Summary
Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.
Abstract
Dendritische cellen (DC) zijn heterogene cel populaties die in hun markeringen van de celmembraan, migratiepatronen en distributie, en in hun antigeen presentatie en T-cel activatie capaciteiten verschillen. Aangezien de meeste vaccinaties van experimentele tumor modellen miljoenen DC vereisen, zijn ze wijd geïsoleerd uit het beenmerg of milt. Deze DC verschillen echter aanzienlijk van bloed en tumor DC in hun reacties immuuncomplexen (IC), en vermoedelijk aan andere lectine unnethes-coupled receptoren. Nog belangrijker is, gezien de gevoeligheid van DC naar gevaar-geassocieerde moleculen, de aanwezigheid van endotoxines of antilichamen die dwarslijn activering receptoren in één van de isoleren stappen kan resulteren in de priming voor DC en dus invloed op de parameters, of ten minste de dosering, nodig om ze te activeren. Daarom beschrijven hier we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van MoDC uit bloed en tumoren terwijl het vermijden van hun voortijdige activering. Daarnaast vindt u een protocol voor MoDC activering met tumor IC en hun latere analyses.
Introduction
Dendritische cellen (DC) hebben sinds hun ontdekking, een focus van uitgebreid onderzoek vanwege hun unieke vermogen om T cel differentiatie1scheef. In de afgelopen decennia, heeft een uitgebreide onderzoeksinspanning willen definiëren van de diverse subsets van de DC en hun functie tijdens de progressie van de tumor en immuniteit 2. DCs bestaan uit heterogene cel populaties die van elkaar in hun patroonherkenning receptoren, weefsel distributie verschillen, en trekvogels en antigeen presentatie mogelijkheden3,4,5. In vergelijking met de andere DC deelverzamelingen, monocyt-afgeleide DC (MoDC) zijn veel meer overvloedig in tumoren en kan gemakkelijk worden gegenereerd vanuit het circulerende of tumor-infiltreren monocyten6,,7. Dus, veel klinische proeven die willen profiteren van hun relatieve prevalentie zijn gebaseerd op de in vivo en ex vivo manipulatie van autologe MoDC om te ontlokken van T-cel-immuniteit 8,9.
Evenzo, DC-gebaseerde vaccinatie van het experimentele tumor modellen vereist 2-3 seriële injecties, 5-7 dagen uit elkaar, voor 1-2 x 106 geactiveerde DC met tumor-antigenen gepulseerde. Daarom, om te bereiken deze groot aantal DC, meeste muis studies hebben voornamelijk gebruikt MoDC gekweekt uit het beenmerg (BM) precursoren in GM-CSF voor 7-9 dagen (IL-4 niet nodig is in de muisinstelling van de)10,11. Echter heeft gezien dat GM-CSF knock-out muizen hebben over het algemeen normale DC compartiment- 12,13, en gezien de gemengde bevolking verkregen uit die cultuur,14 de fysiologische relevantie van deze DC in twijfel getrokken.
DC kan als alternatief worden routinematig geïsoleerd uit cellen van de milt. Echter, DC omvatten slechts ongeveer 0.3-0.8% van totale milt cellen (wat resulteert in ongeveer 7 x 105 DC/milt), en deze cellen, alleen CD103+ DC en MoDC kunt migreren naar de lymfoïde organen. Aangezien MoDCs ongeveer 10-15% van de milt DC populaties15,16 omvatten, rendement meeste protocollen van de isolatie ongeveer 1 x 105 MoDC per milt. Uitbreiding van MoDC kan worden bereikt door het injecteren van transfected cellen B16 die afscheiden van GM-CSF, wat resulteert in een toename van de milt MoDC17100-fold. Het gebruik van MoDC voor het ontwikkelen van DC vaccins is echter beperkt omdat deze procedure niet kan worden gedaan in de mens en de verkregen MoDC zijn al sterk geactiveerd.
Naast het verkrijgen van voldoende aantallen DC, betekent een andere uitdaging voor de ontwikkeling van effectieve DC vaccins tegen autologe kankercellen het ontbreken van voldoende gevaar signalen in de omgeving van de tumor volledig activeren DC. Inductie van co-stimulatory signalen wordt meestal bereikt door activering van patroonherkenning receptoren (PRR), of c-type lectine signalering trajecten18,19,20,21. Een verdere aanpak voor het activeren van DC exploiteert hun vermogen tot het nemen van antigenen door middel van interacties met oppervlakte Fcγ receptoren (FcγR). Inderdaad, een aantal belangrijke manuscripten hebben aangetoond dat injectie van MoDC van BM precursors geactiveerd met tumor-IgG IC tumorgroei in profylactische instellingen kunnen voorkomen, en kan leiden tot de uitroeiing van gevestigde tumoren22,23 .
