Summary
נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.
Abstract
תאים דנדריטים (DC) הם אוכלוסיות הטרוגניות תא שונים שלהם סמני קרום התא, דפוסי ההגירה והפצה, וכן מצגת אנטיגן ויכולות הפעלה תא T שלהם. מאז החיסונים רוב הגידול ניסיוני מודלים דורש מיליוני DC, הם נרחב שבודד מח העצם או הטחול. עם זאת, אלה DC באופן משמעותי נבדלים דם, גידול DC בתגובות שלהם מכלולי המערכת החיסונית (IC), ככל הנראה קולטנים לקטין מצמידים Syk אחרים. חשוב, שגבה את הרגישות של DC מולקולות הקשורים סכנה, הנוכחות של endotoxins או נוגדנים crosslink הפעלת קולטנים באחד לבודד שלבים יכול לגרום לקרקע של DC, ובכך להשפיע על הפרמטרים, או לפחות המינון, הנדרש כדי להפעיל אותם. לכן, כאן אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור בידוד MoDC דם, גידולים תוך הימנעות הפעלה מוקדמת שלהם. בנוסף, פרוטוקול מסופק עבור הפעלת MoDC עם גידול IC, וניתוחים הבאים שלהם.
Introduction
מאז גילוין, תאים דנדריטים (DC) יש מוקד מחקר מקיף עקב יכולתם ייחודי להטות את תא T בידול1. בעשורים האחרונים, מאמץ מחקר מקיף ביקש להגדיר תת-קבוצות DC השונים ואת תפקידם במהלך התקדמות הגידול, חסינות 2. בקרי קבוצת מחשבים מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות תא נבדלים אחד מהשני שלהם רצפטורים זיהוי תבניות, רקמות הפצה, נודדים ל אנטיגן הצגת יכולות3,4,5. לעומת קבוצות משנה אחרים DC, DC נגזר מונוציט (MoDC) הם הרבה יותר בשפע גידולים ו ניתן להפיק בקלות של מחזורי או גידולים הסתננות ומונוציטים6,7. לכן, מחקרים קליניים רבים המבקשים לנצל את השכיחות היחסית שלהם מבוססים על מניפולציה ויוו ו- ex-vivo של MoDC עצמיים כדי להפיק תא T חסינות 8,9.
באופן דומה, מבוסס-DC חיסון ניסיוני הגידול מודלים דורש זריקות טורי 2-3, 5-7 ימים בנפרד, של 1-2 x 106 DC מופעל פעמו עם גידול אנטיגנים. לכן, כדי להשיג את מספר גדול של DC, רוב המחקרים העכבר יש בשימוש בעיקר MoDC תרבותי של מח העצם (מוניטור) סימנים מקדימים ב- GM-CSF 7-9 ימים (IL-4 אין צורך בהגדרת העכבר)10,11. למרות זאת, בהתחשב מהממת GM-CSF עכברים יש בסך הכל נורמלי DC תא 12,13, וקיבל את אוכלוסיות מעורבות המתקבל התרבות הזו, כבר נקרא14 הרלוונטיות פיזיולוגיים של DC אלה לתוך השאלה.
לחלופין, DC עשויים להיות מבודד באופן שגרתי מתאי הטחול. עם זאת, DC מהווים רק כ 0.8-0.3% של תאי הטחול הכולל (וכתוצאה מכך כ 7 x 105 DC/טחול), ואת אלו תאים, רק CD103+ DC ו- MoDC יכול להעביר בחזרה אל איברי הלימפה. מאז MoDCs מהווים כ- 10-15% של הטחול DC אוכלוסיות15,16, ברוב הפרוטוקולים בידוד תשואה כ עונה 1 פרק 105 MoDC לכל הטחול. הרחבה של MoDC יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת transfected B16 תאים להפריש GM-CSF, וכתוצאה מכך עלייה 100-fold MoDC הטחול17. עם זאת, השימוש MoDC לפיתוח חיסונים DC מוגבל שכן הליך זה לא יכול להיעשות בני אדם, רכש את MoDC כבר מאוד מופעלים.
בנוסף לקבלת נאותה מספרים של DC, אתגר נוסף על פיתוח חיסונים יעילים DC נגד תאים סרטניים עצמיים כרוך העדר מספיק אותות סכנה בהגדרת הגידול להפעיל באופן מלא DC. אינדוקציה של אותות co-stimulatory מושגת בדרך כלל באמצעות הפעלה של זיהוי תבנית קולטנים (PRR), או c-type לקטין איתות המסלולים18,19,20,21. גישה נוספת להפעלת DC מנצלת את היכולת שלהם תופסים אנטיגנים דרך אינטראקציות עם רצפטורים Fcγ פני השטח (FcγR). ואכן, מספר כתבי יד חשובים הראו כי הזרקה של MoDC מ מבשרי מוניטור מופעל עם הגידול-אג IC יכול למנוע את צמיחת הגידול בהגדרות מניעתי, והוא יכול להוביל מיגור של גידולים הוקמה22,23 .
