Un protocollo per la volta di ionizzazione matrix-assisted laser desorption di caratterizzazione di spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) dei polimeri sintetici è descritto compreso l’ottimizzazione dell’acquisizione spettrale, preparazione del campione e l’analisi dei dati di volo.
Ci sono molte tecniche che possono essere impiegati nella caratterizzazione di omopolimeri sintetici, ma pochi forniscono utili informazioni per l’analisi di gruppo fine come tempo di ionizzazione matrix-assisted laser desorption volo della spettrometria di massa (MALDI-TOF MS). Questo tutorial illustra i metodi per l’ottimizzazione della preparazione del campione, acquisizione spettrale, e analisi dei dati dei polimeri sintetici utilizzando i parametri critici di MALDI-TOF MS. durante la preparazione del campione includono la selezione della matrice, identificazione di un sale di cationizzazione appropriato e messa a punto le proporzioni relative di matrice, catione e analita. I parametri di acquisizione, ad esempio la modalità (lineare o riflettore), polarizzazione (positivo o negativo), tensione di accelerazione e tempo di ritardo, sono anche importanti. Dato qualche conoscenza della chimica coinvolta sintetizzare il polimero e ottimizzando i parametri di acquisizione di dati e le condizioni di preparazione del campione, spettri dovrebbero essere ottenuti con sufficiente risoluzione e accuratezza di massa per consentire l’inequivocabile determinazione dei gruppi fine della maggior parte omopolimeri (masse inferiori a 10.000) oltre all’unità di ripetizione di massa e la distribuzione di peso molecolare complessiva. Anche se ha dimostrato su un insieme limitato di polimeri, queste tecniche generali sono applicabili a una più vasta gamma di polimeri sintetici per determinare la distribuzione di massa, anche se fine gruppo determinazione è possibile solo per gli omopolimeri con strette dispersità.
Con i miglioramenti nella vita di tecniche di polimerizzazione, polimeri di precisione con gruppi terminali quantitativamente funzionalizzati sono sempre più disponibili1. Lo sviluppo simultaneo di azide-alchino e thiolene fare clic su componenti chimici ha permesso l’accoppiamento quasi quantitativa delle macromolecole di altre parti, fornendo accesso a una gamma di materiali ibridi2,,3,4 . Tuttavia, sono necessarie tecniche analitiche precisi per caratterizzare i materiali e i prodotti di queste reazioni di coniugazione di polimero partenza. Tempo di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice volo della spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) è una tecnica analitica di ionizzazione morbida prezioso per la caratterizzazione di polimeri perché può generare ioni di polimero in uno stato di singola carica con il minimo frammentazione5,6. MALDI-TOF MS ha importanti vantaggi su altri metodi di caratterizzazione dei polimeri convenzionali perché può fornire spettri di massa con risoluzione del n-mers individuali all’interno della distribuzione di massa di polimero. Di conseguenza, tali spettri di massa può fornire informazioni precise circa il peso molecolare medio, ripetere unità di massa e peso molecolare dispersità7, che a sua volta può delucidare concorrenti meccanismi di polimerizzazione come trasferimento di catena8 . Tuttavia, MALDI-TOF MS è particolarmente potente a fornire informazioni su polimero fine gruppi9,10, che può essere utilizzato per confermare la fine gruppo modifiche10,11 e altri trasformazioni12 come polimero cyclizations11,13. Altrettanto importante, la relativamente piccola quantità di analita (sub-microgrammi) necessaria per la spettrometria di massa analisi rende questa tecnica utile per la caratterizzazione quando siano disponibili solo traccia quantità di materiale.
L’analisi MALDI-TOF MS Polimeri può essere diviso in quattro distinte fasi: preparazione, calibrazione dello strumento, spettrale acquisizione e analisi dei dati di esempio. Preparazione del campione è il passo più essenziale per la generazione ottimizzata di spettri di massa MALDI-TOF e si verifica prima che il campione è stato introdotto in strumento14,15. La selezione di una matrice appropriata con parametri di solubilità simili come il polimero dell’analita è fondamentale per ottenere spettri di massa MALDI-TOF di alta qualità e linee guida per la selezione della matrice sono state segnalate altrove14,15, 16,17. Un database di polimero MALDI “ricette” per la preparazione del campione è stato anche pubblicato online18. Per i nuovi polimeri, selezione della matrice può essere affrontato prima comprendere la solubilità del polimero e selezionando una matrice con simili solubilità parametri14,19. Polimeri con affinità protonica alta possono essere protonata dalla maggior parte delle matrici14 (che spesso contengono gruppi carbossilici), ma per altri polimeri, un agente di cationizzazione è richiesto14. Ioni alcalini adducono bene con ossigeno-contenere specie (ad es. poliesteri e polieteri), mentre gli idrocarburi insaturi (es. polistirolo) addotto con metalli di transizione quali gli ioni argento e rame14, 19. perché i campioni di polimero in questo esperimento contenevano atomi di ossigeno nella spina dorsale, sodio o potassio trifluoroacetato (TFA) sono stati usati come l’agente di cationizzazione. Dopo aver selezionati gli agenti di matrix e cationizzazione, le proporzioni relative di analita, agente cationico e matrice devono essere attentamente ottimizzate per garantire alto segnale/disturbo. In questa procedura, i parametri per la preparazione del campione sono già stati ottimizzati, tuttavia una procedura di ottimizzazione empirica campione (passo 1.4.1., Figura 1) che varia sistematicamente le concentrazioni dei tre componenti (analita, cazione e matrice) è efficace per la rapida determinazione loro rapporti ottimali.
