikking van de lens nodig voor in de buurt van visie resulteert. Hier presenteren we een roman, de eenvoudige methode waarbij onderdak wordt gerepliceerd door het spannen van de zonules verbonden met de capsule van de lens via een manuele lens brancard (MLS). Deze methode controleert de radiale rekken bereikt door een lens als een consistente kracht wordt uitgeoefend en zorgt voor een vergelijking van de opvang van lenzen, die kunnen worden uitgerekt, aan niet-opvang lenzen, die niet kunnen worden uitgerekt. Nog belangrijker is, de brancard paren aan de zonules rechtstreeks, en niet aan de sclera van het oog, zodat die alleen de lens, zonules, en straalvormig lichaam in plaats van het monster van de hele wereld. Dit verschil kan leiden tot aanzienlijke afname van de kosten van het verwerven van donor cadaver lenzen met ongeveer 62% in vergelijking met een hele wereld verwerven.
Introduction
Accommodatie is het proces waarbij het menselijk oog kunnen dynamisch aanpassen van de vorm van de ooglens om objecten op ver of dichtbij afstanden scherp in beeld te zien is. Accommodatie is een intrinsiek biomechanische proces. Op neurale stimulans produceren de Ciliaire spieren een kracht op het straalvormig lichaam en de zonule vezels die aan de omtrek van de lens capsule1,2 hechten. Hoewel er verschillende theorieën achter de biomechanica van de accommodatie, is de meest algemeen aanvaarde de hypothese van Helmholtz. Volgens de hypothese is de lens in een natuurlijke uitgerekte toestand, overeenkomt met de dunste vorm van de lens die optimaal is voor de focus van verre objecten. Om de focus te verplaatsen naar nauwere objecten, de Ciliaire spieren contract en de zonular vezels zijn versoepeld. Op zijn beurt, dikker de lens, verhoging van de voorste en achterste oppervlak kromming. Dit komt overeen met een toename van de DIOPTRISCHE kracht die nodig om in de buurt van visie, dan ook een kortere brandpuntsafstand1 is.
De mogelijkheid om tegemoet te komen is aangetast na verloop van tijd via een aandoening genaamd presbyopie. Invloed op iedereen door leeftijd 50, maakt presbyopie het oog niet in staat om dynamisch te wijzigen focus van afstanden3sluiten toe. Ter bestrijding van presbyopie, zijn huidige methoden passieve met inbegrip van corrigerende lenzen en Bifocaal. Terwijl het verhogen van iemands vermogen om te concentreren op nauwe objecten op paar vlakken, herstellen niet zo'n passieve behandelingen het dynamische focus vermogen van de lens4,5. Om efficiënt behandelen van presbyopie, of eventueel te voorkomen, is er een voortdurende behoefte aan onderdak beter te begrijpen.
Om te bestuderen objectief accommodatie, zijn een aantal apparaten ontwikkeld om te simuleren het fenomeen ex vivo7,8,voor4,-6,9. Draaiende schijven werden geïntroduceerd om te controleren de rekken van de lens via middelpuntvliedende krachten8. Als u wilt meer getrouw repliceren het fenomeen, werden lens uitrekken zich apparaten geleidelijk geïntroduceerd en vernieuwd. Met behulp van een lens brancard, Manns et al. de kracht die nodig is voor de lens terwijl het correleren van deze lens macht en Equatoriale diameter9gekenmerkt. Huidige begrip is dat de lens met de leeftijd verstijft, wat resulteert in een verminderde verandering in de vorm van de lens in reactie op een gelijke kracht van het straalvormig lichaam3,10,11,12.