בשני העיתונים האחרונות, כרמי ואח גילה כי בניגוד BMDC וה טחול DC, MoDC דם, גידולים יכולים. להגיב IC אג ללא גירויים נוספים. זה נמצא להיות בשל נוכחותם של רמות גבוהות תאיים של ויסות FcγR איתות24,25phosphatases טירוזין. על-ידי הגדרת מחסום קריטי בוושינגטון, עבודה זו מספק תובנה חשובה הדרישות לקבלת חיסון מבוסס-DC מוצלח. הדרישה גירויים נוספים לאפשר FcγR איתות, ככל הנראה איתות של רצפטורים אחרים לקטין ניצול מפל זרחון דומה, ובכך מדגיש את הצורך הימנעות לקרקע של DC במהלך הבידוד שלהם.
לכן, בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של MoDC דם, גידולים, אשר נבדלים במידה ניכרת BM וה טחול DC, ואור אמצעי זהירות שכדאי לשקול במהלך התהליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
להלן הפרוטוקולים מתייחסים בידודו של העכבר MoDC, אך העקרונות הכוללת תיתכנה לתאים אחרים DC קבוצות משנה, כמו גם. 12 - בשבוע ה-16 C57Bl/6j עכברים היו מתוחזקים שיוך אמריקאי עבור המתקן בעלי הסמכה של מעבדה חיה טיפול – מוכר. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד, תל אביב האוניברסיטה אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. בידוד של גידול הקשורים נגזר מונוציט DC
- ב תא למינארי, להסיר גידולים CO2 מורדמים עכברים ולמקם גידולים RPMI בינוני ללא סרום שור עוברית (FBS).
הערה: מומלץ לגלח את העכברים, לרסס אותם עם אתנול 70% לפני הסרת הגידולים, כדי למזער את מציג פוטנציאלי של הפרווה. להיות בטוחים כי הגידול אינו עולה על 25-40 מ מ2 מאז גידולים גדולים יותר יש פחות DC נוטים להיות שביר והם נוטים לעבור מוות של תאים. אם נדרשים מספר גדול של DC, כל עכבר יכול להיות מוזרק עם גידולים תאים באתרים מרובים. - ברדס זכוכית סטריליים, לקצוץ את הגידולים באמצעות ניתוח מספריים לחתיכות קטנות (כ 1 x 1 מ מ2).
- להוסיף כל שברי הגידול של עכבר אחד לתוך 30-mL סטרילי שטוח התחתונה צינור עם ברים מערבבים מגנטי, אשר מכיל 5 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), 2 מ"ג/מ"ל collagenase הרביעי ו- 0.01 מ"ג/מ"ל DNase אני.
התראה: התאים מיאלואידית לייצר אנרגיה באמצעות גליקוזילציה, אפילו תחת מצב יציב. לכן, מדיה לשימוש היחידה המכילה גלוקוז (למשל HBSS, RPMI, DMEM), כמו גלוקוז הרעבה עבור קטנה כמו 10-15 דקות יביא מוות של תאים, אפופטוזיס בתוך ה 24 לשימוש רק collagenase נמוך אנדוטוקסין הרביעי, כמו collagenase המיוצר על ידי גראם חיוביים חיידקים (Clostridium histolyticum).
- להוסיף כל שברי הגידול של עכבר אחד לתוך 30-mL סטרילי שטוח התחתונה צינור עם ברים מערבבים מגנטי, אשר מכיל 5 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), 2 מ"ג/מ"ל collagenase הרביעי ו- 0.01 מ"ג/מ"ל DNase אני.
- מערבבים-בערך 200-400 סל ד ב חממה 37 oC עם פגים למשך 20-30 דקות.
- הוסף 5 מ של מדיה מלאה ' מחדש להשעות נמרצות.
- לסנן התאים דרך מסננת תא 70-מיקרומטר. צנטריפוגה בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות הצניפה התאים.
התראה: אל תנסה לבודד את התאים ישירות בעקבות עיכול אנזימטי, כפי כמה גידולים עם נמק ומכילים כמויות גדולות יחסית של שאריות תאים או מטריצה חוץ-תאית. החל תאים על 15% צפיפות בינונית מעבר צבע כדי לקבל רק את התאים. - להשעות 9 מ של צפיפות בינונית מעבר צבע עם 1 מ"ל של PBS x 10 להתאמת osmolality וכדי להשיג 100% Percoll מניות פתרון. לערבב 1.5 mL צפיפות בינונית הדרגתיות במניה פתרון עם 8.5 מ ל HBSS, מערבבים אותו היטב עם גלולה תא נגזר הגידול. בעדינות שכבה 2 מ של DMEM על 15% צפיפות בינונית הדרגתיות, צנטריפוגה-400 rcf במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את supernatants, כמו התאים יהוו גלולה בתחתית הצינורית.