In twee recente artikels ontdekte Carmi et al. dat in tegenstelling tot BMDC en milt DC, MoDC van het bloed en de tumoren kan niet op IgG IC zonder extra prikkels reageren. Dit bleek te zijn door de aanwezigheid van hoge intracellulaire niveaus van tyrosine fosfatases FcγR signalering van24,25te reguleren. Door het definiëren van een kritisch controlepunt in DC, verstrekt dit werk een belangrijk inzicht verschaffen in de vereisten voor succesvolle DC-gebaseerde vaccinatie. De eis van aanvullende stimuli om FcγR signalering en vermoedelijk signalering van andere lectine receptoren met gebruikmaking van een soortgelijk fosforylatie cascade, aldus onderstreept de noodzaak voor het vermijden van de priming voor DC tijdens hun isolement.
Daarom dit protocol beschrijft de isolatie van de MoDC uit het bloed en tumoren, die aanzienlijk van BM en milt DC afwijken, en hoogtepunten van voorzorgsmaatregelen tijdens het overwegen waard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protocollen hieronder verwijzen naar het isolement van de muis MoDC, maar de algemene beginselen kunnen toepassen op andere DC deelverzamelingen cellen, ook. 12 - 16-week-oude C57Bl/6j muizen werden onderhouden in een Amerikaanse Vereniging voor de accreditatie van Laboratory Animal Care-geaccrediteerd dier faciliteit. Alle protocollen werden goedgekeurd door Stanford University en Tel-Aviv University institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. isolatie van Tumor verbonden monocyt-afgeleide DC
- In een laminaire flow-kap, tumoren uit CO2 euthanized muizen verwijderen en plaatsen van tumoren in RPMI medium zonder foetale runderserum (FBS).
Opmerking: Het is sterk aanbevolen om de muizen te scheren en spuiten ze met 70% ethanol voordat u verwijdert de tumoren, om te minimaliseren van potentiële verontreinigingen uit de vacht. Er zeker van zijn dat de tumor niet hoger is dan 25-40 mm2 aangezien grotere tumoren minder DC die zijn vaak kwetsbaar en gevoelig hebben voor het ondergaan van de celdood. Als grotere aantallen DC nodig zijn, kan elke muis met tumoren cellen op meerdere locaties worden geïnjecteerd. - Onder een steriele laminaire motorkap, hak de tumoren met behulp van chirurgie schaar in kleine stukjes (ongeveer 1 x 1 mm2).
- Voeg alle tumor fragmenten uit een muis in een 30 mL steriele flat-onderkant buis met magnetische roer bars, waarin 5 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV en 0,01 mg/mL DNase ik.
Let op: Myeloïde cellen produceren energie door middel van glycosylatie, zelfs onder de steady-state. Daarom enige gebruik media die glucose (bijvoorbeeld HBSS, RPMI en DMEM), als glucose honger voor zo weinig als 10-15 min bevat zal leiden tot celdood en apoptosis binnen 24 h. gebruik alleen een lage endotoxine collagenase IV, als collagenase wordt geproduceerd door gram-positieve bacteriën (Clostridium histolyticum).
- Voeg alle tumor fragmenten uit een muis in een 30 mL steriele flat-onderkant buis met magnetische roer bars, waarin 5 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV en 0,01 mg/mL DNase ik.
- Roer bij ongeveer 200-400 t/min in een incubator 37 oC met een magneetroerder voor 20-30 min.
- Voeg 5 mL van de volledige media en resuspendeer krachtig.
- Het filteren van cellen door een zeef van de cel 70-µm. Centrifugeer bij 4 oC 400 rcf voor 5-10 min naar de pellet van de cellen.
Let op: Probeer niet te isoleren van de cellen direct na enzymatische spijsvertering, zoals sommige tumoren necrotische zijn en relatief grote hoeveelheden puin van de cel of de extracellulaire matrix bevatten. Cellen op 15% dichtheid kleurovergang middellange tot het verkrijgen van alleen de cellen toepassen. - Schorten 9 mL van de kleurovergang medium dichtheid met 1 mL 10 x PBS osmolaliteit aanpassen en 100% Percoll stamoplossing te verkrijgen. Mix-1.5 mL dichtheid kleurovergang medium stockoplossing met 8,5 mL HBSS en krachtig mengen met tumor afkomstige cel pellet. Zachtjes laag 2 mL DMEM op de bovenkant van 15% dichtheid kleurovergang medium en centrifuge op 400 rcf gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant, zoals de cellen een pellet aan de onderkant van de buis vormen.