Acquisizione dati richiede anche l’ottimizzazione di un numero di parametri. I parametri più importanti includono la modalità ioni positivi o negativi dello spettrometro, la modalità di funzionamento dello strumento (lineare rispetto al riflettore), la tensione di accelerazione e il tempo di ritardo di estrazione. Un altro modo che la risoluzione può essere aumentata è attraverso l’utilizzo di “reflectron” modalità20,21,22,23. Modalità reflectron essenzialmente raddoppia la traiettoria di volo degli ioni al rilevatore riflettendo gli ioni all’estremità del tubo di volo indietro verso un rilevatore nei pressi della sorgente mentre rifocalizzazione ioni con diversi momenti, e quindi aumentando la risoluzione però diminuendo la potenza del segnale. Inoltre, gli spettri ad alta risoluzione più alti ottenibile facendo diminuire la potenza del laser che riduce al minimo il rapporto segnale-rumore facendo diminuire il numero e l’energia delle collisioni e quindi riducendo la frammentazione e la disomogeneità cinetica24. Sintonizzando tutti questi parametri, gli ioni possono essere focalizzati per minimizzare l’effetto di eventuali disomogeneità nella posizione iniziale o la velocità che si verifica durante il processo di desorbimento laser. Quando i parametri di acquisizione sono ottimizzati, isotopici risoluzione spesso possa essere raggiunti per ioni con masse superiori a 10.000 Da, anche se questo dipende anche la lunghezza del tubo di volo e il design dello strumento. Più organici composti che contengono almeno un eteroatomo sono inclini a complessante con cationi alcalini quali litio, sodio e potassio. Molti dei metalli dell’alcali sono monoisotopes o degli isotopi limitati e pertanto non amplino la distribuzione.
Mentre i parametri dello strumento possono essere regolati per ottimizzare la precisione di dati, precisione dei dati avviene solo con un’ appropriata calibrazione11. Proteine e peptidi erano originariamente utilizzati come calibranti grazie alla loro monodispersity e disponibilità, ma soffrono di stabilità variabile e la prevalenza di impurità25. Alternative più conveniente e stabile hanno incluso i cluster inorganici e polidispersi polimeri26,27,28,29. Purtroppo, queste funzionalità alternative disperdere le masse, che complicano le assegnazioni di massa, come pure le più piccole masse in generale, che li rende utili solo per tarature riportate Da 10.000. Per combattere questi problemi, Grayson et al. 25 ha sviluppato un sistema di calibrazione di MS Dendrimero-based, poliestere monodispersi, che vanta sia vasta matrice e solvente compatibilità, stabilità di durata (> 8 anni) e minor costo di produzione. Basato sui punti di forza di questo sistema, è stato selezionato come il calibratore per questi esperimenti.
Ci sono due tipi principali di calibrazione: interne ed esterne30. Effettuare la calibrazione esternamente, standard con le masse che staffa che dell’analita sono disposto sul piatto di destinazione MALDI in un campione diverso rispetto l’analita per generare uno spettro di massa separato da cui può essere generato un file di calibrazione. D’altra parte, una maggiore precisione può essere realizzata spesso con una calibrazione interna, che coinvolge il calibratore di miscelazione con l’analita per ottenere uno spettro ibrido con segnali calibratore sia dell’analita. Nella procedura descritta di seguito, è stata implementata una calibrazione esterna. Dopo la corretta calibrazione della bilancia massa, dati di massa accurati analita possono essere acquisiti. Per garantire la più accurata calibrazione, è importante che l’acquisizione dei dati si verifica subito dopo la calibrazione.
Infine, una volta calibrato l’ottimizzata, insiemi di dati sono stati acquisiti e i dati sono stati analizzati per fornire informazioni strutturali sui campioni di polimero. La spaziatura tra n-mers all’interno della distribuzione di polimeri in grado di fornire misure accurate dell’unità ripetitiva massa. Il peso molecolare medio numerico (Mn) e altri calcoli di distribuzione di massa (ad es., Mw (peso molecolare medio ponderale) e Đ (dispersità)) può essere determinata anche dalla distribuzione segnale nel (spettri di massa fase 4.2 per i calcoli). Forse in modo più univoco, nel caso di omopolimeri, la somma delle masse di gruppo fine può essere confermata determinando l’offset della distribuzione polimero per quanto riguarda la massa delle unità ripetuta da solo. Gli spettri di massa MALDI-TOF ricco di informazioni forniscono dati di caratterizzazione prezioso che sono complementari alle più tradizionali tecniche di caratterizzazione di polimeri come cromatografia di esclusione di formato, spettroscopia infrarossa-trasformata di Fourier, e risonanza magnetica nucleare.