- לשטוף את התאים pelleted פעמיים על ידי מחדש השעיית אותם ב 10 מ"ל HBSS המכיל 2% FBS 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ואת EDTA 10 מ מ (בידוד מאגר), צנטריפוגה בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות כדי הצניפה התאים.
- ספירת תאים hemocytometer באמצעות trypan blue תחת מיקרוסקופ אור.
- להשעות מחדש עונה 1 פרק 108 תאים בבידוד 1 מ"ל מאגר, דגירה אותם בבית 4 oC עם 30 μL של CD11b+ מצומדת beads מגנטי למשך 15 דקות.
התראה: הימנע משימוש CD11c מצומדת חרוזים, כמו זה להפעיל את ה-DC, לגרום מוות של תאים. אל תנסו לחסום FcγRII ו- FcγRIII עם נוגדנים anti-CD16/32. חסימת נוגדנים מאתרים ומפסיקים FcγR זירוז זירחון חזקה של kinases מפה, ראש ה-DC.- להסיר את החרוזים לא מאוגד עודף על-ידי הוספת 9 מ של בידוד מאגר ותאים צנטריפוגה rcf 400 למשך 5-10 דקות בבית 4oC.
- וארוקן את תגובת שיקוע והשהה מחדש תאים במאגר בידוד 1 מ"ל. להחיל את התאים על עמודה מגנטי prewashed. לשטוף את העמודה פעמיים עם 3 מ"ל של מאגר בידוד.
- הסר את העמודה המגנט. פיפטה 6 מ של בידוד מאגר אל העמודה, לשטוף את התאים שכותרתו דיסקות לתוך צינור אוסף סטרילי על ידי דחיפת הבוכנה. צנטריפוגה תאים על 400 rcf למשך 5-10 דקות בבית 4 oC.
- להשעות מחדש תאים על 100 μL לכל עונה 1 פרק 107 תאים, כתם עם נוגדנים fluorophore מצומדת הבאים: Linage שליליות (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI ו Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
- למיין את התאים gating התאים קטנים, באמצעות פיזור צד (האס) והעבירו פיזור (FSC) ותרבות במדיום מלאה בתוספת 5 ננוגרם למ"ל GM-CSF. תקופת דגירה תאים של שעה ב-7 3 oC על מנת לאפשר מקרופאגים לדבוק את הצלחת. אז, העברת באופן רופף ותאים שאינם מחסידי לצלחת תרבות חדשה.
הערה: העכבר MoDC מוגדרים CD11b+/CD11c+/MHCIIהיי/Ly6Clo/int 7,26,27. הביטוי של Ly6C עשויים להשתנות באופן דרמטי בין הגידול דגמים, ובעוד כמה מודלים (למשל LMP) MoDCs לחלוטין חוסר בביטוי Ly6C. בסך הכל, אחד 100 מ מ3 B16F10 הגידול בדרך כלל מכיל 5 x 104 של DC, וכתוצאה מכך כ 4-5 x 106 תאים הכולל. התאים האלה, 10-15% תאים חיסוניים, 8-10% הם MoDC. הגדלת המספרים DC יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת עכברים עם גידולים באתרים מרובים. מיון תאי האס/FCS קטנות בלבד, כמו שאר התאים מיאלואידית מסוגל לבטא סמנים כגון CD11c ו- Ly6C.
אופציונלי: למיין את מונוציט גידולים הסתננות כתאים קטנים האס/FSC אקספרס Ly6Cהיי , אינם MHCII. לאחר מכן, תרבות ומונוציטים במבחנה עם 50 ng/mL GM-CSF להשיג DC.
2. בידוד של DC נגזר מונוציט מדם היקפי
הערה: מאז MoDCs בוגרת הם נדירים יחסית בדם העכבר, להלן הפרוטוקול מתייחס שלהם נגזרת במבחנה של monocytes ממוינים.
- כדי להגדיל את הרמות של monocytes בדם, עזים ומתנגד עכברים עם 4% איזופלוריין, מזריקים להם subcutaneously (ש) עם μg 1 של GM-CSF ב- 50 μL PBS.
- לאחר 1-2 h, להקריב עכברים באמצעות CO2.
התראה: לא להקריב עכברים מאת נקע בצוואר הרחם, כמו זה יגרום דימום פנימי. - מיד לאחר euthanization, לרסס את העכבר עם 70% אתנול ולהסיר את העור המכסה את הלב באמצעות מספריים כירורגיים, ברדס זרימה שכבתית סטרילי. לנקות את המספריים עם אתנול וחותכים את העלייה הימנית של הלב. . לאט, לרוקן את הלב דרך החדר הימני עם 20 מ מ EDTA HBSS באמצעות מזרק 10-mL ואת המחט 25-G.
- לאסוף את הדם עם מזרק עקר חלל הצדר לתוך צינור סטרילי המכילה הפאראן גופרתי, EDTA. ממשיכים להוריד את הלב עד הכבד, הריאות הופכות ורוד או לבן.
