Summary
Vi præsenterer en effektiv metode til at studere linse overnatning ved hjælp af en manuel linse båre. De protokol efterligner fysiologiske overnatning ved at trække zonules tilsluttet rundt linse kapsel, dermed, stretching linsen.
Abstract
Målet med denne protokol er at efterligne biomekanik af fysiologiske overnatning på en omkostningseffektiv og praktisk måde. Overnatning er opnået gennem ciliare sammentrækning og afslapning af zonule fibre, hvilket resulterer i fortykkelse af linsen nødvendige for nær vision. Vi præsenterer her, en roman, simpel metode, hvor overnatning er replikeret af spænde zonules tilsluttet linse kapsel via en manuel linse båre (MLS). Denne metode overvåger den radiale stretching opnåede af en linse, når de underkastes en ensartet styrke og giver mulighed for en sammenligning af imødekommende linser, som kan strækkes til ikke-imødekommende linser, som ikke kan strækkes. Vigtigere, båre par zonules direkte og ikke sclera i øjet, hvilket kun kræver linsen, zonules, og corpus ciliare snarere end eksemplet hele kloden. Denne forskel kan væsentligt nedsætte omkostninger ved at erhverve donor Kadaver linser med omkring 62% i forhold til at erhverve en hele kloden.
Introduction
Overnatning er den proces, hvorved det menneskelige øje er i stand til dynamisk justere formen af dens krystallinske linse at se objekter på langt eller tæt afstande i skarp fokus. Overnatning er et uløseligt biomekaniske proces. På neurale stimulus producerer ciliaere muskler en kraft på ciliare og zonule fibre, der tillægger omkreds af linsen kapsel1,2. Der er forskellige teorier bag biomekanik for overnatning, er den mest udbredte Helmholtz hypotesen. Ifølge hypotesen er objektivet i en naturlig strakte tilstand, svarende til den tyndeste form af linsen, der er optimal til at fokusere på fjerne objekter. For at ændre fokus til tættere objekter, ciliaere muskler kontrakt og de zonular fibre er afslappet. Til gengæld tykner linsen, øge de anteriore og posteriore overflade krumninger. Dette svarer til en stigning i Dioptrisk magt, som er nødvendige for nær vision, derfor, en kortere brændvidde1.
Evnen til at rumme er kompromitteret over tid via en betingelse benævnt presbyopi. Påvirker alle ved alder 50, gør presbyopi øjet i stand til dynamisk at ændre fokus fra langt for at lukke afstande3. For at bekæmpe presbyopi, er nuværende metoder passiv, herunder korrigerende linser og bifocals. Samtidig øge ens evne til at fokusere på tæt objekter på par fly, kan ikke sådanne passive behandlinger gendanne dynamisk fokus evne til objektiv4,5. At behandle presbyopi effektivt, eller muligvis forhindre det, er der et løbende behov for bedre at forstå overnatning.
For at studere linse overnatning, er en række af enheder udviklet til at simulere fænomen ex vivo4,6,7,8,9. Spinding diske blev indført for at overvåge udspænding af linsen via centrifugalkræfter8. At mere trofast gentage fænomenet, blev linse strækker enheder gradvist indført og fornys. Ved hjælp af en linse båre, Pia mfl. karakteriseret den nødvendige kraft til at rumme linsen mens korrelerede sådan at linsen magt og ækvatoriale diameter9. Nuværende forståelse er, at linsen stivner med alderen, hvilket resulterer i en reduceret ændring i linsen form som svar på en lige kraft fra corpus ciliare3,10,11,12.
Nuværende linse bårer ofte indebærer en kompleks opsætning, gennemførelse af elektronik og programmerbare strækker satser, og kræver hele Kadaver øjeæblet6,7,10,13. Dette krav øger omkostningen pr. eksperiment til over $500,00 pr. øje og reducerer prøve tilgængelighed. Her vil vi præsentere en metode til at replikere linse overnatning til en lav pris, som øjet bagerste sammentæller omkring $200,00. Mens mindre avanceret end mange enheder, der bruges i dag, er teknikken langt mere omkostningseffektiv og adoptere uden at kompromittere resultater. Denne metode er centreret omkring en manuel linse båre (MLS) afbildet i figur 1, og anvender en unik fastspænding system på de zonular fibre og en radial vride metode til at udvide diameteren af linsen. Fysiologiske nøjagtigheden af protokollen er valideret af resultaterne af Bernal mfl., der studerede den vej som den forreste og bagerste zonular fibre er forbundet til linse kapsel14. Ved hjælp af design af brugerdefinerede sko, som kun kræver linse, zonule og corpus ciliare, vi havde til formål at studere linse biomekanik ved at gentage fysiologiske overnatning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoller er accepteret under University of Marylands institutionelle Animal Care og brug udvalg samt de institutionelle Review Board. Protokollerne følge føderale, statslige og lokale standarder og retningslinjerne, der er fastsat ved University of Maryland politik om biosikkerhed.
1. dissektion af Eye prøve
-
Opnå en eye prøve fra lokale slagteri eller væv bank. Hvis en hele øjet globe er opnået, straks udtrække linse, vedlagte zonules og glaslegemet.
Bemærk: De specifikke detaljer beskrevet nedenfor vedrører både svin og menneskers øjne.- Ved hjælp af desinficerede kirurgiske saks og pincet, skær og fjern alle overskydende væv omkring sclera.
- Fast hold øje på sin side, og brug et barberblad, lave et lille snit langs siden af øjet 3 mm fra hornhinden. Få den skåret dybe nok at have nået glaslegemet i øjet.
- Ved hjælp af saks, omhyggeligt skæres yderligere langs indsnit omkring omkredsen af øjet. Undgå punktering linsen. Et repræsentativt billede er vist i figur 2A.
- Når den udvendige omkreds af øjet er blevet skåret, fjerne den bageste væv i øjet med pincet. Isolere linsen, zonules, corpus ciliare og vedlagte glaslegemet med pincet. Et repræsentativt billede er vist i figur 2B.
- Ved hjælp af saks og pincet, fjerne overskydende glasagtige, så linsen kan lægge fladt på MLS.
Bemærk: I tilfælde af hornhindens transplantation, den hornhinde knap der bruges i kirurgi og resten af verden er tilgængelige til forskningsformål. Denne delvise kloden kan dog stadig bruges i væv forberedelse af linse båre setup. Hvis kun bageste er opnået, kun udføre trin 1.1.4–1.1.5.
- Desinficere alle brugt udstyr efter dissektion i 15% blegemiddelopløsning i 30 min.
2. retssag forsamling af manuel linse båre
- Indsæt 10 mm sko bunde og de tilsvarende sko toppe i bundpladen af MLS, så der er stadig en 5 mm afstand mellem bagvæggen led, sko og sko selv.
- Juster de øverste og nederste plader, snapper pladerne sammen; enheden er nu i positionen må ikke strækkes.
- Indsæt pladerne i sagen plade og prop skruen i hullet placeret på siden af bundpladen.
- Indsæt sagen plade i bunden og læg skruenøglen i de justerede led.
- Twist skruenøglen med uret, indtil den når stoppe skruen for at kontrakten skoene, og vride tilbage mod uret tilbage sko til den oprindelige må ikke strækkes holdning.
3. montering af linsen
- Indsæt 10 mm sko bunde i bundplade i MLS, således at et 5 mm hul mellem resterne bagvæggen af sko led og sko selv.
- Bruger buet pincet, placere den udpakkede linse med billedsiden opad på midten af den nederste plade så sko støtter linsen over den centrale hul.
- Fastgør den tilsvarende top af skoene på plads, klipning kun zonules og glaslegemet. Visuelt sikre, at linsen forbliver som centreret som muligt på bundpladen.
- Gentag trin 2.3-2.4.
4. måling af linsen
- Placere et billedbehandlingssystem direkte over apparatet for at fange videoer og billeder af stretching processen. Sørg for at medtage en lineal i rammen af billedet til præcist størrelsen og skalaen billeder i post-processing.
Bemærk: Enhver egnet billedbehandlingssystem er tilstrækkelig til dette trin; Her bruger vi et 12 megapixel, autofokus smartphone ene fod fra prøven. - Fast endnu gnidningsløst, rotere skruenøgle i uret at strække linsen. Figur 3 viser repræsentative billeder på tilstanden må ikke strækkes og strakte.
- Efter fotografere strakte linsen, rotere skruenøgle i retningen mod uret til at gendanne prøven hvilende tilstand.
Bemærk: Det er bydende nødvendigt, at måling af linsen er udført i tide for at minimere dehydrering af linsen. - Klart fotografere den endelige hvilende tilstand af linsen.
5. dataanalyse
- Upload billedet til ImageJ, og brug funktionen "point" til at vælge mindst 40 punkter omkring omkredsen af linsen som vist i figur 4A. Brug indstillingen "Analyze" → "Måle" for at give placeringen af hver valgte punkt.
- Passe (via software f.eks. MATLAB) placering point for at give en radius og chi-square fit som vist i figur 4B. Konvertere pixel radius og fejl til målinger ved hjælp af den fotograferede lineal.