- Wassen de Ingehuld cellen tweemaal door schorsing van hen opnieuw in 10 mL HBSS met 2% FBS, 1% penicilline/streptomycine, en 10 mM EDTA (isolatie Buffer) en centrifuge op 4 oC 400 rcf gedurende 5-10 minuten om de pellet van de cellen.
- Cellen tellen op een hemocytometer met behulp van trypan blauwe onder een lichte Microscoop.
- Resuspendeer 1 x 108 cellen in 1 mL isolatie buffer en hen uit te broeden op 4 oC met 30 μL van CD11b+ geconjugeerd magnetische kralen gedurende 15 minuten.
Let op: Vermijd het gebruik van CD11c-geconjugeerde kralen, zoals dit zal de DC activeren en celdood te veroorzaken. Probeer niet te blokkeren van FcγRII en FcγRIII met anti-CD16/32 antilichamen. Blokkeren van antilichamen afbinden van FcγR en sterke fosforylatie van kaart kinases induceren en prime de DC.- Verwijderen van de overtollige niet-afhankelijke kralen door toevoeging van 9 mL van isolatie buffer en centrifuge cellen aan 400 rcf voor 5-10 min bij 4oC.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL isolatie buffer. De cellen op een voorwas magnetische kolom toepassen. Was de kolom tweemaal met 3 mL isolatie buffer.
- Verwijder de kolom uit de magneet. Pipetteer 6 mL isolatie buffer op de kolom en de magnetisch-geëtiketteerden cellen in een steriele collectie buis spoelen door het indrukken van de zuiger. Centrifuge cellen op 400 rcf voor 5-10 min bij 4 oC.
- Resuspendeer de cellen bij 100 μl per 1 x 107 cellen en vlekken met de volgende fluorophore-geconjugeerde antilichamen: Linage negatieve (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI en Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
- Soort cellen door de kleine cellen, met behulp van kant gating verstrooien (SSC) en scatter (FSC) en cultuur in volledige medium aangevuld met 5 ng/mL GM-CSF toekomen. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 3 7 oC zodat macrofagen te houden van de plaat. Breng het losjes en niet-aanhanger cellen naar een nieuwe cultuur schotel.
Opmerking: Muis MoDC worden gedefinieerd als CD11b+/CD11c+/MHCIIHallo/Ly6Clo/int 7,26,27. Uitdrukking van Ly6C kan sterk variëren tussen tumor modellen, en in sommige modellen (bijvoorbeeld LMP) MoDCs volledig gebrek aan Ly6C expressie. Globaal, een 100 mm3 B16F10 tumor meestal 5 x 10,4 van DC bevat, wat resulteert in ongeveer 4-5 x 106 totaal aantal cellen. Van deze cellen, 10-15% immuuncellen en 8-10% MoDC. Verhoging van de DC-getallen kan worden bereikt door het injecteren van muizen met tumoren op meerdere locaties. Soort slechts kleine WS/FCS cellen, als andere myeloïde cellen kunnen uitdrukken markeringen zoals CD11c en Ly6C.
Optioneel: Sorteren de tumor-infiltreren monocyt als kleine WS/FSC-cellen die express Ly6CHallo en negatief voor de MHCII. Daarna cultuur monocyten in vitro met 50 ng/mL GM-CSF DC verkrijgen.
2. isolatie van monocyt-afgeleide DC uit perifeer bloed
Opmerking: Omdat de volwassen MoDCs zijn relatief zeldzaam in muis bloed, het protocol hieronder verwijst naar hun afleiding in vitro van gesorteerde monocyten.
- Het vergroten van het aantal monocyten in het bloed, anesthetize van muizen met 4% Isofluraan en injecteert ze subcutaan (SC) met 1 μg van GM-CSF in 50 μl PBS.
- Na 1-2 h, offeren muizen met behulp van CO2.
Let op: Offeren geen muizen door cervicale dislocatie, omdat dit leiden interne bloeden tot zal. - Onmiddellijk na de euthanization, de muis spray met 70% ethanol en verwijder de huid dat betrekking heeft op het hart met behulp van chirurgische scharen, onder de motorkap van een steriele laminaire flow. De schaar met ethanol schoon en snijd het recht atrium van het hart. Langzaam, spoel het hart via de rechterventrikel met 20 mM EDTA HBSS met behulp van een 10 mL spuit en 25-G naald.