- להחיל את הדם לתוך צנטריפוגה mediumand הדרגתיות צפיפות-400 rcf בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עם בלם נמוך.
התראה: שימוש ללא אנדוטוקסין צפיפות בינונית הדרגתי (בדרך כלל פחות מ 0.12 האירופי לכל מ"ל).- איסוף תאי תאי לתוך צינור חדש. לשטוף את התאים על ידי השעיית מחדש ב- 10 מ"ל HBSS המכיל 2% FBS 1% פניצילין/סטרפטומיצין, EDTA 10 מ מ (בידוד מאגר), ואז צריך שתוציאו בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות הצניפה התאים.
התראה: שימוש רק מדיה המכילה לפחות 1 g/L של גלוקוז.
- איסוף תאי תאי לתוך צינור חדש. לשטוף את התאים על ידי השעיית מחדש ב- 10 מ"ל HBSS המכיל 2% FBS 1% פניצילין/סטרפטומיצין, EDTA 10 מ מ (בידוד מאגר), ואז צריך שתוציאו בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות הצניפה התאים.
- לבחירה חיובית CD11b, להשעות מחדש עונה 1 פרק 108 תאים במאגר בידוד 1 מ"ל, דגירה אותם למשך 15 דקות עם 50 μL של CD11b מצומדת beads מגנטי בבית 4 oC.
- רוחצים חרוזים עודף על-ידי הוספת 9 מ של בידוד המאגר צריך שתוציאו ב 400 rcf למשך 5-10 דקות בבית 4 oC. לשאוב את supernatants את מחדש להשעות את התאים במאגר בידוד 1 מ"ל. להחיל את התאים על עמודה מגנטי prewashed על פי הוראות היצרן.
- הסר את העמודה המגנט פיפטה 6 מ של בידוד מאגר אל העמודה, לשטוף את התאים שכותרתו דיסקות לתוך צינור אוסף סטרילי על ידי דחיפת הבוכנה. Centrifuge תאים על 400 rcf למשך 5-10 דקות בבית 4 oC. לשטוף את העמודה פעמיים עם 3 מ"ל של מאגר בידוד.
- להשעות מחדש תאים 1 x 107 תאים/100 μL בידוד מאגר, הכתם עם נוגדנים fluorophore מצומדת הבאים: 0.1 μg CD115, 0.25 μg MHCII ו- 0.1 μg Ly-6 C/1 x 106 תאים.
- מיין תאים לפי gating על פיזור אמנם קטנים (האס) ותאים פיזור קדמי קטן (FSC).
הערה: העכבר ומונוציטים דלקתיות מוגדרות בדרך כלל כ CD115+/MHCIIlo/מינוס/Ly6Cשלוםואני המסיירים ומונוציטים מוגדרים CD115+/Ly6C /MHCIIlo/מינוסמינוס 4.5. במקרים שבו אין הפרדה בין שתי תת-קבוצות נדרשת, סה כ האסהלאו/FCSהלאו/CD115+/MHCIIהלאו התאים ניתן למיין. תמימה והן נושאות עכברים מכילים כ 5-8 x 104 MoDC לכל 1 מ"ל של דם, עד 4-5 x 105 MoDC הבאים הזרקה של GM-CSF. מהם, כ-70% ומונוציטים דלקתיות, 30% מסיירים ומונוציטים. - צלחת התאים-ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בתקשורת מלאה בתוספת 20 ng/mL GM-CSF. לאחר יום 1, העברה התאים שאינם מחסידי וחסיד באופן רופף צלחת חדשה ותרבות עבור 4-5 ימים נוספים.
התראה: DC מדיה לא להשלימה עם פירובט.
3. הכנת אג-גידול מכלולי המערכת החיסונית
- התרבות תאים סרטניים ב- 75 ס מ2 תרבות שתייה צידניות כדי 70% זרימה בתקשורת DMEM מלאה.
- להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין/EDTA להתנתק תאים מן התרבות הבקבוק וצג תא המורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אור כדי להימנע trypsinization יתר.
- הוסף 8 מ של מדיה תרבות שלמה (לכל 2 מ"ל של טריפסין) כדי לעכב את תהליך העיכול טריפסין, צנטריפוגה בבית 4 oC, rcf 400 למשך 5-10 דקות הצניפה התאים.
הערה: הקפד לבדוק תאים סרטניים Mycoplasma באמצעות ערכת ה-PCR מסחרי. בדיקת נוכחות של חיידקים גראם שליליים, פטריות endotoxins באמצעות Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay28). חייב להיות מסונן דרך 0.22 μM, לגילוי וירוסים קוד של תקנות פדרליות 9 סרום. בנוסף, לבחון את תרבות ומדיה סרומים על ידי הטלת 100-200 μL על גבי אגר ליברות או מרק, תרבות 2 ימים ב- 37 oC. - לשטוף תאים שוב מן השרידים טריפסין, סרום על ידי השעיית אותם מחדש ב 10 מ"ל PBS ו צנטריפוגה-400 rcf במשך 5-10 דקות לשאוב תגובת שיקוע וחזור לשטוף את 2 פעמים נוספות.
- תיקון התאים ב- 1.8% buffered paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים על ידי השעיית אותם מחדש ב 10 מ"ל PBS ו צנטריפוגה בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות.
- Supernatants וביופסיה, חזור לשטוף פעמיים נוספות.
אופציונלי: עבור מבחני ספיגת הגידול, התאים ניתן שכותרתו מאת המקננת בהם במשך 5 דקות ב 37 oC ב- PBS המכיל 1 μM carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE). CFSE הוא מתרצה ואז עם מדיה מלאה במשך 10 דקות בקרח. צריך לרחוץ את התאים בהרחבה ב- PBS המכיל 2% סרום כדי להסיר שאריות צבע.
- להשעות מחדש תאים FACS מאגר (PBS שיושלם עם 2% FCS + 5 מ מ EDTA) ו 0.5 μg/mL של אנטי-CD16/32 כדי לחסום פוטנציאליים אינטראקציות חלבון לא ספציפית. צלחת בצורת U 96 בארות/צלחת-ריכוז של עונה 1 פרק 10 תאים5 לכל 100 μL.
- הוסף דילולים שונים של נוגדנים הגידול מחייב החל 5 μg - ng/1 5 x 105 תאים. דגירה על הלוחית קרח למשך 15-20 דקות.
הערה: אג נוגדנים הם בודדו אותנו מהמתרחש הסרום של עכברים נקבה בת 20-24 שבועות תמים חלבון א' בעמודות, כפי שמתואר24.
- הוסף דילולים שונים של נוגדנים הגידול מחייב החל 5 μg - ng/1 5 x 105 תאים. דגירה על הלוחית קרח למשך 15-20 דקות.
- רחץ תאים על-ידי הוספת μL 150 ל- PBS צריך שתוציאו את הצלחת בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות.
- למחוק את supernatants וחזור פעמיים בכביסה. להשעות מחדש תאים 100 μL FACS מאגר המכיל נוגדנים משניים fluorophore מצומדת. דגירה צלחת על קרח למשך 20 דקות.
- שטיפת התאים על ידי הוספת μL 200 FACS המאגר צריך שתוציאו את הצלחת rcf 400 במשך 5-10 דקות לבטל את supernatants וחזור לשטוף.
- לנתח את הגידול מחייב ידי cytometry זרימה ולקבוע את ריכוז מינימלי הנדרש את התאים.
הערה: נוגדנים לא להגביר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) של תאים סרטניים מוכתם על ידי לפחות גיאוקרטוגרפיה השליטה isotype אין להשתמש במבחני פונקציונלי עוקבות.
4. הפעלה של MoDC עם הגידול אג IC
- מעיל תאים סרטניים עם ריכוז מינימלי IgG, כפי שמתואר בסעיפים 3.1 דרך 3.4.3
- יום אחד לפני הפעלת MoDC עם גידול IC, להחליף MoDC תרבות המדיה, אשר מכיל את GM-CSF. כדי לעשות זאת, בעדינות תשאף התקשורת ולשטוף את התאים פעם אחת עם מדיה מראש ומחוממת תרבות שלמה.
הערה: מבודד MoDC סרטניים הקשורים בוגר צריך להיות מחונן לפחות 2-3 h (או אפילו לילה) לאחר מיון בתקשורת מלאה ללא GM-CSF, ולפני מפעילה אותם עם IC - עבור ניתוחים ספיגת הגידול, להוסיף את הגידול התווית על-ידי CFSE IC MoDC ביחס של 1:5 (IC:MoDC), תקופת דגירה בין לילה של 12-16 ח ב 1 מ"ל של התקשורת מלאה לכל עונה 1 פרק 106 DC.
- עבור ניתוחים FACS מהניסויים הפעלה MoDC, להוסיף גידול-IC ביחס 1:1 (IC:MoDC), תקופת דגירה בין לילה של 12-16 שעות.
הערה: מומלץ לכלול פקד חיובית, אשר MoDC מומרץ עם 1 μg/mL של LPS או אגוניסטים TLR אחרים. - בעקבות הפעלת לילה, וארוקן את supernatants, שטיפת התאים בעדינות שלוש פעמים עם בידוד המאגר, או 10 מ מ EDTA HBSS.
- כדי לנתק DC מהצלחת, דגירה תאים למשך 2-3 דקות ב- 1 מ"ל HBSS המכיל 10 מ מ EDTA ולנתק תאים על-ידי pipetting נמרצת.
- צנטריפוגה תאים על 400 rcf והשהה מחדש עונה 1 פרק 106 DC ב- PBS μL 90 בתוספת 2% FCS, 5 מ מ EDTA (FACS מאגר) ו- 0.5 μg של חסימת נוגדנים. דגירה על קרח למשך 5-10 דקות.
