Summary
Vi presenterer en effektiv metode for å studere linsen innkvartering ved hjelp av manuell linse båre. De protokollen imiterer fysiologiske innkvartering ved å trekke i zonules koblet rundt objektivet kapselen, dermed strekker objektivet.
Abstract
Målet med denne protokollen er å etterligne biomekanikk av fysiologiske innkvartering på en kostnadseffektiv, praktisk måte. Overnatting oppnås gjennom sammentrekning av ciliary kropp og avslapning av zonule fiber, som resulterer i jevning av linsen nødvendig for nær visjon. Her presenterer vi en roman, enkel metode som overnatting er replikert av spenner zonules koblet til linsen kapselen via manuell linse båre (MLS). Denne metoden overvåker radial strekking av et objektiv når de utsettes for en konsekvent kraft og tillater en sammenligning av imøtekommende linser, som kan strekkes, å ikke accomodating linser, som kan strekkes. Viktigere, båren par zonules direkte, og ikke sclera i øyet, dermed bare krever linsen, zonules, og ciliary kropp stedet hele verden prøven. Denne forskjellen kan betydelig redusere kostnadene ved å anskaffe donor cadaver linser med om lag 62% sammenlignet med å kjøpe en hele verden.
Introduction
Overnatting er prosessen som det menneskelige øyet er dynamisk justere formen på sin krystallinsk linsen å se objekter på langt eller nær avstander i skarp fokus. Overnatting er en bunn biomekaniske prosess. På neural stimulans produsere ciliary musklene en styrke på ciliary kropp og zonule fiber som festes til omkretsen av linsen kapsel1,2. Mens det er ulike teorier bak biomekanikk av overnatting, er den mest allment akseptert Helmholtz hypotesen. Ifølge hypotesen er objektivet i en naturlig strukket tilstand, tilsvarer tynneste formen på objektivet som er optimal for fokus på fjerne objekter. Hvis du vil endre fokus til nærmere objekter, ciliary muskler kontrakt og zonular fiber er avslappet. I sin tur tykner linsen, øke de fremre og bakre overflate curvatures. Dette tilsvarer en økning i dioptric kraften som er nødvendig for nær visjon, derfor en kortere brennvidde1.
Muligheten til å imøtekomme er kompromittert over tid via en tilstand kalt presbyopi. Berører alle ved 50 år, gjør presbyopi øyet ikke dynamisk endre fokus fra å lukke avstander3. For å bekjempe presbyopi, er gjeldende metoder passive inkludert korrigerende linser og bifokale. Samtidig øke ens evne til å fokusere på Lukk objekter på noen fly, kan ikke slike passiv behandlinger gjenopprette dynamisk fokus evne til linsen4,5. For å behandle presbyopi effektivt, eller muligens hindre det, er det et løpende behov for bedre å forstå overnatting.
For å studere linsen innkvartering, er en rekke enheter utviklet for å simulere fenomenet ex vivo4,6,7,8,9. Spinning diskene ble først introdusert for å overvåke strekking av linsen via sentrifugalkreftene8. Å mer trofast kopiere fenomenet, ble linsen strekker enheter gradvis introdusert og fornyet. Bruke en linse båre, Manns et al. preget kraften som er nødvendig for linsen mens samkjøre slik linsen makt og equatorial diameter9. Nåværende forståelse er at objektivet stiv med alderen, noe som resulterer i en redusert endring i linsen form svar på en like stor kraft fra ciliary kropp3,10,11,12.
Gjeldende linsen bårer ofte innebære et sammensatt oppsett, implementere elektronikk og programmerbare strekker priser, og krever hele cadaver øyeeplet6,7,10,13. Dette kravet øker kostnaden per eksperiment over $500,00 per øyet og reduserer eksempel tilgjengelighet. Her presenterer vi en metode for å gjenskape linsen innkvartering til lavpris som øyet bakre summerer rundt $200,00. Mens mindre avansert enn mange enheter brukes i dag, er teknikken mye mer kostnadseffektivt og adoptable uten at resultatene. Denne metoden er sentrert rundt manuell linse båre (MLS) avbildet i figur 1, og bruker en unik klemmesystemet på zonular fiber og en radial kronglete metode for å utvide diameteren på objektivet. Fysiologiske nøyaktigheten av protokollen valideres av funnene i Bernal et al., som studerte veien som de fremre og bakre zonular fibrene er koblet til det objektiv kapsel14. Bruker utformingen av tilpassede sko som bare krever den linsen, zonule og ciliary kropp, rettet vi å studere linsen biomekanikk ved å replikere fysiologiske overnatting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoller er tillatt under University of Marylands institusjonelle Animal Care og bruk komiteen samt institusjonelle anmeldelsen bord. Protokollene følge føderale, statlige og lokale standarder og retningslinjer fastsatt av University of Maryland policyen til biosikkerhet.