- Verzamelen van het bloed met een steriele injectiespuit uit de pleurale holte in een steriele buis met heparan sulfaat en EDTA. Blijven spoelen van het hart tot de lever en longen worden roze of wit.
- Toepassing bloed op een dichtheid verlopende mediumand centrifuge op 400 rcf bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met lage rem.
Let op: Gebruik endotoxine-vrije dichtheid kleurovergang medium (gewoonlijk minder dan 0,12 EU per mL).- Mononucleaire cellen in een nieuwe buis verzamelen. Het wassen van de cellen door schorsing opnieuw in 10 mL HBSS met 2% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 10 mM EDTA (isolatie buffer) en vervolgens centrifugeren bij 4 oC 400 rcf voor 5-10 min naar de cellen pellet.
Let op: Gebruik alleen de media waarin ten minste 1 g/L van glucose.
- Mononucleaire cellen in een nieuwe buis verzamelen. Het wassen van de cellen door schorsing opnieuw in 10 mL HBSS met 2% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 10 mM EDTA (isolatie buffer) en vervolgens centrifugeren bij 4 oC 400 rcf voor 5-10 min naar de cellen pellet.
- Voor CD11b positieve selectie, resuspendeer 1 x 108 cellen in 1 mL isolatie buffer en broeden ze gedurende 15 minuten met 50 μl van CD11b-geconjugeerde magnetische kralen bij 4 oC.
- Wassen van overtollige kralen door toevoeging van 9 mL isolatie buffer en centrifugeren op 400 rcf voor 5-10 min bij 4 oC. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL isolatie buffer. Breng de cellen op een voorwas magnetische kolom volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder de kolom uit de magneet, Pipetteer 6 mL isolatie buffer op de kolom en de magnetisch-geëtiketteerden cellen in een steriele collectie buis spoelen door het indrukken van de zuiger. Centrifugeer cellen op 400 rcf voor 5-10 min bij 4 oC. Wash de kolom tweemaal met 3 mL isolatie buffer.
- Resuspendeer de cellen op 1 x 107 cellen/100 μl isolatie buffer en vlek met de volgende fluorophore-geconjugeerde antilichamen: 0.1 μg CD115, 0,25 μg MHCII en 0.1 μg Ly-6 C/1 x 106 cellen.
- Sorteren op cellen gating op kleine kant scatter (SSC) en kleine vooruit scatter (FSC) cellen.
Opmerking: Muis inflammatoire monocyten zijn over het algemeen gedefinieerd als CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CHalloen patrouilleren monocyten zijn gedefinieerd als CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4,5. In gevallen waar geen scheiding tussen de twee subsets nodig is, de totaal SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo cellen kunnen worden gesorteerd. Zowel naïef en tumor-dragende muizen bevatten ongeveer 5-8 x 104 MoDC per 1 mL bloed en t/m 4-5 x 105 MoDC volgende injectie van GM-CSF. Van hen, ongeveer 70% zijn inflammatoire monocyten en 30% patrouilleren in monocyten. - Plaat van de cellen bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL in een volledige media aangevuld met 20 ng/mL GM-CSF. Na 1 dag, overdracht van de niet-aanhanger en losjes Adherente cellen een nieuwe plaat en cultuur voor extra 4-5 dagen.
Let op: DC media moet niet worden aangevuld met pyruvaat.
3. bereiding van Tumor-IgG immuuncomplexen
- Cultuur tumorcellen in de kolf van de cultuur van 75 cm2 tot 70% samenkomst in volledige DMEM media.
- Voeg toe 2 mL 0,25% trypsine/EDTA loskoppelen van de cellen van de morfologie van de cultuur kolf en monitor de cel onder een lichte Microscoop te vermijden van overmatige trypsinebehandeling.
- Voeg 8 mL volledige voedingsbodems (per 2 mL trypsine) remming van de spijsvertering van de trypsine en centrifugeer bij 4 oC, 400 rcf voor 5-10 min naar de pellet van de cellen.
Opmerking: Zorg ervoor om tumorcellen voor Mycoplasma met behulp van een commerciële PCR-kit. Test op de aanwezigheid van gram-negatieve bacteriën en schimmel endotoxines met Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay28). Serum moet worden gefilterd via 0,22 μM en getest voor de 9 Code of Federal Regulations virussen. Bovendien, het testen van de voedingsbodems en serums met het schrappen van de 100-200 μl op LB agar of bouillon, en cultuur voor 2 dagen bij 37 oC. - Wash cellen opnieuw uit trypsine en serum resten door schorsing van hen opnieuw in 10 mL PBS en centrifugeer bij 400 rcf gedurende 5-10 min. gecombineerd supernatant en herhaal het wassen 2 meer tijden.
- Fix cellen in 1,8% gebufferd paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Het wassen van de cellen door schorsing van hen opnieuw in 10 mL PBS en centrifuge op 4 oC 400 rcf voor 5-10 min.
- Aspirate supernatant en herhaal wassen nog tweemaal.
Optioneel: Voor tumor opname testen, cellen kunnen worden gelabeld door broeden ze gedurende 5 minuten bij 37 oC in PBS met 1 μM-carboxyfluorescein-succinimidyl ester (CFSE). CFSE is dan uitgeblust met volledige media voor 10 min in ijs. De cellen moeten uitvoerig worden gewassen in PBS met 2% serum te verwijderen van de resterende kleurstof.
- Resuspendeer de cellen in FACS buffer (PBS aangevuld met 2% FCS + 5 mM EDTA) en 0,5 μg/mL anti-CD16/32 om potentiële aspecifieke eiwit-eiwitinteractie te blokkeren. Plaat in een U-vormige 96-wells/bord bij een concentratie van 1 x 105 cellen per 100 μl.
- Verschillende verdunningen van tumor-bindende antilichamen variërend van 5 μg - 5 ng/1 x 105 cellen toevoegen. Laat de plaat op het ijs gedurende 15-20 min. inwerken.
Opmerking: IgG antilichamen werden geïsoleerd uit het serum van naïeve 20-24 weken oude vrouwelijke muizen op EiwitA kolommen, als beschreven24.
- Verschillende verdunningen van tumor-bindende antilichamen variërend van 5 μg - 5 ng/1 x 105 cellen toevoegen. Laat de plaat op het ijs gedurende 15-20 min. inwerken.
- Wassen cellen door toevoeging van 150 μl van PBS en centrifugeren van de plaat duikt met 4 oC 400 rcf voor 5-10 min.
- Gooi het supernatant en herhaal de wash tweemaal. Resuspendeer de cellen in 100 μl FACS buffer met fluorophore-geconjugeerde secundair antilichaam. Incubeer plaat op het ijs gedurende 20 minuten.
- Cellen door het toevoegen van 200 μL van FACS buffer wassen en centrifugeren van de plaat op 400 rcf voor 5-10 min. negeren het supernatant en herhaal wassen.
- Tumor bindende door stroom cytometry analyseren en bepalen van de minimale concentratie vereist jas van de cellen.
Opmerking: Antilichamen die geen verhoging van fluorescentie gemiddelde intensiteit (MFI's) van gebeitst tumorcellen door minstens het vijfvoudige isotype controle moeten niet worden gebruikt in latere functionele testen.
4. de activering van MoDC met Tumor-IgG IC
- Jas van tumorcellen met minimale IgG-concentratie, zoals beschreven in paragrafen 3.1 via 3.4.3
- Één dag voor het activeren van MoDC met tumor IC, vervangen MoDC cultuurmedia, waarin GM-CSF. Om dit te doen, zachtjes gecombineerd van de media en de cellen een keer met voorverwarmde volledige voedingsbodems wassen.
Opmerking: Geïsoleerde volwassen tumor-geassocieerde MoDC moet worden gekweekt voor ten minste 2-3 uur (of zelfs 's nachts) na sortering in volledige media zonder GM-CSF, en voordat je ze activeert met IC. - Voor tumor opname analyses, de CFSE-geëtiketteerden tumor IC toevoegen aan MoDC in een verhouding van 1:5 (IC:MoDC) en na een nacht bebroeden voor 12-16 h in 1 mL van de volledige media per 1 x 106 DC.
- Voor FACS analyses van MoDC activering experimenten, tumor-IC toevoegen op de verhouding van 1:1 (IC:MoDC) en na een nacht bebroeden voor 12-16 h.
Opmerking: Het is sterk aanbevolen om het opnemen van een positieve controle goed, in welke MoDC worden gestimuleerd met 1 μg/mL LPS of andere TLR-agonisten. - Na overnachting activering, gecombineerd het supernatant en wassen cellen zachtjes driemaal met isolatie buffer, of 10 mM EDTA HBSS.
- Incubeer de cellen gedurende 2-3 minuten in 1 mL HBSS met 10 mM EDTA als wilt loskoppelen DC van de plaat, en cellen door krachtig pipetteren loskoppelen.