- להוסיף 10 μL של צביעת תערובת נוגדנים לתאי, דגירה על קרח למשך 15 דקות.
- להוסיף 2 מ"ל FACS מאגר תאים, צנטריפוגה בבית 4 oC 400 rcf למשך 5-10 דקות.
- יום אחד לפני הפעלת MoDC עם גידול IC, להחליף MoDC תרבות המדיה, אשר מכיל את GM-CSF. כדי לעשות זאת, בעדינות תשאף התקשורת ולשטוף את התאים פעם אחת עם מדיה מראש ומחוממת תרבות שלמה.
- להשעות מחדש תאים במאגר FACS 200 μL.
- להוסיף 0.5 - 1 μg/mL של דאפי 1-2 דקות לפני הפעלת הדגימות, כדי לא לכלול תאים מתים מניתוחי. לא יתר דגירה דאפי, כמו MoDC ייקח אותה תוך 10-15 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תחילה השווינו את הקיבולת של נוגדנים של עכברים syngeneic, allogeneic תמים כדי לאגד תאים סרטניים. למטרה זו, B16F10, LMP שורות תאים סרטניים היו קבוע paraformaldehyde, שטף בהרחבה. B16F10 הוא קו תא מלנומה, אשר הופרדה במקור של גרורות ריאה בעכברים C57Bl/6. LMP הוא תא בלבלב הופרדה מרשת KrasG12D /, +, עכברים LSL-Trp53R172H / + ו Pdx-1-Cre, גדל בהתמדה בעכברים 129F1. כדי להשיג IC, תאים סרטניים היו הדגירה במשך 20 דקות על הקרח עם 2 μg של IgG syngeneic או allogeneic לכל עונה 1 פרק 105 תאים סרטניים. אג ו נוגדנים IgM הם בודדו אותנו מהמתרחש מחזור תמים עכברים 20-24-בת שבוע על חלבון A, ואחריה גודל הוצאת גזים כמו שמתואר24. תאים היו אז שטף צבעונית עם עכברוש מצומדת PE העכבר אנטי איג נוגדן משני ו עוצמת פלורסנט רשע נותחו ב cytometer זרימה. כמצוין באיור 1A, נוגדנים IgG של עכברים allogeneic C57Bl/6 מאוגד LMP גידול תאי שמחוץ יעילה הרבה יותר מאשר נוגדנים של עכברים syngeneic 129S1. באופן דומה, כתמים B16F10 קבועה עם 129S1 allogeneic IgG היה tenfold יותר גבוה, לעומת מכתים עם syngeneic IgG של עכברים C57Bl/6 תמים. מעניין, עכברים הנושאת B16 גידולים לא הצליחה לייצר נוגדנים עם קיבולת איגוד דומה לזה של עכברים allogeneic, אפילו במהלך התקדמות הגידול (איור 1B).
אנחנו הבאה ביקשו להשוות IC התגובה של MoDC של דם, גידולים לזה של DC מן הטחול ו מוניטור. כדי לבודד סרטניים הקשורים MoDC, גידולים B16F10 היו enzymatically הפומבית להשיג המתלים תא בודד. תאים חיסוניים היו בצורה קלה בעזרת חרוזים CD45-מגנטי, MoDC היו עוד יותר הממוינת האסהלאו/FSCהלאו/CD11c+/MHCII+/Ly6Cלו על ידי FACS (איור 2 א). ראוי לציין הגידול שונים DC ייתכן סמנים שונים המגדירים אותם. כדי לבודד MoDC ממחזור הדם, ומונוציטים במחזור היו מועשרים CD11b מצומדת beads מגנטי וממוינות נוספות כמו האסהלאו/FSCהלאו/ CD115+/MHCIIמינוס/הלאו. התאים היו אז תרבותי עבור יום אחד ב- GM-CSF, התאים שאינם מחסידי ו באופן רופף חסיד הועברו לתוך צלחת חדשה, בתרבית במשך 4-5 ימים נוספים לקבל MoDC (איור 2B). כנקודת התייחסות שהשתמשנו BMDC, הגשה "תקן הזהב" DC עבור רבים מבחני פונקציונלי, כמו גם MoDC הטחול, אשר משקפים תת-קבוצה DC יותר פיזיולוגית. BMDC התקבלו על-ידי מיון מוניטור של pro-ומונוציטים (CD11b+/Ly6Cשלום/CD115שלום/MHCIIneg), ואחריו שלהם culturing במשך 7 ימים עם GM-CSF, כפי שמתואר24. MoDC הטחול הם בודדו אותנו מהמתרחש התליה תא בודד, התקבלו ע י רסוק הטחול דרך מסננת תא (דגירה מראש עם collagenase אינה נחוצה עבור MoDC הטחול), ואחריו העשרה עם CD11b מצומדת beads מגנטי. התאים היו אז הממוינת האסהלאו/B220neg/NKp46neg/CD3מינוס/Gr1מינוס/F4/80neg/MHCIIשלום/CD11cשלום ותרבותית למשך שעה ב RPMI מלאה ב 37oC כדי לשחזר פעילות בסיסית.