1. Disseksjon av øyet Sample
-
Få en øye prøve lokale slakteri eller vev bank. Hvis en hele øyet globe hentes, umiddelbart ekstra linse, tilknyttede zonules og linsen.
Merk: De spesifikke detaljene beskrevet nedenfor gjelder både svin og menneskelige øyne.- Bruke desinfiseres kirurgisk saks og tang, skjær og fjerne alle overflødig vev rundt sclera.
- Fast holde øye på sin side og bruke et barberblad, lag et lite innsnitt langs siden av øyet 3 mm fra hornhinnen. Gjøre kutt dypt nok til å ha nådd linsen i øyet.
- Med saks, klippe videre langs i snitt rundt omkretsen av øyet. Unngå punktering linsen. Et representativt bilde vises i figur 2A.
- Når utenfor omkretsen av øyet har blitt kuttet, fjerne den bakre vev i øyet ved hjelp av pinsett. Isolere linsen, zonules, ciliary kropp og tilknyttede linsen med tang. Et representativt bilde vises i figur 2B.
- Ved hjelp av saks og tang, fjerne overflødig glasslegemet slik at linsen kan ligge flatt på MLS.
Merk: I tilfeller av hornhinnetransplantasjon, hornhinnen knappen brukes i kirurgi og resten av verden er tilgjengelig for forskningsformål. Dette delvis verden kan imidlertid fortsatt brukes i vev utarbeidelsen av linsen båre. Hvis bare bakre er oppnådd, bare utføre trinn 1.1.4–1.1.5.
- Desinfiser alle brukt utstyr etter disseksjon i 15% blekemidler løsning for 30 min.
2. prøve montering av manuell linse båren
- Sette inn 10 mm skoen bunnen og tilsvarende skoen topper i bunnplaten av MLS er en 5 mm avstand mellom bakveggen av skoen innrykket og skoen seg.
- Justere topp og bunn plater, knipser plater sammen; enheten er nå i unstretched posisjon.
- Sette inn platene i plate tilfelle og stopper skruen i hullet ligger på siden av bunnplaten.
- Sette inn plate saken i basen og plasser skiftenøkkel i justert innrykkene.
- Tvinn skiftenøkkelen klokken til den når stoppe skruen som kontrakt sko, og vri tilbake klokken å returnere skoene til den opprinnelige unstretched posisjonen.
3. montering av linsen
- Sett inn 10 mm skoen bunnen i bunnplaten i MLS slik at en 5 mm gap mellom restene bakveggen av skoen innrykket og skoen seg.
- Bruke buede tang, plass utdraget linsen ansiktet opp på midten av bunnplaten slik at skoene støtter linsen over de sentrale hullet.
- Blunk tilsvarende toppen av skoene på plass, klipping bare zonules og linsen. Visuelt sikre at linsen forblir som sentrert som mulig på den nederste platen.
- Gjenta 2.3-2,4.
4. måling av linsen
- Plass en tenkelig system rett over apparatet for å fange videoer og bilder av strekker prosessen. Husk å inkludere en linjal i rammen av bildet nøyaktig størrelse og skala bilder i etterbehandling.
Merk: Noen passende tenkelig system er tilstrekkelig for dette trinnet; Her bruker vi en 12 megapiksler, autofokus smartphone en fot fra utvalget. - Fast ennå smidig, rotere skiftenøkkel i klokkeretningen å strekke linsen. Figur 3 viser representant bilder på den unstretched og strukket tilstanden.
- Etter fotografere strukket linsen, rotere skiftenøkkel i mot urviseren retning for å gjenopprette prøven til hvile tilstand.
Merk: Det er viktig at måling av linsen er utført i tide for å minimere dehydrering av linsen. - Tydelig fotografi endelig hvile tilstand av linsen.
5. analyse
- Laste opp ImageJ og bruke funksjonen "point" velge minst 40 poeng rundt omkretsen av linsen som vist i Figur 4A. Bruk "Analysere" → "Måle" alternativet til plasseringen av hver valgte punktet.
- Passe (benytter programvare f.eks MATLAB) plassering poeng for å gi en radius og chi-kvadrat på plass som vist i Figur 4B. Konvertere pixel radiusen og feil i beregninger med fotografert linjalen.
- Utføre to tailed t-test for å sammenligne en individuelle objektiv før og etter strekker seg fra MLS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Svin øyne, et vanlig eksempel for å studere presbyopi via linsen strekker4,15, ble innhentet, (n = 10) fra en lokal slakteri og denne protokollen ble brukt til å observere evnen til overnatting av linser. Figur 5 En viser sammenligningen av svin linsen før og etter strekker via MLS. Det var en gjennomsnittlig 0,19 ± 0,07 mm økning i linsen radius når strekkes (p < 0,001), som angir en 4,2 ± 1.62% økning fra opprinnelige radius. Overnatting er korrelert med linsen elastisitet, derfor radial forskjellen mellom unstretched og strukket foreslår muligheten til å tilpasse. Vi fant en jevn økning i linsen radius etter stretching, som er i samsvar med lignende studier16,17. Konsistensen og relativt lav avvik i studien videre bekrefter vår protokollen.
Denne protokollen tillater sammenligning av både imøtekommende og unaccommodating linser. Større radial forskjellen mellom tilstanden unstretched angir en større evne til å tilpasse. Videre validere protokollen, observerte vi menneskelige overnatting evner som funksjon av alder. Vi testet en 21 år gammel og en 60 år gammel menneskelige øye (The National sykdom forskning Interchange, Philadelphia, PA). Resultater, indikerte som vist i figur 5B, en nedgang i evnen til å imøtekomme med alderen. 21 år gamle objektivet radius økt med 0.22 ± 0,13 mm eller 5,2% ved strekking sammenlignet 0.0059 ± 0.099 mm eller 0.14% økning av 60 år gamle objektivet. Det har vist at menneskelige linser gradvis miste muligheten til å ta med alder3. Disse resultatene viste mindre forskjell mellom strekkes og unstretched radius på 60 år gamle objektivet sammenlignet med 21 år gamle objektivet, som angir et tap av overnatting. Eldre menneskelige linsen demonstrere en redusert evne til å strekke er med lignende studier på overnatting som funksjon av alder8,18,20.
Figur 1 : Skjematisk av manuell linse båren. (A) samlet komponentene i MLS, inkludert sko, plate saken, øvre plate og bunnplaten. (B) representant diagram av skoene radielt koblet til utvalget. (C) Clamped sko som zonules (ikke avbildet) er festet og strukket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant bilder av disseksjon protokollen. (A) øyet prøven er samlet inn og den første snittet langs verden vil bli gjort ca 3 mm fra hornhinnen. (B) øyet verden har blitt riktig kuttet rundt omkretsen. (C) bakre sclera er helt atskilt fra globe. (D) linse, glassporselen, zonules og ciliary kropp har vært isolert fra globe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representativt bilde av unstretched og strukket linsen via MLS. (A) objektivet holdes i enheten, før wrenching, i sin unstretched posisjon. (B) enheten slås radielt via skiftenøkkel, som objektivet er strukket til sin avlange posisjon. Skala bar = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant bilder fra dataanalyse av linsen prøver. (A) 50 valgt poeng ble valgt på omkretsen på objektivet utvalget bruker ImageJ programvare. (B) beregnet radius var 37.4955 piksler, og den kjikvadrerte verdien av passformen var 0.77636 piksler. Disse resultatene endres fra linsen til objektivet, og bildepunktene må konverteres til metriske enheter bruker fotografert linjalen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Linsen radius før og etter strekker via manuell linse båren. (A) den unstretched og strukket radier 10 svin linser utsatt for MLS. (B) representant graf de målte radier to menneskelige linser, 21 år gammel og 60 år gammel, før og etter manuell linse strekking. Feilfeltene i begge del (A) og (B) representerer rapporterte feilen i passende omkretsen av linsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en ny metode for å gi en nøyaktig og effektiv måte å studere overnatting evne til objektivet ved å benytte en to-brikke klem mekanisme å båren til prøven. Under overnatting, slapper av linsen og diameteren nedgang i respons til avslapning av zonular fiber1,2,4,19. Metoden fokuserer på dette fenomenet av clamping og kontrollere spenningen av zonular fiber. Derfor må kritiske omsorg tas å klemme zonules i sko å simulere nøyaktig fysiologiske linsen overnatting. For å sikre riktig clamping, bør linsen hvile mot midten av bunnen sko med minimal glasslegemet knyttet. Ytterligere omsorg bør tas mens wrenching å sikre lik radial strekker utføres rundt omkretsen av linsen. Hvis linsen strekker seg synes å være nonequivalent, eller hvis zonules bli koblet fra klemmer, prøven må monteres hvis mulig.
Lignende linsen strekker protokoller er under gjennomføring for å studere overnatting og presbyopi,4,,6,,7,,9,,12. Disse protokollene er imidlertid vanligvis komplekse og dyre, krever intrikate maskiner og programmering. I tillegg krever disse teknikkene hele øyet prøver på over $500,00 per forsøk som ytterligere reduserer utbredt adopsjon. Våre protokollen øker mulighetene ved å erstatte maskin-programmering med en manuell linse strekker systemet og prøven ved å kreve bare en brøkdel av prøven. Den nødvendige bakre øye kostnadene betydelig mindre på $250,00 per forsøk. Det er imidlertid noen begrensninger knyttet til våre protokollen. Som tidligere nevnt, forskyvning av linsen eller ulike zonule spenning vil føre en uanvendelig strekking. Dessuten wrenching kraften er ikke målt og dermed avhengig av konsistensen av brukeren å forhindre unclamping eller rive av zonules. Hvis zonules var å rive, må prøven kastes som MLS skoene ikke ville være i stand til å tilstrekkelig klemme. Arbeidet vil fokusere på kvantifisere anvendt kraften å sikre konsistens og fysiologiske relevans. I tillegg innebærer protokollen strekking å økes til stoppet ved stoppe skruen. Strekking kan derfor endres eller varierte mellom prøver og heller viser en binær helt strukket eller unstretched tilstand.
Forebygge eller nyvinninger behandling for presbyopi er et samlingspunkt i okulær forskning, som tilstanden er uunngåelig og botemiddel. Imidlertid er biomekanikk innkvartering og presbyopi ikke fullt ut forstått. Presentert protokollen gir en riktig simulering av linsen strekker seg under overnatting mens krever mindre utvalget materialet, enheten konstruksjon og tid. Ved å øke tilgjengeligheten, tillater metoden mer laboratorier for å observere og studere biomekanikk av linsen overnatting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AB har eierandel i Bioniko Consulting LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Manual Lens Stretcher | Bioniko | MLS | Different animal species will require different shoe sizes |
| Porcine Eye Samples | George G. Ruppersberger; slaughterhouse | N/A | Whole eyeballs were obtained |
| Human Eye Samples | The National Disease Research Interchange | N/A | Posterior poles without corneas were ordered |
| Dissecting Scissors (5 1/2'' Straight) | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| Tissue Forceps (4 1/2'') | Electron Microsopy Sciences | 72960 | |
| iPhone 6s | Apple | N/A | Any imaging system with ~0.1 mm resolution will work |
| Sodium Hypochorite | Clorox | Clorox Regular-Bleach | Any disinfectant will work |
References
- Von Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthal. 1, 1-74 (1855).
- Schachar, R. A., Black, T. D., Kash, R. L., Cudmore, D. P., Schanzlin, D. J. The mechanism of accommodation and presbyopia in the primate. Ann Ophthalmol. 27, 58-67 (1995).
- Glasser, A., Campbell, C. W. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Reilly, M. A., Hamilton, P. D., Perry, G., Ravi, N. Comparison of the behavior and natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88, 483-494 (2009).
- Langenbucher, A., Huber, S., Nguyen, N. X., Seitz, B., Gusek-Schneider, G. C., Küchle, M. Measurement of accommodation after implantation of an accommodating posterior chamber intraocular lens. J Cataract Refract Surg. 29 (4), 677-685 (2003).
- Ehrmann, K., Ho, A., Parel, J. Biomechanical analysis of the accommodative apparatus in primates. Clin Exp Optom. 91 (4), 411 (2008).
- Pinilla Cortés, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926 (2015).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Eppig, T., et al. Biomechanical eye model and measurement setup for investigating accommodating intraocular lenses. Z Med Ohys. 23 (2), 144-152 (2013).
- Manns, F., Parel,, et al. Response of Human and Monkey Lenses in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (7), 3260 (2007).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Besner, S., Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. -H. In Vivo Brillouin Analysis of the Aging Crystalline Lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5093 (2016).
- Cortes, L., et al. Experimental Protocols for Ex Vivo Lens Stretching Tests to Investigate the Biomechanics of the Human Accommodation Apparatus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (5), 2926-2932 (2015).
- Bernal, A., Parel, J. -M., Manns, F. Evidence for Posterior Zonular Fiber Attachment on the Anterior Hyaloid Membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (11), 4708 (2006).
- Kammel, R., Ackermann, R., Mai, T., Damm, C., Nolte, S. Pig Lenses in a Lens Stretcher. Optom Vis Sci. 89 (6), 908-915 (2012).
- Hahn, J., et al. Measurement of Ex Vivo Porcine Lens Shape During Simulated Accommodation, Before and After fs-Laser Treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- D'Antin, J. C., Cortes, L. P., Montenegro, G. A., Barraquer, R. I., Michael, R. Evaluation of a portable manual stretching device to simulate accommodation. Acta Ophthalmol. 93 (255), (2015).
- Pierscionek, B. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Marussich, L., et al. Measurement of Crystalline Lens Volume During Accommodation in a Lens Stretcher. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4239 (2015).
- Martinez-Enriquez, E., Pérez-Merino, P., Velasco-Ocana, M., Marcos, S. OCT-based full crystalline lens shape change during accommodation in vivo. Biomed Opt Exp. 8 (2), 918-933 (2017).