- Udføre parret to tailed t-testen til at sammenligne en enkelt linse, før og efter strækker sig fra MLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Svin øjne, en almindelig prøve for at studere presbyopi via linse strækker sig4,15, blev indhentet, (n = 10) fra et lokale slagteri og denne protokol blev brugt til at observere overnatning evne af linser. Figur 5 A viser en sammenligning af svin linsen før og efter stretching via MLS. Der var en gennemsnit 0,19 ± 0,07 mm stigning i linse radius når strakt (p < 0,001), sidestille til en stigning på 4,2 ± 1.62% fra den oprindelige radius. Overnatning er korreleret med linse elasticitet, radial forskellen mellem må ikke strækkes og strakte holdning foreslår derfor, evnen til at rumme. Vi fandt en konsekvent stigning i linse radius post stretching, som er i overensstemmelse med lignende undersøgelser16,17. Konsistens og relativt lav afvigelse i undersøgelsen yderligere validerer vores protokol.
Denne protokol giver mulighed for sammenligning af både imødekommende og unaccommodating objektiver. Større radial forskellen mellem sin må ikke strækkes tilstand angiver en større evne til at rumme. Du kan yderligere validere protokollen, observeret vi menneskelige overnatning evner som funktion af alder. Vi har testet en 21-årig og en 60 årig menneskelige øje (den nationale sygdom forskning Interchange, Philadelphia, PA). Resultater, viste som vist i figur 5B, et fald i evnen til at rumme med alderen. Den 21-årige linse radius steg med 0,22 ± 0,13 mm eller 5,2% ved stretching, sammenlignet med den 0.0059 ± 0.099 mm eller 0,14% stigning i den 60-årige linse. Det har vist sig at menneskelige linser gradvist mister evnen til at rumme med age3. Disse resultater viste en mindre forskel mellem strakte og må ikke strækkes radius af 60-årige linsen i forhold til den 21-årige linse, der angiver et tab af muligheden for overnatning. Ældre menneskers linsen viser en nedsat evne til at strække er enig med lignende undersøgelser på overnatning som funktion af alder8,18,20.
Figur 1 : Skematisk af manuel linse båre. (A) de forsamlede komponenter i MLS, herunder sko, plade sag, øvre plade og bundplade. (B) repræsentative diagram af skoene radialt forbundet til prøven. (C) Clamped sko, hvor zonules (ikke afbilledet) er fastgjort og strakte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant billeder af dissektion protokol. (A) øjet prøven er blevet indsamlet og den første indsnit langs kloden gøres ca 3 mm fra hornhinden. (B) i øjet verden er blevet korrekt skåret omkring sin omkreds. (C) bageste sclera har været helt adskilt fra globe. (D) linse, glasagtige, zonules og corpus ciliare blevet isoleret fra hele kloden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentativt billede af den må ikke strækkes og strakte linsen via MLS. (A) linsen er afholdt inden for enheden, før wrenching, må ikke strækkes holdning. (B) enheden aktiveres radialt via skruenøgle, som linsen er strakte sig ind i dens aflange holdning. Skalalinjen = 10 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant billeder fra dataanalyse af linse prøver. (A) 50 udvalgte punkter blev valgt på omkredsen af linse prøven ved hjælp af ImageJ software. (B) beregnes radius var 37.4955 pixels, og chi2 værdien af fit 0.77636 pixel. Disse resultater vil ændre fra linse-til-linse, og pixel skal være konverteret til metriske enheder bruger den fotograferede lineal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Linse radius før og efter stretching via manuel linse båre. (A) den må ikke strækkes og strakte radier 10 svin linser udsat for MLS. (B) repræsentative graf af de målte radier i to menneskelige linser, 21 år og 60 år gamle, før og efter manuel linse stretching. Fejllinjer i både en del a og b udgør den rapporterede en fejl i montering af linsen perimeter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet en ny metode for at give en præcis og effektiv måde at studere overnatning evne af linsen ved at udnytte en dual-stykke bespændingsmekanisme at koble båre til prøven. Under overnatning, linsen slapper, og diameteren aftager svar til lempelse af zonular fibre1,2,4,19. Metoden fokuserer på dette fænomen ved fastspænding og kontrollere spændingen i de zonular fibre. Derfor træffes intensivbehandling at klemme zonules i sko til nøjagtigt efterligne fysiologiske linse overnatning. For at sikre korrekt fastspænding, bør linsen hvile fladt mod midten af bunden sko med minimal glasagtige knyttet. Ekstra pleje bør tages mens wrenching at sikre lige radial stretching udføres omkring omkredsen af linsen. Hvis linsen stretching synes at være nonequivalent, eller hvis zonules løsriver sig fra klemmerne, skal prøven være remounted hvis det er muligt.