- Centrifugeer cellen op 400 rcf en resuspendeer 1 x 106 DC in 90 μL PBS aangevuld met 2% FCS, 5 mM EDTA (FACS buffer) en 0.5 μg van het blokkeren van antilichamen. Incubeer op ijs voor 5-10 min.
- Voeg 10 μL van kleuring van antilichamen mengsel aan de cellen en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
- Voeg toe 2 mL FACS buffer aan cellen en centrifuge op 4 oC 400 rcf voor 5-10 min.
- Één dag voor het activeren van MoDC met tumor IC, vervangen MoDC cultuurmedia, waarin GM-CSF. Om dit te doen, zachtjes gecombineerd van de media en de cellen een keer met voorverwarmde volledige voedingsbodems wassen.
- Resuspendeer de cellen in 200 μl FACS buffer.
- Toevoegen van 0,5 - 1 μg/mL DAPI 1-2 min voordat de monsters, als u wilt uitsluiten van dode cellen uit analyses worden uitgevoerd. Niet overdreven Incubeer DAPI, zoals MoDC het binnen 10-15 min innemen zal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In eerste instantie vergeleken we de capaciteit van antilichamen van naïeve syngeneic en allogene muizen aan tumorcellen te binden. Te dien einde, waren B16F10 en LMP cellijnen van de tumor vastgesteld in paraformaldehyde en gewassen uitgebreid. B16F10 is een melanoom cellijn, die werd oorspronkelijk geïsoleerd uit Long metastasen in C57Bl/6 muizen. LMP is een tumor van de alvleesklier cel die werd geïsoleerd uit KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + en Pdx-1-Cre muizen, en groeit gestaag in 129F1 muizen. Voor het verkrijgen van IC, waren tumorcellen gedurende 20 min op ijs met 2 μg van syngeneic of allogene IgG per 1 x 105 tumorcellen geïncubeerd. IgG en IgM antilichamen werden geïsoleerd uit de omloop genomen van naïeve 20-24-week-oude muizen op EiwitA, gevolgd door grootte-uitsluiting chromatografie als beschreven24. Cellen werden vervolgens gewassen en gekleurd met PE-geconjugeerde rat anti-muis IgG secundair antilichaam, en de gemiddelde TL intensiteit werd geanalyseerd in een flow-cytometer. Zoals aangegeven in figuur 1A, IgG antilichamen van C57Bl/6 allogene muizen gebonden LMP tumor cellen ex vivo veel effectiever dan antilichamen van 129S1 syngeneic muizen. Evenzo was kleuring van vaste B16F10 met 129S1 allogene IgG meer dan vertienvoudigd hoger, vergeleken met kleuring met syngeneic IgG van naïeve C57Bl/6 muizen. Muizen die B16 tumoren niet interessant, om antilichamen te produceren met de soortgelijke bindingscapaciteit met die van allogene muizen, zelfs tijdens de progressie van de tumor (figuur 1B).
Wij willen volgende vergelijken de reactie van de IC van MoDC uit bloed en tumoren op die van DC van de milt en BM. Isoleren van tumor-geassocieerde MoDC, werden B16F10 tumoren enzymatisch losgekoppeld om te verkrijgen van eencellige schorsingen. Immune cellen werden verrijkt met behulp van CD45-magnetische kralen en MoDC werden verder gesorteerd als SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Clo door FACS (figuur 2A). Het is opmerkelijk dat verschillende tumor DC wellicht verschillende markeringen die definieert. Isoleren MoDC uit het bloed, circulerende monocyten werden verrijkt door CD11b-geconjugeerde magnetische kralen en verdere gesorteerd als SSClo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. Cellen werden vervolgens gekweekt voor 1 dag in GM-CSF, en de niet-aanhanger en losjes Adherente cellen werden overgebracht naar een nieuwe plaat en gekweekte voor extra 4-5 dagen te verkrijgen MoDC (figuur 2B). Als een referentiepunt gebruikten we BMDC, dienen als de "gouden standaard" DC voor vele functionele testen, evenals milt MoDC, die een meer fysiologische DC subset weerspiegelen. BMDC werden verkregen door het sorteren van de BM pro-monocyten (CD11b+/Ly6CHallo/CD115Hallo/MHCIIneg), gevolgd door hun kweken voor 7 dagen met GM-CSF, als beschreven24. Milt MoDC werden geïsoleerd uit de eencellige suspensie, verkregen door het stampen van de milt door een cel zeef (pre-incubatie met collagenase is niet vereist voor milt MoDC), gevolgd door de verrijking met CD11b-geconjugeerde magnetische kralen. Cellen werden vervolgens gesorteerd als SSClo/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCIIHallo/CD11cHallo en gekweekte gedurende 1 uur in volledige RPMI bij 37oC naar basislijn activiteit te herstellen.