כדי לחקור את ההשפעה של IC אג על פעילות MoDC, אנחנו מודגרות תת-קבוצות DC מבודד בין לילה עם תאים סרטניים קבוע או עם תאים סרטניים קבוע מראש מצופה עם allogeneic IgG. הפעלה של BMDC או DC הטחול עם IC הביא בביטוי מוגבר CD86 ו- MHCII, בניגוד MoDC, או MoDC סרטניים הקשורים (איור 3 א). יכולת ספיגת שהוכתמו CFSE נגזר הגידול חלבונים, עם או בלי allogeneic IgG, נמשל גם. כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, DC הטחול הראה יכולת מעולה כדי להפנים את החלבונים נגזר הגידול (איור 3B).
יחדיו, תוצאות אלה מראים כי הגידול DC ו- MoDC להגיב באופן שונה מאשר הטחול DC ו- BMDC להפעלה עם alloIgG-IC. לכן, אסטרטגיות חיסון זה מאחלים להפעיל את הגידול ש-DC לא יכול להתבסס אך ורק על דפוסי ההפעלה של BMDC.
איור 1: עכברים Allogeneic יש נוגדנים IgG מחייב גידול טבעי במחזור שלהם: א אומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית (MFI) של תאים סרטניים LMP צבעונית עם נוגדנים IgG מבודד מהדם של syngeneic (129S1) ועכברים תמים allogeneic (C57Bl/6). ב' אומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית (MFI) של תאים סרטניים B16F10 מודגרות עם נוגדנים IgG מבודד את זרימת הדם נושאות syngeneic עכברים (C57Bl/6), או עכברים תמים allogeneic (129S1). דמות זו שונתה מן הנתונים המורחבים 2A ו- 2B Y כרמי ואח. הטבע 7550:99 521-104, 201524.
איור 2: מיון הערכה של העכבר MoDC דם, גידולים B16. א בידוד, ערכת המיון של MoDC תרבותי של העכבר ומונוציטים. מיקרוסקופיה קונפוקלית DIC תמונה של דלקתיות, המסיירים ומונוציטים לאחר 4 ימים בתרבות (x400). B. בידוד, מיון בסכמה סרטניים הקשורים MoDC מ B16 גידולים. נציג מיקרוסקופיה קונפוקלית DIC תמונה של MoDC מבודד B16 גידולים לאחר לילה תרבות (x400). איור זה השתנה מ משלים איור 1 Y כרמי ואח JCI תובנה 1:18:e89020, 201625. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: MoDC מן הטחול, מוניטור להציג דפוסים שונים של הפעלת מאשר הגידול, דם MoDC לאחר דגירה עם IC. א ניתוח תזרים cytometric של הביטוי MHCII ו- CD86 על ידי DC הדגירה למשך הלילה עם הגידול-אג IC. B. אימונוהיסטוכימיה קונאפוקלית של ספיגת הגידול (ירוק), ביטוי MHCII (אדום) על ידי DC הדגירה למשך הלילה עם התווית על-ידי CFSE הגידול IC. דמות זו שונתה מן הדמויות 3A ו- 3DCarmi Y. et al. Akt SHP-1 מחסומים פנימיים-DC עבור חסינות הגידול בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. תובנה JCI 1:18:e89020, 201625. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נתון מספר גדול של DC נדרש חיסון עכברים (כ 2-4 x 106 DC לכל עכבר אחד), רוב החיסון אסטרטגיות בעכברים מבוססים על בידוד של DC מ BM וה טחול ואחריו הפעלה שלהם ex-vivo . עם זאת, מנסה להפעיל את הגידול DC ויוו, משתמש באותם התנאים להפעלת הטחול ו- DC מוניטור, לעיתים קרובות לא הצליחו לייצר חסינות יעיל. בפרסומים הבאים שני, כרמי ואח. מצאו כי דם, גידול MoDC נבדלים באופן משמעותי הטחול ו- DC מוניטור, בהתחשב בכך שהם נושאים רמות גבוהות באופן טבעי מהותי של טירוזין phosphatase ודורשים לקרקע לפני הפעלת IC24,25. יתר על כן, עומס נוסף אלה תוצאות הצורך לנקוט משנה זהירות על מנת לשמור על DC הפעלה במצב טוב יותר משקף את מצב פיזיולוגי שלהם. לכן, בפרוטוקול הנוכחי מבקש לספק תיאור מפורט של תהליך בידוד MoDC של גידולים, מחזור הדם, וכדי להדגיש את הצעדים שעלולים לגרום שלהם הפעלה מוקדמת.
ראשית, על מנת לקבל מספר מספיק של DC של דם, גידולים, יש צורך מספר גדול יותר של עכברים לעומת זו של פרוטוקולים עבור בידוד BMDC. כדי להגדיל את התשואה של ה-DC נשתמש בן 16 בשבוע עכברים, הכוללים אחסון גדולים יותר דם וסופרת תא הכללית. באופן שגרתי נקבל 5-8 x 104 MoDC לכל 1 מ"ל של דם ללא הזרקה של GM-CSF, ל 4-5 x 105 MoDC בעקבות הזרקת. הגידול DC, אנו משיגים כ 6-8 x 104 MoDC מגידול3 100 מ מ, למרות המספר עשוי להשתנות בין עכברים בודדים ובין הגידול מודלים. הגדלת גודל הגידול בתוצאות תשואה DC נמוך יותר, כמו גידול3 מ מ 1,000 יהיו רק כ 5,000 DC. במקום זאת, נזריק עכברים עם תאים סרטניים באתרים מרובים (בדרך כלל 4-6), וכך להשיג עד 4 x 105 MoDC לכל העכבר.
יתר על כן, אנו ממליצים כי לפני שימוש ניסיוני, נוגדנים, שורות תאים שלהם, צינורות, ריאגנטים המעבדה הכללי צריך להיבדק על endotoxins על ידי LAL assay, ועל ידי ציפוי בתקשורת על אגר חיידקי AC. שורות תאים סרטניים לעתים קרובות נגוע Mycoplasma , כדאי לכן להיבדק על-ידי ה-PCR לפני הדגירה שלהם עם DC. השימוש ההכנות collagenase גולמי, כמו סוגים 1 ו- 4, הוא המקור העיקרי של endotoxins עקב בידוד של collagenases מן Clostridium histolyticum. ההכנות סטנדרטית של collagenase עשויים להכיל האיחוד האירופי ככל 10/מ"ג של endotoxins, שזה בערך 1-2 ng של אנדוטוקסין לכל מ"ל של תערובת לעיכול. . Jahr et al. מצאו כי ההכנות collagenase המכיל 2.7-6.7 ng/mL של endotoxins יניעו 1,415-3,967 ng/mL של IL-1β בעקבות התרבות עם PBMC29. אכן, לקרקע של DC מתבצע באופן שגרתי עם 1 ng של LPS לכל מדיה mL, עדיין מעט ככל 100 picograms/mL מספיקה לשפר אותם30,31,32. מקור פוטנציאלי נוסף של endotoxins הוא FBS, אשר עשוי להכיל האיחוד האירופי 25/mL או יותר של endotoxins, או האיחוד האירופי פחות מ- 10/mL. בהנחה כי התקשורת תרבות מכיל 10% FBS, עומס אנדוטוקסין יכול להגיע 0.5 ng/mL, וזה מספיק כדי פריים DC.
בנוסף, פרוטוקולים רבים להשתמש נוגדנים anti-CD16/32 כדי לחסום קולטנים Fc, כאמצעי להגברת יחודיות של החלונית נוגדן שלהם לפני מיון. למרות זאת, cross-linking של FcγRIII (CD16) מוביל זירחון של Syk/זאפ-70 ו PLC-γ, שחרורו של Ca תאיים2 + 33, זרחון של P38, ERK1/2 ב שני האדם34 ו העכבר ומונוציטים35. בידיים שלנו, תוספת של אנטי-CD16/32 לתרבויות MoDC גורם באופן עקבי של זרחון חזקה של kinases P38 ו ERK1/2 בוושינגטון בתוך דקה אחת של חשיפה. אנו, לכן, ממליצים הימנעות השימוש של אנטי-CD16/32 כאשר בידוד MoDC עבור במבחנה מבחני פונקציונלי.
פרוטוקול משותף אחר משתמש העשרה של DC מאת beads מגנטי CD11c לפני שלהם מיון לפי FACS. CD11c הוא סוג אני transmembrane גליקופרוטאין מזהה מגוון של ליגנדים, כולל פיברינוגן, תקליטונים, מסוג קולגן, את יחידת משנה C3b מוחלש. רצוניקו. et al. הראו כי מצדו של CD11c עם נוגדנים גורם חזק NFκB ההפעלה ואת הפרשת נוגדנים36. מניסיוננו, נוגדנים נגד קיבוע-CD11c לגרום לתא ההפעלה של אפופטוזיס, בזמן השימוש צורתם מסיסים במיון FACS לא לגרום זירחון של P38 או ERK1/2.
בסך הכל, פרוטוקול זה תוכנן כדי להשיג בידוד של MoDC עם הפעלה קטנה ככל האפשר, כך ההפעלה הבאים שלהם חוץ גופית בתוך משקף את התנאים הנדרשים לקיום שלהם הפעלה ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים שיש להם אין ניגוד אינטרסים ויש להם כלום לחשוף.
Acknowledgments
אף אחד
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J.
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G.
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E.
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