Lignende linse strækker protokoller er i øjeblikket gennemføres for at studere overnatning og presbyopi4,6,7,9,12. Disse protokoller er dog generelt komplekse og dyre, der kræver komplicerede maskiner og software programmering. Derudover kræver disse teknikker hele øjet prøver på over $500,00 pr. eksperiment, hvilket yderligere mindsker udbredt vedtagelse. Vores protokollen øger muligheden ved at erstatte maskine-programmering med en manuel linse strække systemet og prøve tilgængelighed ved kun at kræve en brøkdel af prøven. Den nødvendige bageste af de øje koster væsentligt mindre på $250,00 pr. eksperiment. Der er dog nogle begrænsninger i forbindelse med vores protokol. Som tidligere nævnt, forskydning af linsen eller ulige zonule spænding vil resultere i en uanvendelig stretching. Derudover den wrenching kraft måles ikke og dermed afhængig af konsistensen af brugeren til at forhindre unclamping eller rivning af zonules. Hvis zonules skulle rive, skal prøven kasseres som MLS skoene ikke ville kunne tilstrækkeligt klemme. Fremtidige indsats vil fokusere på kvantificere den anvendte kraft at sikre sammenhæng og fysiologiske relevans. Derudover indebærer protokollen udspænding for at øges indtil stoppet ved stop skruen. Den strækker sig ikke, derfor kan ændres eller varierede mellem prøver og snarere viser en binær fuldt strakt eller må ikke strækkes tilstand.
Forebyggelse eller innovative behandling af presbyopi er et knudepunkt for okulær forskning, da betingelsen i øjeblikket er uundgåelige og uhelbredelige. Dog, biomekanik af overnatning og presbyopi er ikke fuldt forstået. Præsenteres protokollen giver mulighed for en præcis simulering af linse strækker sig under overnatning mens der kræver mindre prøvemateriale, enhed konstruktion og tid. Ved at øge tilgængeligheden, giver metoden mulighed for flere laboratorier til at observere og studere biomekanik af linse overnatning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB har ejerandel i Bioniko Consulting LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Manual Lens Stretcher | Bioniko | MLS | Different animal species will require different shoe sizes |
| Porcine Eye Samples | George G. Ruppersberger; slaughterhouse | N/A | Whole eyeballs were obtained |
| Human Eye Samples | The National Disease Research Interchange | N/A | Posterior poles without corneas were ordered |
| Dissecting Scissors (5 1/2'' Straight) | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| Tissue Forceps (4 1/2'') | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| iPhone 6s | Apple | N/A | Any imaging system with ~0.1 mm resolution will work |
| Sodium Hypochorite | Clorox | Clorox Regular-Bleach | Any disinfectant will work |
References
- Von Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthal. 1, 1-74 (1855).
- Schachar, R. A., Black, T. D., Kash, R. L., Cudmore, D. P., Schanzlin, D. J. The mechanism of accommodation and presbyopia in the primate. Ann Ophthalmol. 27, 58-67 (1995).
- Glasser, A., Campbell, C. W. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Reilly, M. A., Hamilton, P. D., Perry, G., Ravi, N. Comparison of the behavior and natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88, 483-494 (2009).
- Langenbucher, A., Huber, S., Nguyen, N. X., Seitz, B., Gusek-Schneider, G. C., Küchle, M. Measurement of accommodation after implantation of an accommodating posterior chamber intraocular lens. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 677-685 (2003).
- Ehrmann, K., Ho, A., Parel, J. Biomechanical analysis of the accommodative apparatus in primates. Clin Exp Optom. 91 (4), 411 (2008).
- Pinilla Cortés, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926 (2015).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Eppig, T., et al. Biomechanical eye model and measurement setup for investigating accommodating intraocular lenses. Z Med Ohys. 23 (2), 144-152 (2013).
- Manns, F., Parel,, et al. Response of Human and Monkey Lenses in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (7), 3260 (2007).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Besner, S., Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. -H. In Vivo Brillouin Analysis of the Aging Crystalline Lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5093 (2016).
- Cortes, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926-2932 (2015).
- Bernal, A., Parel, J. -M., Manns, F. Evidence for Posterior Zonular Fiber Attachment on the Anterior Hyaloid Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (11), 4708 (2006).
- Kammel, R., Ackermann, R., Mai, T., Damm, C., Nolte, S. Pig Lenses in a Lens Stretcher. Optom Vis Sci. 89 (6), 908-915 (2012).
- Hahn, J., et al. Measurement of Ex Vivo Porcine Lens Shape During Simulated Accommodation, Before and After fs-Laser Treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- D'Antin, J. C., Cortes, L. P., Montenegro, G. A., Barraquer, R. I., Michael, R. Evaluation of a portable manual stretching device to simulate accommodation. Acta Ophthalmol. 93 (255), (2015).
- Pierscionek, B. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Marussich, L., et al. Measurement of Crystalline Lens Volume During Accommodation in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4239 (2015).
- Martinez-Enriquez, E., Pérez-Merino, P., Velasco-Ocana, M., Marcos, S. OCT-based full crystalline lens shape change during accommodation in vivo. Biomed Opt Exp. 8 (2), 918-933 (2017).