Om te onderzoeken van het effect van IgG IC op MoDC activiteit, geïncubeerd we de geïsoleerde subsets van de DC's nachts met vaste tumorcellen of met vaste tumorcellen vooraf bedekt met allogene IgG. Activering van BMDC of milt DC met IC resulteerde in verhoogde expressie van CD86 en MHCII, in tegenstelling tot MoDC, of tumor-geassocieerde MoDC (figuur 3A). De mogelijkheid om opname CFSE gebeitste tumor afkomstige eiwitten, met of zonder allogene IgG, werd ook vergeleken. Zoals opgemerkt door confocale microscopie, milt DC bleek superieur vermogen om het internaliseren van de tumor afkomstige eiwitten (figuur 3B).
Samen genomen, suggereren deze resultaten dat de tumor DC en MoDC anders dan de milt DC en BMDC op activering met alloIgG-IC reageren. Daarom vaccinatiestrategieën die wil activeren, tumor die DC kan niet alleen op de patronen van de activering van BMDC berusten.
Figuur 1: allogene muizen hebben natuurlijk voorkomende tumor-bindende IgG antilichamen in hun omloop: A. gemiddelde intensiteit van de fluorescentie (MFI's) van LMP tumorcellen gekleurd met IgG antilichamen geïsoleerd uit het bloed van syngeneic (129S1) en allogene (C57Bl/6) naïef muizen. B. gemiddelde intensiteit van de fluorescentie (MFI's) van B16F10 tumorcellen geïncubeerd met IgG antilichamen geïsoleerd uit de omloop genomen of syngeneic tumor-dragende muizen (C57Bl/6), allogene (129S1) naïef muizen. Dit cijfer is gewijzigd van uitgebreide gegevens 2A en 2B Carmi Y et al. Natuur 521 7550:99-104, 201524.
Figuur 2: schema van de muis MoDC uit bloed en B16 tumoren sorteren. A. isolatie en sorteren regeling van MoDC gekweekt uit monocyten van de muis. Confocale microscopie DIC afbeelding van inflammatoire en patrouillering monocyten na 4 dagen in cultuur (x400). B. isolatie en sorteren regeling van tumor-geassocieerde MoDC van B16 tumoren. Representatieve confocale microscopie DIC afbeelding van MoDC geïsoleerd van B16 tumoren na overnachting cultuur (x400). Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 1 Carmi Y et al. JCI inzicht 1:18:e89020, 201625. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: MoDC van de milt en BM weer verschillende patronen van activering dan tumor en bloed MoDC na incubatie met IC. A. Flow cytometrische analyse van MHCII en CD86 meningsuiting door DC's nachts geïncubeerd met tumor-IgG IC. B. Confocal immunohistochemistry van tumor opname (groen) en MHCII expressie (rood) door DC geïncubeerd 's nachts met CFSE-geëtiketteerden tumor IC. Dit cijfer is gewijzigd van figuren 3A en 3DCarmi Y et al. Akt en SHP-1 zijn DC-intrinsieke controlepunten voor tumor immuniteit. JCI inzicht 1:18:e89020, 201625. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien het grote aantal DC vereist voor het vaccineren van muizen (ongeveer 2-4 x 106 DC per één muis), allermeest naar de vaccinatie strategieën in muizen zijn gebaseerd op isolatie van DC van BM en milt gevolgd door hun ex vivo -activering. Echter probeert te activeren tumor DC in vivo, met behulp van dezelfde voorwaarden voor het activeren van de milt en BM DC, vaak niet succesvol in het produceren van effectieve immuniteit geweest. In twee latere publicaties, Carmi et al. hebben gevonden dat bloed en tumor MoDC aanzienlijk verschilt milt en BM DC, gezien het feit dat zij natuurlijk hoge intrinsieke niveaus van tyrosine fosfatase dragen en priming vóór activering met IC24,25 vereisen. Bovendien geeft deze resultaten verder stress de noodzaak om extra voorzorgsmaatregelen te nemen teneinde de DC in een activeringsstatus die beter hun fysiologische status. Daarom beoogt het huidige protocol vindt u een gedetailleerde beschrijving van het proces van de isolatie van de MoDC van tumoren en het verkeer, en nadruk wordt gelegd op de stappen die leiden hun voortijdige Activering tot kunnen.
Eerst, om voldoende aantallen DC verkrijgen van bloed en tumoren, er is behoefte aan een veel groter aantal muizen vergeleken met die van protocollen voor het isoleren van de BMDC. Verhogen van het rendement van de DC we gebruiken 16 weken oude muizen, die grotere volumes van bloed hebben en algemene cel telt. We krijgen regelmatig 5-8 x 104 MoDC per 1 mL bloed zonder injectie van GM-CSF, en 4-5 x 105 MoDC volgende injectie. Voor tumor DC, verkrijgen wij ongeveer 6-8 x 104 MoDC van een 100 mm3 tumor, hoewel het aantal tussen individuele muizen en tumor modellen variëren kan. Het verhogen van de tumor grootte resulteert in een lagere opbrengst van de DC, zoals een tumor van 1.000 mm3 slechts ongeveer 5.000 hebben zal DC. In plaats daarvan, injecteren we muizen met tumorcellen op meerdere locaties (meestal 4-6), waardoor het verkrijgen van maximaal 4 x 105 MoDC per muis.
Bovendien is het raadzaam dat voorafgaand aan hun experimenteel gebruik: antilichamen, cellijnen, buizen en algemene lab reagentia dienen worden getest op endotoxines door LAL assay, en door de media op AC bacteriële agar plating. Tumor cellijnen zijn vaak besmet met Mycoplasma en moeten daarom worden getest door PCR voorafgaand aan hun incubatie met DC. Gebruik van ruwe collagenase preparaten, zoals typen 1 en 4, is een primaire bron van endotoxines als gevolg van de isolatie van de collagenases van Clostridium histolyticum. Standaard bereidingen van collagenase mogen bevatten maar liefst 10 EU/mg van endotoxines, dat is ongeveer 1-2 ng van Endotoxinen per mL van het mengsel van de spijsvertering. Jahr et al. hebben gevonden dat collagenase preparaten 2.7-6,7 ng/mL van endotoxines 1,415-3,967 ng/mL van IL-1β induceren zal aanleiding van cultuur met PBMC29. Inderdaad, priming voor DC routinematig wordt gedaan met 1 ng van LPS per mL media, maar zo weinig als 100 picogram/mL is voldoende om ze30,31,32prime. Een andere mogelijke bron van endotoxines is FBS, die 25 EU/mL of meer van endotoxines kunnen bevatten, of minder dan 10 EU/mL. Ervan uitgaande dat de voedingsbodems bevat 10% FBS, de belasting van endotoxinen kunnen oplopen tot 0,5 ng/mL, die voldoende is om te prime DC.
Daarnaast gebruiken veel protocollen anti-CD16/32 antilichamen te blokkeren Fc receptoren als een middel om het specifieke karakter van hun antilichaam paneel vóór sorteren te vergroten. Niettemin, cross-linking van FcγRIII (CD16) leidt tot fosforylatie van unnethes/ZAP-70 en PLC-γ, introductie van intracellulaire Ca2 + 33, en fosforylering van P38 en ERK1/2 in zowel menselijke34 en muis monocyten35. In onze handen induceert toevoeging van anti-CD16/32 tot en met MoDC culturen consequent een sterke fosforylatie van P38 en ERK1/2 kinases in DC binnen één minuut van de blootstelling. Wij, daarom raden vermijden van het gebruik van anti-CD16/32 bij het isoleren van MoDC voor in vitro functionele testen.
Een ander gemeenschappelijk protocol gebruikt verrijking van DC door de magnetische kralen CD11c voorafgaand aan hun sorteren op FACS. CD11c is een type ik transmembraan glycoproteïne die herkent een verscheidenheid van liganden, met inbegrip van fibrinogeen, LPS, typ ik collageen en de geïnactiveerd C3b subeenheid. Rezzonico et al. is gebleken dat Afbinding van CD11c met antilichamen induceert potente NFκB activering en secretie van chemokines36. In onze ervaring induceren geïmmobiliseerdet anti-CD11c antilichamen cel activatie en apoptosis, terwijl het gebruik van hun oplosbare vorm in FACS sorteren niet toe fosforylatie van P38 of ERK1/2 brengt er.
Globaal, dit protocol is ontworpen om Isolatievan MoDC met zo weinig activering mogelijk, zodat hun latere activering in vitro de eisen voor hun activatie in vivo weerspiegelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren ze hebben geen conflict van belang en dat zij niets hebben te onthullen.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