Huidige lens brancards vaak betrekken van een ingewikkelde configuratie, uitvoering van elektronica en programmeerbare uitrekkende tarieven, en vereist het hele kadaver oogbol6,7,10,13. Deze eis verhoogt de kosten per experiment om meer dan $500.00 per oog en vermindert de beschikbaarheid van de steekproef. Hier presenteren we een methode voor het repliceren van lens accommodatie tegen lage kosten, zoals het oog posterieure circa 200,00 dollar bedraagt. Tijdje minder verfijnd dan veel apparaten gebruikt vandaag, is de techniek veel meer kosteneffectieve en adoptable zonder afbreuk te doen aan de resultaten. Deze methode is gecentreerd rond een manuele lens brancard (MLS) afgebeeld in Figuur 1, en gebruikt een unieke klemmen systeem op de zonular vezels en een radiale kronkelende methode om uit te breiden van de diameter van de lens. De fysiologische nauwkeurigheid van het protocol wordt gevalideerd door de bevindingen van Bernal et al.., die het pad waarlangs de anterieure en posterieure zonular vezels zijn aangesloten op de lens capsule14studeerde. Met behulp van het ontwerpen van aangepaste schoenen waarvoor alleen de lens, de zonule en het straalvormig lichaam, we gericht om te bestuderen objectief biomechanica door het repliceren van fysiologische accommodatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende protocollen worden geaccepteerd onder de Universiteit van Maryland institutionele Animal Care en gebruik Comité, alsmede de institutionele Review Board. De protocollen volgen federale, staats- en lokale normen en de richtsnoeren die zijn vastgelegd door het beleid van de Universiteit van Maryland inzake bioveiligheid.
1. dissectie van Eye monster
-
Een oog monster verkrijgen bij lokale slachthuis of weefsel bank. Als een oog van de hele wereld wordt verkregen, onmiddellijk pak de lens, glasvocht en bijgevoegde zonules.
Opmerking: De specifieke details hieronder beschreven heeft betrekking op zowel de varkens en de menselijke ogen.- Gebruik van ontsmet chirurgische schaar en pincet, snij en verwijder alle overtollige weefsel rondom de sclera.
- Stevig houdt het oog op zijn kant, en met behulp van een scheermesje, maken een kleine snede langs de kant van het oog 3 mm afstand van het hoornvlies. Controleer de gesneden diep genoeg te hebben bereikt het glasvocht in het oog.
- Met behulp van schaar, zorgvuldig gesneden verder langs de incisie rond de omtrek van het oog. Vermijd het prikken van de lens. Een representatieve afbeelding wordt getoond in Figuur 2.
- Zodra de buitenomtrek van het oog heeft verlaagd, verwijder het posterieure weefsel van het oog met behulp van de verlostang. Het isoleren van de lens, zonules, straalvormig lichaam en de bijgevoegde glasvocht met een tang. Een representatieve afbeelding wordt getoond in Figuur 2B.
- Schaar en pincet gebruikt, Verwijder overtollige glasvocht, zodat de lens plat op de MLS leggen kan.
Opmerking: In geval van hoornvlies transplantatie, het hoornvlies knop wordt gebruikt in de chirurgie en de rest van de wereld is beschikbaar voor onderzoeksdoeleinden. Deze gedeeltelijke wereldbol kan echter nog steeds worden gebruikt bij de voorbereiding van het weefsel van de lens brancard setup. Als alleen de posterior wordt verkregen, alleen uitvoeren stap 1.1.4–1.1.5.
- Desinfecteer alle gebruikte apparatuur na dissectie in 15% bleekwater oplossing voor 30 min.
2. proef vergadering van de handleiding Lens brancard
- Plaats de bodem van de schoen 10 mm en de bijbehorende schoen toppen in de bodemplaat van de MLS dus er een kloof van 5 mm tussen de achterste muur van de schoen streepje en de schoen zelf blijft.
- Uitlijnen van de boven- en onderkant platen, magnetisch uitlijnen van de platen samen; het apparaat is nu in de zonder rek positie.
- Plaats de platen in het geval van de plaat en de schroef van de stop in het gaatje aan de zijkant van de bodemplaat.
- Het geval van de plaat in de base invoegen en plaats de moersleutel in de inspringingen uitgelijnd.
- Draai de sleutel rechtsom totdat de schroef stoppen om de schoenen van het contract, en draai weer linksom naar de schoenen terug te keren naar de oorspronkelijke zonder rek positie wordt bereikt.
3. montage van de Lens
- De bodem van de schoen 10 mm in de bodemplaat in de MLS invoegen, zodat een 5 mm kloof tussen blijft de achterste muur van de inspringing van de schoen en de schoen zelf.
- Plaats de uitgepakte lens gezicht-omhoog op het midden van de bodemplaat met gebogen pincet, zodat de schoenen zijn het ondersteunen van het objectief over het gat in het midden.
- Vastklikken overeenkomstige boven aan de schoenen, alleen de zonules en het glasvocht knippen. Visueel te zorgen dat de lens blijft als gecentreerde tekst mogelijk op de bodemplaat.
- Herhaal stap 2.3-2.4.
4. meting van de Lens
- Plaats een imaging systeem direct boven het apparaat om te vangen van video's en foto's van de uitrekkende proces. Zorg ervoor dat een heerser in het frame van de afbeelding nauwkeurig grootte en de schaal afbeeldingen in post-processing opnemen.
Opmerking: Elk geschikt imaging systeem is voldoende voor deze stap; hier gebruiken we een 12 megapixel, autofocus smartphone één voet uit het monster. - Stevig en toch soepel, draaien de moersleutel in de richting van de klok te rekken van de lens. Figuur 3 toont representatieve beelden op de zonder rek en uitgerekte toestand.
- Na het fotograferen de uitgerekte lens, draaien de moersleutel in de tegenwijzerzin om te herstellen van het monster naar haar rusttoestand.
Opmerking: Het is noodzakelijk dat de meting van de lens wordt uitgevoerd in een tijdig om te minimaliseren van de uitdroging van de lens. - Duidelijk foto de uiteindelijke rust toestand van de lens.
5. de gegevensanalyse
- Upload de afbeelding naar ImageJ en de "punt"-functie gebruiken om te kiezen van ten minste 40 punten rond de omtrek van de lens, zoals weergegeven in Figuur 4A. De optie "Analyseren" → "Meten" opleveren van de locatie van elke geselecteerde punt.
- Passen (via software zoals MATLAB) de locatie-punten om het rendement van een straal en de Chi-kwadraat van de fit zoals weergegeven in Figuur 4B. De pixel straal en fout converteren naar statistieken met behulp van de gefotografeerde liniaal.
- Gepaarde twee tailed t-test uitvoeren om te vergelijken van een individuele lens voor en na die zich uitstrekt van de MLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Varkens ogen, een gemeenschappelijk monster voor de studie van presbyopie via lens4,15, stretching werden verkregen, (n = 10) van een lokale slachthuis en dit protocol werd gebruikt voor het observeren van het vermogen van de accommodatie van de lenzen. Figuur 5 A geeft een vergelijking van de varkens lens voor en na het uitrekken zich via de MLS. Er werd een gemiddelde 0.19 ± 0,07 mm grotere lens straal als uitgerekt (p < 0.001), gelijkstelling een 4.2 ± 1,62% toename van de oorspronkelijke radius. Accommodatie is gecorreleerd met de elasticiteit van de lens, dus het radiale verschil tussen zonder rek en uitgerekte positie suggereren de mogelijkheid om tegemoet te komen. We vonden een consistente toename in lens straal na uitrekken, die in overeenstemming met soortgelijke studies16,17 is. De samenhang en de relatief lage afwijking binnen de studie verder valideert ons protocol.
Dit protocol voorziet in de vergelijking van zowel de opvang als de toegevingen lenzen. De grotere radiale verschil tussen haar zonder rek staat geeft aan een groter vermogen om tegemoet te komen. Als u wilt verder valideren het protocol, waargenomen wij menselijke accommodatie mogelijkheden als een functie van de leeftijd. We testten een 21-jarige en een 60-jarige menselijk oog (de nationale ziekte onderzoek Interchange, Philadelphia, PA). De resultaten, zoals weergegeven in Figuur 5B, aangegeven een afname van de mogelijkheid om aan te passen met de leeftijd. De 21-jarige lens straal verhoogd met 0,22 ± 0.13 mm of 5,2% bij het uitrekken zich ten opzichte van de 0.0059 ± 0.099 mm of 0.14% stijging van de 60-jarige lens. Het is aangetoond dat menselijke lenzen geleidelijk verliest het vermogen om aan te passen met leeftijd3. Deze resultaten aangetoond een kleiner verschil wilt tussen gestrekte en zonder rek straal van de 60-jarige lens in vergelijking met de 21-jarige lens, die een verlies van accommodatie vermogen aangeeft. De oudere mens lens aan te tonen een verminderde capaciteit om te rekken is het eens met soortgelijke studies over accommodatie als functie van de leeftijd8,18,20.
Figuur 1 : Schematische van de handleiding lens brancard. (A) de geassembleerde componenten van de MLS, met inbegrip van de schoenen, plaat geval bovenplaat en bodemplaat. (B) vertegenwoordiger diagram van de schoenen radiaal verbonden met het monster. (C) Clamped schoen waarin de zonules (niet afgebeeld) zijn aangesloten en uitgerekt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief beelden van dissectie protocol. (A) het oog monster is verzameld en de eerste snede langs de hele wereld zal ongeveer 3 mm van het hoornvlies gemaakt worden. (B) de oog-globe heeft correct zijn gesneden rond de omtrek. (C) de posterior sclera heeft volledig zijn gescheiden van de globe. (D) de lens, glasvocht, zonules, en het straalvormig lichaam, werden geïsoleerd van de wereld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatief beeld van de lens zonder rek en uitgerekt via de MLS. (A) de lens wordt gehouden binnen het apparaat, vóór het hartverscheurende, in zijn zonder rek standpunt. (B) het apparaat staat radiaal via de sleutel, zoals de lens wordt uitgerekt in de verlengde positie. Schaal bar = 10 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatieve beelden uit de data-analyse van de monsters van de lens. (A) 50 geselecteerde punten op de omtrek van het monster van de lens ImageJ softwarematig werden geselecteerd. (B) de berekende straal was 37.4955 pixels en de chi-kwadraatverdeling waarde van de fit 0.77636 pixels. Deze resultaten zal veranderen van lens-naar-lens en de pixels moeten worden geconverteerd naar metrische eenheden met behulp van de gefotografeerde liniaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Lens straal vóór en na het uitrekken zich via de handleiding lens brancard. (A) de zonder rek en uitgerekt stralen van 10 varkens lenzen onderworpen aan de MLS. (B) vertegenwoordiger grafiek van de kromtestralen gemeten twee menselijke lenzen, 21 jaar en 60 jaar oud, vóór en na het rekken van de handleiding lens. De foutbalken in beide deel (A) en (B) vertegenwoordigen de fout opgetreden in het passen van de omtrek van de lens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een nieuwe methode om een nauwkeurige en efficiënte manier van het bestuderen van de mogelijkheid van de accommodatie van de lens met behulp van een dual-delige klemmen mechanisme te koppelen van de brancard aan het monster bedacht. Tijdens de accommodatie, de lens ontspant, en de diameter afneemt in reactie op versoepeling van de zonular vezels1,2,4,19. De methode richt zich op dit verschijnsel door klemmen en de controle op de spanning van de zonular vezels. Om deze reden, moet kritieke zorg men zich klem van de zonules binnen de schoenen om nauwkeurig simuleren fysiologische lens accommodatie. Om ervoor te zorgen de juiste klemmen, berust de lens plat tegen het midden van de onderste schoenen met minimale glasvocht gekoppeld. Extra moet worden gezorgd tijdens het hartverscheurende gelijke radiale uitrekken wordt uitgevoerd rond de omtrek van de lens. Als de lens rekken lijkt te zijn nonequivalent, of als de zonules los van de klemmen, moet het monster indien mogelijk worden gemount.
Soortgelijke lens uitrekkende protocollen zijn momenteel uitgevoerd om te bestuderen van de accommodatie en presbyopie4,6,7,9,12. Deze protocollen zijn echter over het algemeen complexe en dure, waarbij ingewikkelde machines en programmeren van software. Deze technieken vereisen bovendien hele oog monsters op meer dan $500.00 per experiment dat verder wijdverspreide goedkeuring vermindert. Ons protocol verhoogt haalbaarheid door vervanging van de machine-programmering met een handmatige lens systeem en monster beschikbaarheid uitrekken doordat er alleen voor een fractie van het monster. De benodigde posterior van de oog kosten aanzienlijk minder op $250,00 per experiment. Er zijn echter enkele beperkingen ons protocol is gekoppeld. Zoals eerder genoemd, de uitlijning van de lens of de ongelijke zonule spanning zal resulteren in een niet toepasbaar uitrekken. Bovendien, de hartverscheurende uitgeoefende kracht niet wordt gemeten en is dus afhankelijk van de consistentie van de gebruiker om te voorkomen dat unclamping of scheuren van de zonules. Als de zonules scheuren, moet het monster worden verwijderd als de MLS schoenen zou niet zitten kundig voor voldoende klem. Toekomstige inspanningen zullen gericht op het kwantificeren van de toegepaste kracht om te zorgen voor samenhang en fysiologische relevantie. Het protocol omvat bovendien de rekken worden verhoogd tot tegengehouden door de schroef stoppen. De rekken niet, daarom worden gewijzigd of varieerde tussen de monsters en nogal geeft een binaire volledig uitgerekt of zonder rek status.
Voorkomen of vernieuwende behandeling van presbyopie is een brandpunt van oogbeschadigingen en/of onderzoek, zoals de voorwaarde momenteel onvermijdelijk en onbehandelbaar is. De biomechanica van de accommodatie en presbyopie worden echter niet volledig begrepen. Het gepresenteerde protocol zorgt voor een nauwkeurige simulatie van lens tijdens accommodatie terwijl vereisen minder monstermateriaal, apparaat bouw en tijd uitrekken. Doordat de beschikbaarheid, zorgt de methode voor meer laboratoria te observeren en bestuderen de biomechanica van lens accommodatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB heeft eigendomsbelang in Bioniko Consulting LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Manual Lens Stretcher | Bioniko | MLS | Different animal species will require different shoe sizes |
| Porcine Eye Samples | George G. Ruppersberger; slaughterhouse | N/A | Whole eyeballs were obtained |
| Human Eye Samples | The National Disease Research Interchange | N/A | Posterior poles without corneas were ordered |
| Dissecting Scissors (5 1/2'' Straight) | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| Tissue Forceps (4 1/2'') | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| iPhone 6s | Apple | N/A | Any imaging system with ~0.1 mm resolution will work |
| Sodium Hypochorite | Clorox | Clorox Regular-Bleach | Any disinfectant will work |
References
- Von Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthal. 1, 1-74 (1855).
- Schachar, R. A., Black, T. D., Kash, R. L., Cudmore, D. P., Schanzlin, D. J. The mechanism of accommodation and presbyopia in the primate. Ann Ophthalmol. 27, 58-67 (1995).
- Glasser, A., Campbell, C. W. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Reilly, M. A., Hamilton, P. D., Perry, G., Ravi, N. Comparison of the behavior and natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88, 483-494 (2009).
- Langenbucher, A., Huber, S., Nguyen, N. X., Seitz, B., Gusek-Schneider, G. C., Küchle, M. Measurement of accommodation after implantation of an accommodating posterior chamber intraocular lens. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 677-685 (2003).
- Ehrmann, K., Ho, A., Parel, J. Biomechanical analysis of the accommodative apparatus in primates. Clin Exp Optom. 91 (4), 411 (2008).
- Pinilla Cortés, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926 (2015).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Eppig, T., et al. Biomechanical eye model and measurement setup for investigating accommodating intraocular lenses. Z Med Ohys. 23 (2), 144-152 (2013).
- Manns, F., Parel,, et al. Response of Human and Monkey Lenses in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (7), 3260 (2007).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Besner, S., Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. -H. In Vivo Brillouin Analysis of the Aging Crystalline Lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5093 (2016).
- Cortes, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926-2932 (2015).
- Bernal, A., Parel, J. -M., Manns, F. Evidence for Posterior Zonular Fiber Attachment on the Anterior Hyaloid Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (11), 4708 (2006).
- Kammel, R., Ackermann, R., Mai, T., Damm, C., Nolte, S. Pig Lenses in a Lens Stretcher. Optom Vis Sci. 89 (6), 908-915 (2012).
- Hahn, J., et al. Measurement of Ex Vivo Porcine Lens Shape During Simulated Accommodation, Before and After fs-Laser Treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- D'Antin, J. C., Cortes, L. P., Montenegro, G. A., Barraquer, R. I., Michael, R. Evaluation of a portable manual stretching device to simulate accommodation. Acta Ophthalmol. 93 (255), (2015).
- Pierscionek, B. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Marussich, L., et al. Measurement of Crystalline Lens Volume During Accommodation in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4239 (2015).
- Martinez-Enriquez, E., Pérez-Merino, P., Velasco-Ocana, M., Marcos, S. OCT-based full crystalline lens shape change during accommodation in vivo. Biomed Opt Exp. 8 (2), 918-933 (2017).