Spettrometria di massa MALDI-TOF è un prezioso strumento analitico per la caratterizzazione dei polimeri a causa della sua capacità di generare ioni polimero nello stato singolarmente caricato e con frammentazione minima. Questa tecnica di ionizzazione soft utilizza impulsi laser corti per desorbimento campioni allo stato solido dell’analita polimero incorporati in una matrice composta per generare ioni di polimero in fase gassosa. Le macromolecole sono in genere ionizzate di complessazione con i cationi che vengono aggiunti alla matrice per consentire la loro analisi mediante spettrometria di massa. Questi ioni macromolecolari quindi vengono accelerati da una tensione di estrazione per portarli nell’area di campo-libero del tubo di volo che può consentire loro m/z deve essere determinato basato sul loro tempo di volo tra la sorgente di ioni e il rivelatore5 , 32.
Rispetto ad altre tecniche di caratterizzazione di polimeri, qualità di spettri MALDI-TOF MS è fortemente dipendente da parametri di acquisizione dati e preparazione del campione. Anche se non c’è alcuna formula set per la preparazione del campione, comprendere la funzione di ogni componente della preparazione del campione consente più rapida ottimizzazione empirica. Il fattore più importante nella preparazione del campione MALDI è selezione della matrice poiché compatibilità della matrice con l’analita di polimero è fondamentale per permettendo matrice eccitato generare singoli, desorbiti macromolecole in un stato ionizzato5, 15,17,19. Dopo aver selezionati gli agenti di matrix e cationizzazione adatti, il corretto rapporto dell’analita, di matrice e di cationizzazione agente deve essere determinato. Ciò sarà possibile empiricamente creando una griglia bidimensionale di campioni (Figura 1) sulla piastra bersaglio MALDI-TOF MS (Figura 2) con l’aumento di concentrazione di matrice su un asse e aumentando la concentrazione di sostanza di cationizzazione sul altri.
Simile alla preparazione del campione MALDI, non c’è nessuna formula fissa per la determinazione dei parametri di acquisizione dati; Tuttavia, certe tendenze dovrebbero essere considerate per accelerare ottimizzazione spettrale. Modalità reflectron, che aumenta la risoluzione, ma diminuisce il segnale complessivo, viene in genere scelto per gamme più basse di massa (in questi esempi, seguito Da 4.000) dove si può ottenere una risoluzione isotopica. In questi casi, i calcoli di massa monoisotopic e picco raccolta metodi sono stati usati. Per campioni di polimero con masse sopra Da 4.000, modalità lineare è stato usato con i calcoli di massa medio e picco metodi di prelievo. Per migliorare la risoluzione del segnale, le tensioni di origine dello ione devono essere regolate in piccoli incrementi con la tendenza generale dei polimeri di massa più grandi con maggiore tensione differenziale (IS1 contro IS2).
Po ottimizzato preparazione del campione e acquisizione parametri in grado di fornire precisione, accuratezza di massa può essere raggiunto solo attraverso taratura efficace. Il tempo di volo per una data massa può variare leggermente rispetto ai parametri di acquisizione variabile e piastra anche posizioni, pertanto una taratura dovrebbe essere effettuata per ogni set di parametri di acquisizione ottimizzate per ottenere massa accurata determinazioni5,30. Una volta che sono stati ottimizzati i parametri di acquisizione e preparazione dei campioni, gli spettri devono essere tarati usando queste stesse condizioni esatte.
A causa dell’eccezionale risoluzione e accuratezza di massa osservata negli spettri di massa MALDI-TOF ottimizzati dei polimeri, questa tecnica è diventata un valido strumento gratuito per la determinazione dei dati di distribuzione di massa di polimero. Tuttavia, la capacità di risolvere le singole unità di ripetizione all’interno della distribuzione di massa di polimero fornisce un vantaggio particolare per l’analisi di gruppo fine relativo altro polimero tecniche di caratterizzazione come la cromatografia a permeazione di gel (GPC) e nucleare risonanza magnetica (NMR). Questo è particolarmente utile per determinare la fedeltà delle reazioni di funzionalizzazione gruppo fine e la natura quantitativa delle reazioni di fine gruppo coniugazioni. Questo manoscritto ha dimostrato la capacità di risolvere la massa dell’unità di ripetizione di singoli polimero con fino a due punti decimali di accuratezza di massa, consentendo la conferma delle modifiche gruppo fine con un elevato livello di fiducia. Con i notevoli progressi che sono stati fatti recentemente nel campo della sintesi del polimero di precisione, MALDI-TOF MS sta diventando uno strumento sempre più importante per determinare la struttura macromolecolare e funzionalità.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono che il Consorzio Smart Design di materiali, analisi ed elaborazione (SMATDAP) finanziato dalla National Science Foundation sotto un accordo cooperativo IIA-1430280 e LA Consiglio dei reggenti per un Istituto europeo di Oncologia (MEP). Campioni di polimero per questi esperimenti sono stati forniti da MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Pubblicazione di accesso aperta di questo articolo è sponsorizzato da MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |