Un protocolo para el tiempo de ionización desorción láser asistida por matriz de caracterización de la espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) de los polímeros sintéticos se describe como la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral y análisis de datos de vuelo.
Hay muchas técnicas que pueden emplearse en la caracterización de los homopolímeros sintéticos, pero pocos proporcionan útiles de información para el análisis de grupo final como el tiempo de ionización de desorción láser asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS). Este tutorial muestra los métodos para la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral, y análisis de datos de polímeros sintéticos utilizando parámetros de MALDI-TOF MS. crítico durante la preparación de la muestra incluyen la selección de la matriz, identificación de una sal de embargo correspondiente y ajuste las proporciones relativas de la matriz, el catión y el analito. Los parámetros de adquisición, como el modo (lineal o reflector), polarización (positivo o negativo), voltaje de aceleración y tiempo de retardo, también son importantes. Teniendo en cuenta algunos conocimientos de la química para sintetizar el polímero y la optimización de los parámetros de adquisición de datos y las condiciones de preparación de muestra, espectros deben obtenerse con suficiente resolución y exactitud total para permitir la clara determinación de los grupos de final de la mayoría homopolímeros (masas por debajo de 10.000) además de la unidad de repetición masa y la distribución de peso molecular general. Aunque demostró en un conjunto limitado de polímeros, estas técnicas generales son aplicables a una gama mucho más amplia de polímeros sintéticos para determinar distribuciones de masa, aunque final Grupo determinación sólo es posible para los homopolímeros con estrechas dispersity.
Con mejoras en la vida de técnicas de polimerización, polímeros de precisión con grupos finales cuantitativamente funcionalizados son cada vez más disponibles1. El desarrollo concurrente de azida-alquino y thiolene haga clic en química ha permitido el acoplamiento casi cuantitativo de macromoléculas en otras partes, de facilitar el acceso a una gama de híbridos de materiales2,3,4 . Sin embargo, técnicas analíticas precisas están necesario caracterizar la partida materiales y productos de estas reacciones de conjugación de polímero. Tiempo de desorción/ionización láser asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS) es una técnica analítica de ionización suave valiosos para la caracterización de polímeros porque puede generar iones de polímero en un estado de carga solo con un mínimo fragmentación5,6. MALDI-TOF MS tiene grandes ventajas sobre otros métodos convencionales de caracterización de polímeros porque puede proporcionar espectros de masas con la resolución del n-mers individual dentro de la distribución en masa del polímero. En consecuencia, tales espectros de masas puede proporcionar información precisa sobre el peso molecular promedio, repita la unidad de masa y peso molecular dispersity7, que a su vez puede dilucidar mecanismos de polimerización que compiten como transferencia de cadena8 . Sin embargo, MS de MALDI-TOF es particularmente potente en proporcionar información sobre el polímero final grupos9,10, que puede utilizarse para confirmar fin grupo modificaciones10,11 y otros transformaciones12 como polímero cyclizations11,13. Igualmente importante, la relativamente pequeña cantidad de analito (sub-microgramos) necesaria para la espectrometría de masa análisis hacen esta técnica útil para la caracterización cuando solamente cantidades de rastro de material están disponibles.
El análisis del MS de MALDI-TOF de polímeros se pueden dividir en cuatro pasos distintos: preparación, calibración del instrumento, adquisición espectral y análisis de los datos de la muestra. Preparación de la muestra es el paso más esencial para la generación optimizada de espectrometría de masas MALDI-TOF y se produce antes de la muestra se introduce en el instrumento14,15. La selección de una matriz correspondiente con los parámetros de solubilidad similares como el analito de polímero es fundamental para obtener espectros de masas de MALDI-TOF de alta calidad y las directrices para la selección de la matriz se han divulgado a otra parte14,15, 16,17. Una base de datos de polímero MALDI “recetas” para la preparación de la muestra también ha sido publicado en línea18. Para los nuevos polímeros, selección de matriz puede ser abordado entendiendo la solubilidad del polímero y selección de una matriz con similares parámetros de solubilidad14,19. Polímeros con afinidad alta protón pueden ser protonado por mayoría matrices14 (que con frecuencia contienen grupos de ácido carboxílico), pero para otros polímeros, un agente de embargo es necesario14. Los iones álcali aducción con oxígeno-que contienen especies (ej. poliésteres y poliéteres), mientras que hidrocarburos insaturados (por ejemplo. poliestireno) aducción con metales de transición como los iones de plata y cobre14, 19. porque las muestras de polímero en este experimento contenían átomos de oxígeno en la columna vertebral, trifluoroacetate del sodio o del potasio (TFA) fueron utilizados como el agente del embargo. Una vez que los agentes de matrix y el embargo han sido seleccionados, las proporciones relativas de analito, agente catiónico y matriz deben optimizarse cuidadosamente para asegurar alta señal a ruido. En este procedimiento, los parámetros para la preparación de la muestra ya se han optimizado, sin embargo un procedimiento de optimización empírica muestra (paso 1.4.1., figura 1) que varía sistemáticamente las concentraciones de los tres componentes (analito, matriz y el catión) es eficaz para determinar rápidamente su relación óptima.
Adquisición de datos también requiere la optimización de un número de parámetros. Los parámetros más importantes son el modo de iones positivos o negativos del espectrómetro, el modo de operación del instrumento (lineal versus reflector), el voltaje de aceleración y el tiempo de retardo de extracción. Otra forma que se puede aumentar la resolución es mediante la utilización de “reflectron” modo20,21,22,23. El modo Reflectron esencialmente duplica la trayectoria de los iones al detector reflejando los iones en el extremo del tubo de vuelo hacia un detector cerca de la fuente mientras que reenfoque iones con diferentes momentos, y por lo tanto aumentando la resolución aunque disminución de la intensidad de señal. Además, pueden obtenerse espectros de resolución mayor al disminuir la potencia del láser que reduce al mínimo la relación señal a ruido por disminuir el número y energía de las colisiones y por lo tanto reduciendo la fragmentación y la cinética inhomogeneidades24. Templando todos estos parámetros, los iones pueden ser enfocados para minimizar el efecto de cualquier inhomogeneidad en posición inicial o velocidad que se produce durante el proceso de desorción láser. Cuando se optimizan los parámetros de adquisición, resolución isotópica a menudo se logra para los iones con masas superiores a 10.000 Da, aunque también esto depende de la longitud del tubo de vuelo y el diseño del instrumento. Los compuestos más orgánicos que contienen al menos un heteroatom son propensos a la formación de complejos con cationes alcalinos tales como litio, sodio y potasio. Muchos de los metales alcalinos son monoisotopes o de isótopos limitadas y por lo tanto no ampliar la distribución.
Mientras que los parámetros del instrumento pueden ajustarse para optimizar la precisión de los datos, exactitud de los datos sólo se logra con una calibración adecuada11. Proteínas y péptidos fueron utilizados originalmente como calibradores debido a su monodispersity y disponibilidad, pero sufren de estabilidad variable y la prevalencia de las impurezas25. Alternativas más rentables y estables han incluido grupos inorgánicos y polidispersas polímeros26,27,28,29. Desafortunadamente, estas características alternativas dispersar a las masas, que complican las asignaciones totales, así como masas más pequeñas en general, haciéndolos útiles sólo para calibraciones por debajo de 10.000 Da. Para combatir estos problemas, Grayson et al. 25 desarrolló un sistema de calibración MS dendrímero-base de poliéster que es monodispersa y cuenta tanto matriz amplia y solvente compatibilidad, estabilidad de vida útil (> 8 años) y menor costo de producción. Basado en las fortalezas de este sistema, fue seleccionado como calibrant para estos experimentos.
Hay dos tipos de calibración: interna y externa30. Cuando calibrar externamente, un estándar con las masas que soporte que el analito se colocan en la placa MALDI de destino en condiciones diferentes de la muestra de analito para generar el espectro de masa separado de la que se puede generar un archivo de calibración. Por otro lado, a menudo puede conseguirse mayor precisión con una calibración interna, que consiste en mezclar el calibrant con el analito para obtener un espectro híbrido con señales calibrant y analito. En el procedimiento descrito a continuación, se aplicó una calibración externa. Después de la calibración adecuada de la escala total, pueden ser adquiridos datos masa de analito precisa. Para asegurar la calibración más precisa, es importante que la adquisición de datos se produce poco después de la calibración.
Finalmente, una vez calibrado el optimizado, los conjuntos de datos fueron adquiridos, y los datos fueron analizados para proporcionar información estructural sobre las muestras de polímero. La distancia entre n-mers dentro de la distribución del polímero puede proporcionar una medición precisa de la unidad de repetición masiva. Número peso molecular promedio (Mn) y otros cálculos de distribución de masa (p. ej., Mw (peso molecular promedio en peso) y Đ (dispersity)) también puede ser determinado de la distribución de señal en los espectros de masas ( Paso 4.2 para los cálculos). Tal vez más excepcionalmente, en el caso de los homopolímeros, la suma de las masas del grupo extremo puede confirmarse determinando el desplazamiento de la distribución de polímeros con respecto a la masa de las unidades que se repiten solo. Los espectros de masas de MALDI-TOF de ricos en información proporcionan datos de caracterización valiosa que son complementarios a los tradicionales técnicas de caracterización de polímeros como la cromatografía por exclusión de tamaño, espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier, y resonancia magnética.
Espectrometría de masas MALDI-TOF es una valiosa herramienta analítica para la caracterización de polímeros debido a su capacidad para generar iones de polímero en el estado cargado por separado y con la mínima fragmentación. Esta técnica de ionización suave utiliza pulsos de láser corto para la desorción de las muestras de estado sólidas del analito polímero embebidas en una matriz compuesta para generar iones de polímero en la fase gaseosa. Típicamente, las macromoléculas se ionizan por formación de complejos con cationes que se agregan a la matriz para permitir su análisis por espectrometría de masas. Estos iones macromoleculares entonces son acelerados por un voltaje de extracción para llevar a la región libre de campo del tubo de vuelo que permita su m/z para determinarse basado en su tiempo de vuelo entre la fuente de iones y el detector5 , 32.
En comparación con otras técnicas de caracterización de polímeros, MALDI-TOF MS espectros calidad es fuertemente dependiente de los parámetros de adquisición de datos y preparación de la muestra. Aunque no hay ninguna determinada fórmula para preparación de muestras, comprender la función de cada componente de la preparación de la muestra permite optimización empírica más rápido. El factor más importante en la preparación de la muestra MALDI es selección de la matriz porque la compatibilidad de la matriz con el analito de polímero es crítica para permitir que la matriz emocionado generar macromoléculas desorbidas, solo en un estado ionizado5, 15,17,19. Una vez que han sido seleccionados agentes de matrix y embargo apropiados, debe determinarse la proporción correcta de agente de analito, matriz y embargo. Esto puede lograrse empíricamente mediante la creación de una rejilla de dos dimensiones de las muestras (figura 1) en la placa de la blanco del MALDI-TOF MS (figura 2) con aumento de la concentración de la matriz en un eje y aumento de la concentración de agente de embargo en la otros.
Similar a la preparación de la muestra MALDI, no hay determinada fórmula para la determinación de parámetros de adquisición de datos; sin embargo, deben considerarse ciertas tendencias para acelerar la optimización espectral. Modo Reflectron, que aumenta la resolución pero disminuye la señal global, por lo general es elegido para gamas más bajas masivas (en estos ejemplos, a continuación Da 4.000) donde se logra resolución isotópica. En estos casos, se utilizaron cálculos masa monoisotopic y pico recogiendo métodos. Para muestras de polímeros con masas por encima de 4.000, modo lineal se utilizó con cálculos de masa media y enarbolar los métodos de recolección. Para mejorar la resolución de la señal, se deben ajustar los voltajes de la fuente de iones poco a poco con la tendencia general de mayor masa polímeros teniendo un mayor voltaje diferencial (IS1 versus IS2).
Tiempo optimizado muestra preparación y adquisición de parámetros pueden ofrecer precisión, precisión de masa sólo puede lograrse a través de la calibración efectiva. El tiempo de vuelo para una masa dada puede variar sutilmente con respecto a los parámetros de adquisición variable y posiciones de la placa incluso, por lo tanto una calibración debe realizarse para cada conjunto de parámetros de adquisición optimizados para rendimiento de masa exacta determinaciones de5,30. Una vez que se han optimizado los parámetros de adquisición y preparación de la muestra, los espectros deben calibrarse utilizando estas mismas condiciones exactas.
Debido a la excepcional resolución y exactitud total observado en la espectrometría de masas MALDI-TOF optimizada de polímeros, esta técnica se ha convertido en una valiosa herramienta de conexión para la determinación de datos de distribución en masa de polímero. Sin embargo, su capacidad de resolver individuales unidades repetidas dentro de la distribución de masa de polímero proporciona una ventaja particular para el análisis final del grupo en comparación con otros polímeros técnicas de caracterización como cromatografía de gel permeación (GPC) y nuclear resonancia magnética (RMN). Esto es particularmente valioso para determinar la fidelidad de las reacciones de funcionalización de grupo final y la naturaleza cuantitativa de reacciones de conjugaciones de grupo final. Este manuscrito ha demostrado la capacidad para resolver la masa de unidades repetidas de polímero individuales con un máximo de dos puntos decimales de precisión total, lo que permite la confirmación de modificaciones de grupo final con un alto nivel de confianza. Con los avances sustanciales que se han hecho recientemente en el campo de la síntesis del polímero precisión, MALDI-TOF MS se está convirtiendo en una herramienta cada vez más importante para determinar la estructura macromolecular y funcionalidad.
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen que el consorcio Smart diseño de materiales, análisis y procesamiento (SMATDAP) financiado por la National Science Foundation bajo acuerdo cooperativo IIA-1430280 y la LA Junta de regentes de una beca de postgrado (MEP). Las muestras de polímero para estos experimentos fueron proporcionadas por MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Publicación de acceso abierto de este artículo es patrocinado por MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |