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Biology

उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा Cyanobacteria में डीएनए संपीड़न के दृश्य

Published: July 17, 2018 doi: 10.3791/57197
Automatic Translation
1, 2
1National Institute for Physiological Sciences, 2Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

Summary

इस प्रोटोकॉल cyanobacteria में क्षणिक डीएनए संपीड़न कल्पना करने के लिए कैसे का वर्णन है । तुल्यकालिक खेती, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी, तेजी से ठंड, और उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का उपयोग किया जाता है । इन तरीकों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, और भविष्य के अनुप्रयोगों और घटनाओं पर चर्चा कर रहे हैं ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल cyanobacteria में क्षणिक डीएनए संपीड़न कल्पना करने के लिए कैसे का वर्णन है । डीएनए संकुचन एक नाटकीय cytoplasmic घटना हाल ही में सेल विभाजन से पहले कुछ cyanobacteria में पाए जाते है पाया है । हालांकि, बड़े सेल आकार और क्षणिक चरित्र के कारण, यह विस्तार में संरचना की जांच करने के लिए मुश्किल है । कठिनाइयों को दूर करने के लिए, सबसे पहले, डीएनए संकुचन reproducibly cyanobacterium Synechococcus elongatus में उत्पादित है तुल्यकालिक संस्कृति का उपयोग कर 12 एच प्रत्येक प्रकाश/ दूसरा, डीएनए स् पेक् टर को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से मॉनीटर किया जाता है और तेजी से जमने से कैप्चर किया जाता है । तीसरा, डीएनए संकुचित कोशिकाओं की विस्तृत संरचना तीन आयामों (3 डी) में उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा कल्पना की है । विधियों का यह सेट व्यापक रूप से बैक्टीरिया में क्षणिक संरचनाओं की जांच करने के लिए लागू है, जैसे सेल डिवीजन, गुणसूत्र अलगाव, फेज संक्रमण आदि, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी कर रहे हैं और सीधे द्वारा कल्पना उपयुक्त समय बिंदुओं पर क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी ।

Introduction

डीएनए स् पेक् टर एक नाटकीय cytoplasmic घटना है जिसकी पहचान कुछ cyanobacteria में की गई है । जब Synechococcus elongatus 12 एच प्रत्येक प्रकाश/अंधेरे चक्र के तहत संस्कृति था, डीएनए प्रकाश अवधि के अंत में गाढ़ा दिखाई दिया, जो अन्य समय अंक1पर अपने स्वरूप से स्पष्ट रूप से अलग था. यह सुझाव दिया गया है कि यह प्रक्रिया काई प्रोटीन्स2के आधार पर एक circadian घड़ी द्वारा नियंत्रित की जाती है । सेकि एट अल. ने बताया है कि डीएनए Hoechst ३३३४२ के साथ दाग प्रकाश अवधि के अंत की ओर एस elongatus कोशिकाओं में संकुचित था और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नीचे लहराती रॉड-आकार दिखाया । संकुचित डीएनए तो विभाजित सेल के रूप में रॉड के केंद्र में दो में अलग है, और अंत में एक बेटी3सेल में एक सामांय समान वितरण के लिए लौट आए । हालांकि, इसके क्षणिक प्रकृति और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए बड़े आकार में बाधा संरचनात्मक विश्लेषण । मुराटा एट अल. संयुक्त कई तरीकों, तुल्यकालिक संस्कृति सहित, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, तेजी से ठंड, और उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रॉन क्रायो-टोमोग्राफी (क्रायो-HVET), और क्षणिक डीएनए संपीड़न की संरचना की पहचान करने में सफल रहा, जिसमे कैनेटीक्स के polyphosphate शव (PPBs)4. पांडुलिपि विस्तार में प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के संयोजन से इस तरह के एक कठिन सामग्री के दृश्य विवरण प्रदान करता है ।

एस elongatus एक कैप्सूल आकार, 2 से 5 µm की लंबाई, के बारे में ०.५ µm की एक चौड़ाई है, और सही डीएनए संपीड़न केवल एक बहुत ही कम समय के लिए जीवित कोशिकाओं में प्रकट होता है । इसलिए cyanobacterial डीएनए स् पेक् टर में होने वाली संरचनात्मक बदलावों को विस् तार से अज्ञात किया गया । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा इन संरचनाओं की जांच करने के लिए, यह दो मुख्य तकनीकी समस्याओं को दूर करने के लिए आवश्यक है । एक के निकट देशी परिस्थितियों में पूरे जीवाणु के इस तरह के एक मोटी नमूना का अवलोकन है, और एक गतिशील संरचना का तेजी से निर्धारण है । पहली समस्या के रूप में, इलेक्ट्रॉनों के लोचदार मतलब मुक्त पथ (iMFP) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप5की तेजी से वोल्टेज पर निर्भर करता है । ३०० केवी के एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) में यह ३५० एनएम से कम है । उदाहरण के लिए, जब एक बर्फ एंबेडेड cyanobacterium (नमूना मोटाई ≈ ६०० एनएम) 200kV उनि (iMFP ≈ २५० एनएम) में मनाया जाता है, कक्ष के अंदर संरचनाओं का पालन करना मुश्किल है । इसके विपरीत, 1 एमवी उनि (iMFP ≈ ५०० एनएम) दे सकते हैं और सेल भर में cytoplasmic संरचना की छवि (चित्रा 1). इस प्रोटोकॉल में, समाधान के एक भाग के रूप में, एक उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (HVEM) एक तेजी से वोल्टेज में 1 एमवी कार्यरत था. हालांकि, HVEM को लागू करने वाली सुविधाएं दुनियाभर में सीमित हैं । संभावित वैकल्पिक समाधान भी चर्चा अनुभाग में चर्चा कर रहे हैं । दूसरी समस्या क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) द्वारा हल किया गया था । यह एक शक्तिशाली उपकरण के पास देशी स्थितियों में गतिशील संरचनाओं visualizing, जहां नमूना तेजी से तरल में जमे हुए है एक तेजी से ठंड डिवाइस का उपयोग कर एतान, और जमे हुए पल सीधे6संशोधनों की एक ंयूनतम के साथ मनाया जाता है । टोमोग्राफी के साथ संयोजन, तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं का एक स्नैपशॉट झुकाव श्रृंखला7से खंगाला जा सकता है । इस प्रयोग में, डीएनए पेक् elongatus में reproduced था 12 के तहत तुल्यकालिक संस्कृति का उपयोग कर एच प्रत्येक प्रकाश/अंधेरे चक्र, और नमूनों की ठंड के समय एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निगरानी द्वारा निर्धारित किया गया था ।

यहां वर्णित दृष्टिकोण व्यापक रूप से बैक्टीरियल कोशिकाओं में गतिशील संरचनाओं के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं, जैसे सेल डिवीजन, गुणसूत्र अलगाव और फेज संक्रमण, और एक के लिए सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान में नए रास्ते खोलने की क्षमता है ।

Protocol

1. Cyanobacteria की तुल्यकालिक संस्कृति

  1. कल्चरल एस. elongatus पीसीसी ७९४२ पर निष्फल बीजी 11 प्लेट (एक 9 सेमी बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश में) १.५% (डब्ल्यू/वी) आगर और ०.३% (डब्ल्यू/वी) सोडियम thiosulfate8युक्त ।
  2. एक वृद्धि कक्ष में प्लेटें 23 ° c में ५० µ e/m2//के एक प्रकाश की तीव्रता के साथ प्लेस और 12 ज लाइट/
  3. कक्षों को सप्ताह में एक बार ताजा BG11 आगार प्लेटों पर स्थानांतरित करना ।
    नोट: इस संस्कृति की हालत के तहत एक सप्ताह के बाद सक्रिय रूप से proliferating कोशिकाओं के ग्रीन बैंड के रूप में आगर पर संस्कृतियों दिखाई देगा ।
  4. एक लौ निष्फल तार पाश और एक ताजा BG11 आगर प्लेट पर कोशिकाओं लकीर के साथ कोशिकाओं के हरे रंग का झुरमुट ले लो । यह सफाई बेंच पर करें ।

2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी

  1. का प्रयोग करें कोशिकाओं को 6 दिनों के लिए आगर प्लेट पर संस्कृति डीएनए संपीड़न का निरीक्षण । कोशिकाओं पर ०.२ मीटर सुक्रोज समाधान की 1 मिलीलीटर डालने के द्वारा प्रकाश अवधि के अंत में प्लेट से कोशिकाओं को इकट्ठा । कक्षों पर समाधान डालना दोहराएँ ताकि अधिकांश कक्ष एकत्र हो जाएँ. डीएनए धुंधला के लिए एक माइक्रो ट्यूब में निलंबित सेल समाधान स्थानांतरण ।
  2. डीएनए धुंधला डाई जोड़ें (उदाहरण के लिए Hoechst ३३३४२) एक माइक्रो ट्यूब में निलंबित सेल समाधान के ५०० µ एल के लिए समाधान 1 µ जी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए/ फिर, 10 मिनट के लिए अंधेरे में ट्यूब रखें ।
  3. २,००० एक्स जी में 1 मिनट के लिए तलछट कोशिकाओं के लिए केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और सघन सेल सस्पेंशन प्राप्त करने के लिए ०.२ M सुक्रोज सॉल्यूशन के 10 µ l को जोड़ें ।
  4. एक स्लाइड ग्लास करने के लिए सना हुआ कोशिकाओं से युक्त समाधान के 1 µ एल स्थानांतरण, एक कवर पर्ची डाल दिया और एक प्रतिदीप्ति एक यूवी 100X और विसर्जन तेल का इज़ाफ़ा के साथ एक उद्देश्य लेंस का उपयोग कर फिल्टर के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण ।
  5. पुष्टि करें कि डीएनए संपीड़न सबसे कोशिकाओं में इस बिंदु पर मनाया जाता है, तो अगले ठंड कदम के लिए नमूना तैयार करते हैं ।

3. क्रायो-HVET के लिए सैंपल जमने

  1. एक डुबकी-ठंड डिवाइस सेट करें । तरल नाइट्रोजन के साथ टैंक भरें और टैंक और एक Teflon ट्यूब के साथ चैंबर जोड़ने के बाद क्रायो-चैंबर ठंडा शुरू करते हैं ।
  2. तरल नाइट्रोजन तापमान करने के लिए नीचे चैंबर ठंडा करने के बाद कक्ष के अंदर एक छोटे से cupper पॉट में लिक्विड एतान भरें । आपरेशन के दौरान चश्मा पहनते हैं, क्योंकि तरल एतान विस्फोटक है ।
  3. चमक निर्वहन कार्बन एक छिद्रित कार्बन के पक्ष-लेपित EM ग्रिड (छिद्रित ग्रिड) के लिए 30 एस ५० mA में प्लाज्मा आयन बमबारी का उपयोग कर ।
  4. BSA गोल्ड अनुरेखक के 1 µ एल लागू करें (15 एनएम) एक फिड्यूशियल मार्कर के रूप में छिद्रित ग्रिड के लिए.
  5. डीएनए स् पेक् टर चरण में कक्षों की एक २.५ µ l aliquot को छिद्रित ग्रिड पर लागू करें । एक फिल्टर कागज के साथ अतिरिक्त समाधान बंद दाग । तुरंत डुबकी ठंड डिवाइस में एक गोताख़ोर का उपयोग कर तरल एतान में ग्रिड डुबकी ।
  6. तरल नाइट्रोजन भंडारण में जमे हुए ग्रिड की दुकान जब तक वे जांच कर रहे हैं ।

4. क्रायो-HVET

  1. 1 एमवी की एक उच्च वोल्टेज पर HVEM सेट करें ।
  2. माउंट क्रायो-कार्य केंद्र के अंदर तरल नाइट्रोजन के साथ HVEM-१५० डिग्री सेल्सियस के लिए एक क्रायो-नमूना धारक में जमे हुए ग्रिड, और यह HVEM में लोड । बर्फ से संक्रमण से बचने के लिए सावधानी बरतें ।
  3. 1, 000X की कम आवर्धन पर किसी इमेजिंग क्षेत्र का चयन करें । eucentric z-अक्ष ऊंचाई समायोजित करें ।
  4. ६० ° करने के लिए नमूना मंच झुकाव और झुकाव रोटेशन की प्रतिक्रिया को दूर.
  5. 10, 000X के एक आवर्धन पर लक्ष्य स्थान के पास ध्यान समायोजित करें । ध्यान केंद्रित छवि से विचलन द्वारा 6 से 10 µm के तहत एक सेट करें । इमेजिंग के लिए, 2 ई-/Å-2 या कम से पहले नमूना पर खुराक सेट ।
  6. HVEM में छवि स्क्रीन पर वर्तमान घनत्व द्वारा इलेक्ट्रॉन खुराक को मापने । एक इलेक्ट्रॉन फिल्म पर एक छवि या डिजिटल कैमरे के द्वारा ध्यान केंद्रित प्रक्रिया में के रूप में एक ही आवर्धन पर ले लो ।
  7. 2 ° से 4 ° के एक झुकाव कोण वृद्धि में-६० ° करने के लिए + ६० ° से (४.५) में के रूप में एक ही प्रक्रिया से झुकाव छवियों को इकट्ठा ।
    नोट: कई आधुनिक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में, झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण एक डिजिटल कैमरे के संयोजन से स्वचालित है । उस स्थिति में, अनुदेश पुस्तिका का पालन करें । नकारात्मक फिल्मों के लिए, एक डेवलपर टैंक में 20 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए फिल्मों का विकास एक पूर्ण शक्ति डेवलपर का उपयोग कर और एक तरक्की करने में 10 मिनट के लिए तय । ४,००० डीपीआई के एक प्रस्ताव पर फिल्मों डिजिटलीकरण (०.६३५ एनएम/छवि पर पिक्सेल) एक flatbed स्कैनर का उपयोग कर । एक डिजिटल कैमरे के मामले में, एकत्र छवियों को सीधे अगले छवि प्रसंस्करण कदम के अधीन । यदि आवश्यक हो, तो एक माध्य फ़िल्टर द्वारा छवि आकार को कम करने के लिए दो से चार बिन्नी (आकार को कम करने का कारक) और उपयुक्त सॉफ़्टवेयर (जैसे ImageJ) का उपयोग कर ।

5. Tomographic पुनर्निर्माण

  1. व्यक्तिगत झुकाव छवियों से एक स्टैक छवि फ़ाइल बनाओ कमांड का उपयोग कर "tif2mrc" या "newstack" IMOD सॉफ्टवेयर9में ।
  2. IMOD में eTomo जीयूआई सॉफ्टवेयर शुरू और छवि मापदंडों सेट: पिक्सेल आकार, फिड्यूशियल व्यास, छवि रोटेशन, आदि फिर स्क्रिप्ट बनाएं ।
  3. सामग्री की तालिकाओं में सूचीबद्ध सॉफ्टवेयर के अनुसार व्यक्तिगत कार्यक्रमों को अंजाम, जहां झुकाव श्रृंखला फिड्यूशियल मार्कर का उपयोग कर गठबंधन (एक मतलब अवशिष्ट त्रुटि ०.५ से कम के साथ) है । अंत में, एक 3 डी स्कैन IMOD में SIRT एल्गोरिथ्म का उपयोग कर पुनर्निर्माण ।
  4. एक शोर फिल्टर का उपयोग कर स्कैन और शोर से ब्याज की एक क्षेत्र (रॉय) निकालें: IMOD में एक अनिसोट्रोपिक प्रसार फिल्टर,10एमन में एक द्विपक्षीय फिल्टर, या एक गणितीय आकृति विज्ञान फिल्टर11, आदि, उचित मापदंडों के साथ कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए ।

6. ब्याज की सुविधा का विभाजन

नोट: प्रक्रिया नीचे वर्णित सॉफ्टवेयर ( सामग्री तालिकादेखें) लेकिन अंय सॉफ्टवेयर संकुल के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए विशिष्ट है । अपने उपयोगकर्ता गाइड को देखें ।

  1. 3d व्यूअर विंडो में, Amira सॉफ़्टवेयर पर स्कैन फ़ाइल खोलें और एक OrthoSlice जनरेट करें ।
  2. सेगमेंट संपादक विंडो में, एक नया "लेबल फ़ील्ड" का चयन करके एक फॉल्ट फ़ाइल बनाएँ.
  3. मैन्युअल रूप से ब्याज की सुविधा (FOI) की सीमा का पता लगाएँ. सभी स्कैन स्लाइस के माध्यम से FOI का पालन करें । दूसरी FOI के लिए, एक नया "सामग्री" बनाने के लिए और एक ही कार्रवाई दोहराएं ।
  4. "SurfaceGen" मेनू का चयन करके सरफ़ेस रेंडरिंग जनरेट करें । खंड खंड की कल्पना करने के लिए, "SurfaceView" मेनू का चयन करें । 3d वॉल्यूम में ले जाने, घुमाने और ज़ूम करने के लिए, 3d व्यूअर विंडो में टूल का उपयोग करें ।
  5. स्वचालित विभाजन के लिए, जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग करें । किसी ऑब्जेक्ट पर क्लिक करें, और प्रदर्शन में स्लाइडर्स समायोजित और मानों की श्रेणी को कवर करने के लिए मास्किंग ताकि ऑब्जेक्ट पूरी तरह से अपनी सुविधाओं द्वारा चयनित है ।

Representative Results

एक सटीक तुल्यकालिक संस्कृति के तहत 12 एच प्रत्येक प्रकाश/अंधेरे चक्र, Hoechst के साथ लेबल डीएनए अंधेरे हालत (चित्रा 2a) में एक सामान्य समान वितरण से पता चलता है. हालांकि, यह उत्तरोत्तर प्रकाश अवधि के दौरान सेल के भीतर संकुचित, और प्रकाश अवधि के अंत में एक लहराती रॉड की तरह संरचना (चित्रा बी) के रूप में प्रकट होता है । अंत में, रॉड केंद्र में विभाजित ( चित्र 2cमें तीर) और उसके दो भागों बेटी कोशिकाओं (चित्रा 2d) में वितरित कर रहे हैं । कोशिका विभाजन के बाद, संकुचित डीएनए तुरंत गायब हो जाता है, और एक सामांय वर्दी वितरण के लिए डीएनए देता है ।

जब डीएनए संपीड़न के अंतिम चरण में कोशिकाओं से युक्त कोशिकाओं के एक aliquot तुरंत एक छिद्रित ग्रिड पर स्थानांतरित कर रहे थे और तेजी से तरल एतान में जमे हुए, और जमे हुए ग्रिड 1 एमवी क्रायो द्वारा मनाया गया था-HVEM, सहित cyanobacteria के आंतरिक संरचनाओं डीएनए, thylakoid झिल्ली परतों, सेल दीवारों, और PPBs, ठंड के क्षण में एक स्नैपशॉट में के रूप में छपी (3 ए आंकड़ा) । कई कोशिकाओं कोशिकाओं में अलग डीएनए संकुचन दिखाया ( चित्र 3ए में सफेद तीर), और आसानी से सामांय कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है (सफेद ऐरोहेड चित्र बीमें) । कुछ सेल विभाजन से पहले की उंमीद के रूप में कोशिकाओं के केंद्र में एक कसना प्रदर्शन ( चित्र 3ए में पीला तीर) ।

3d tomograms में, सेल के प्रमुख organelles को सेगमेंट किया जा सकता है; सेल दीवार, thylakoid झिल्ली परतों, डीएनए, और PPBs (चित्रा 4) प्रतिष्ठित किया जा सकता है । विशेष रूप से, संकुचित डीएनए कोशिका द्रव्य जहां डीएनए कम घनत्व सामग्री से घिरा हुआ था और thylakoid झिल्ली परतों संकुचित डीएनए की लहराती रॉड के साथ विकृत थे में एक अलग अंतर से अलग किया गया था । PPBs के गतिशील व्यवहार नव मनाया गया था: डीएनए संकुचित कोशिकाओं में, कई छोटे PPBs डीएनए का पालन करने के लिए देखा गया था, जबकि वे बड़े और सामान्य कोशिकाओं में कम कर रहे हैं. इसके अलावा, PPBs के अधिकांश जोड़े के रूप में दिखाई दिया, और कुछ डीएनए PPBs से जुदाई की एक प्रक्रिया में प्रकट हुए । यह सुझाव दिया है कि खुद PPBs डीएनए दोहराव और डीएनए संश्लेषण के लिए फॉस्फेट के आपूर्तिकर्ताओं के रूप में समारोह से दो में विभाजित हैं.

Figure 1
चित्र 1. क्रायो-EM छवियों के बर्फ एंबेडेड सामांय cyanobacteria, elongatus पीसीसी ७९४२ में विभिंन तेजी वोल्टेज पर । अ) 200kV व ब) 1000kV. स्केल बार = ५०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: cyanobacterium एस elongatus कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी । तुल्यकालिक संस्कृति के तहत 12 घंटे के तहत प्रत्येक प्रकाश/अंधेरे चक्र, कोशिकाओं Hoechst ३३३४२ के साथ दाग थे । (एक) अंधेरे राज्य शो वर्दी डीएनए लेबलिंग की शुरुआत के 2 ज के बाद कोशिकाओं । कई प्रकोष्ठों में डीएनए को हल्की अवधि के दौरान धीरे-से समेटा जाता है । यह अंततः एक मोटी लहराती रॉड का गठन (ख) डीएनए संपीड़न की खासियत । इस चरण के बाद, संकुचित डीएनए संरचनाओं जल्दी से अपने केंद्रों (ऐरोहेड) में सेल डिवीजन (सी) के दौरान विभाजित है, और दो बेटी कोशिकाओं (डी) में अलग टुकड़े । बेटी कोशिकाओं की वर्दी में लौटे डीएनए लेबलिंग फिर से अंधेरे काल में । स्केल बार = 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: क्रायो-HVEM cyanobacteria की छवि को अमली बर्फ में एंबेडेड । (क) 0 ° झुकाव पर एक रॉ छवि से पता चलता है । छवियां प्रकाश अवधि के अंत में लिया गया । कुछ कोशिकाओं eukaryotic गाढ़ा गुणसूत्रों (सफेद तीर) के समान लहराती रॉड के आकार का डीएनए शरीर दिखा । सामांय कोशिकाओं में, cyanobacteria कोशिका द्रव्य (सफेद ऐरोहेड) के भीतर एक समझदार डीएनए संरचना का प्रदर्शन । कुछ सेल डिवीजन (पीला तीर) से पहले की अपेक्षा के रूप में कोशिकाओं के केंद्र पर एक कसना प्रदर्शन । (ख) एक 3d स्कैन के xy, xz, yz-स्लाइस । पीली डॉटेड रेखाएं स्लाइस के चौराहों को दिखाती हैं । स्केल बार = 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: Ultrastructure युक्त डीएनए वाले कोशिकाओं का. प्रमुख घटक खंड: कोशिका दीवार (चमकीले पीले), thylakoid झिल्ली (लाल), और डीएनए (नीला) हैं । (a) 3d स्कैन का z-स्लाइस दिखाता है । (ख) सभी खंड । कक्ष विभाजन का संकेत कसना कक्ष के केंद्र (तीर) में दिखाई देता है. PPBs पीले या नारंगी क्षेत्रों के रूप में मॉडलिंग कर रहे हैं; प्रत्येक नारंगी क्षेत्र निकटतम पीले क्षेत्र के समकक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार = ५०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हम cyanobacteria में क्षणिक डीएनए संपीड़न visualizing के लिए प्रोटोकॉल का एक अनुक्रम प्रस्तुत किया है । मूल अवधारणा correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों)12के समान है । इसके अलावा, इस विधि में, लाइव cyanobacteria प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मॉनिटर किया गया था, तेजी से EM ग्रिड पर जमे हुए, और सीधे उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के साथ visualized. एक पहले आवेदन के रूप में, डीएनए संकुचित बैक्टीरियल कोशिकाओं की विस्तृत संरचना सफलतापूर्वक 3 डी में visualized किया गया था । वर्तमान में, इस प्रक्रिया को इस विषय के लिए विशिष्ट है, लेकिन इसे और अधिक बड़े पैमाने पर लागू किया जाएगा, कुछ मामलों में संशोधित पद्धति के साथ. यहां, लाभ, सीमाएं, और इस विधि के भविष्य की संभावनाओं पर चर्चा कर रहे हैं ।

इस विधि के लाभों में से एक पूरे सेल के 3 डी दृश्य है । 1 एमवी HVEM सफलतापूर्वक डीएनए संकुचित कोशिकाओं में उपसेलुलर organelles के गतिशील संरचना visualized । हालांकि, सामांय कोशिकाओं के अंदर ठीक संरचना कम छवि कंट्रास्ट के कारण प्रतिष्ठित नहीं किया जा सका । बढ़ती लोचदार और मोटी नमूनों में कई तितर बितर13छवि धुंधला । शूंय-हानि और सबसे संभावित नुकसान छवि एक ऊर्जा फिल्टर द्वारा छानने के लिए लोचदार बिखरने14,15को कम करने से छवि इसके विपरीत सुधार कर सकते हैं, लेकिन यह iMFP से मोटा नमूनों के लिए काम नहीं करेगा । शूंय हानि और सबसे संभावित नुकसान चोटियों काफी नमूना मोटाई के साथ कम । यह विशेष रूप से इलेक्ट्रॉन संवेदनशील बर्फ एंबेडेड नमूनों के लिए एक पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । मुराटा एट अल. पता चला है कि 1MV स्कैनिंग ट्रांसमिशन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) 5 µm मोटाई के साथ प्लास्टिक एंबेडेड खमीर कोशिकाओं में एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि से उच्च छवि विपरीत देता है, जहां छवि इसके विपरीत मुख्य रूप से आयाम 13 विपरीत द्वारा दिया जाता है . हालांकि, यह उम्मीद है कि दस्तक के प्रभाव पर उच्च त्वरित इलेक्ट्रॉनों क्षति के लिए विकिरण खुराक के लिए एक और सीमा बनाता है-संवेदनशील क्रायो-नमूनों16. वोल्टा और Zernike चरण प्लेटें17,HVEM के लिए18 के आवेदन भविष्य में कुल खुराक को कम करने से नुकसान पर दस्तक को कम करने में सक्षम हो सकता है । मोटी नमूनों के लिए HVEM का उपयोग करने के लिए एक और सीमा तथ्य यह है कि उपयोगकर्ता सुविधाएं प्रदान HVEM दुनिया भर में दुर्लभ है से आता है ।

मोटे नमूनों का निरीक्षण करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति का उपयोग करना, क्रायो-३०० केवी पर स्टेम टोमोग्राफी कई सौ nanometers19से अधिक मोटाई के साथ जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों पर उच्च विपरीत छवियों का प्रदर्शन किया है । क्रायो-स्टेम में चरण कंट्रास्ट पुनः प्राप्त करने के लिए, इलेक्ट्रॉन pthychographic माइक्रोस्कोपी भी शुरू की गई है, जिसमें संघनित्र लेंस में चरण थाली एक pixelated 2d डिटेक्टर20के लिए एक चरण संग्राहक विवर्तन स्थानांतरित कर दिया । छवियों एकाधिक diffractions से गणना द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । प्रत्यक्ष और तेजी से 3 डी क्रायो के लिए-बड़े देशी जमे हुए नमूनों की इमेजिंग, क्रायो-मिथ्या-SEM भी21इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां एक केंद्रित आयन बीम और ब्लॉक फेस इमेजिंग के साथ धारावाहिक के साथ खोदी इमेजिंग पूरी तरह से हाइड्रेटेड जमे हुए नमूनों के लिए लागू किया जाता है । हालांकि इन प्रौद्योगिकियों जैविक नमूनों की देखने रेंज का विस्तार, यह जीवाणुओं के लक्ष्य स्थान को खोजने के लिए मुश्किल है, जैसे लेबल बैक्टीरिया, क्योंकि लक्ष्य पूरी तरह से बर्फ के नीचे है और ट्रिमिंग करने से पहले की पहचान नहीं की जा सकती ।

डीएनए संकुचन cyanobacteria में एक विशिष्ट संरचना पैदा करता है । डीएनए संकुचित कोशिकाओं को आसानी से भी विशिष्ट कोशिकाओं है कि सामांय कोशिकाओं में मौजूद नहीं है के भीतर एक बड़े घनत्व पूर्वाग्रह के कारण दाग जा रहा है बिना कर रहे हैं । हालांकि, आदेश में सेल के भीतर और अधिक स्थानीय घटनाओं कल्पना करने के लिए, यह आवश्यक है कि इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में रॉय लेबल के हस्तांतरण के लिए । correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों), प्रकाश माइक्रोस्कोप छवियों और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों के लिए आम तौर पर फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती या एम खोजक ग्रिड12पर क्वांटम डॉट्स का उपयोग कर संबंधित हैं । ्र कणों में प्रतिदीप्ति के अलावा उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व का होना आवश्यक है । वे सही और मज़बूती से दो छवियों के बीच की स्थिति को सहसंबंधी कर सकते हैं । इसके अलावा, क्रायो के साथ लेबल क्षेत्र की पुष्टि करके-प्रकाश माइक्रोस्कोपी, पूरा रॉय के ओवरलैप दो सूक्ष्मदर्शी के बीच प्राप्त किया जा सकता है । डीएनए स् पेक् टर में अधिक विस् तृत संरचनात्मक घटनाओं को निस्र्पक करते समय भविष् य में ज् यादा मजबूत और सही सहसंबंध के लिए ये कण और क्रायो-हल् के माइक्रोस्कोप एक अपरिहार्य उपकरण होंगे ।

यह लेख कैसे तुल्यकालिक संस्कृति, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का एक संयोजन द्वारा cyanobacteria में डीएनए संपीड़न के क्षणिक संरचना की विशेषता को दर्शाता है । यह प्रोटोकॉल संकुचित डीएनए के अवलोकन पर केंद्रित है । अंय नए उपर्युक्त प्रौद्योगिकियों के साथ इस पद्धति के संयोजन से, यह आगे विस्तार में डीएनए संकुचन की प्रक्रिया की जांच संभव हो जाएगा, और उपयुक्त संशोधित तरीकों व्यापक रूप से बैक्टीरिया में अंय गतिशील संरचनात्मक घटनाओं के लिए लागू कर रहे हैं ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Tammo Reisewitz धंयवाद, और सावधान खेती और Sayuri के अवलोकन के लिए दोनों माको हयाशी और Hagiwara cyanobacteria, छवि प्रसंस्करण के लिए Yoshitaka Kimori, Chihong गीत, Naoyuki मियाज़ाकी, और Miyoko संरचनाओं के विभाजन के साथ मदद करने के लिए Nagayoshi । यह काम राष्ट्रीय शारीरिक विज्ञान संस्थान (NIPS) के लिए Y.K. के सहयोगी अध्ययन कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hoechst 33342 solution Dojindo 346-07951 1mg/mL in H2O
Agar Powder (for plant culture) Wako 016-11875
Boric acid Wako 027-02192 99.5%
Manganese chloride tetrahydrate Wako 139-00722 99%
Zinc sulfate heptahydrate Wako 264-00405 99.5%
Sodium molybdate Wako 196-02472 99%
Copper sulfate pentahydrate Wako 039-04412 99.5%
Cobalt nitrate hexahydrate Wako 031-03752 99.5%
Sodium nitrate Wako 191-02542 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Wako 131-00405 99.5%
Calcium chloride dehydrate Wako 031-00435 99.5%
Citric acid Wako 036-05522 98%
EDTA-2Na Dojindo 343-01861 99.5%
Sodium carbonate Wako 197-01581 99.8%
Potassium phosphate dibasic Wako 164-04295 99%
TES (Good’s buffer) Dojindo 344-02653 99%
Ferric ammonium citrate Wako 092-00802 1st Grade
Sodium thiosulfate pentahydrate Wako 197-03585 99%
BSA gold tracer 15nm Aurion 215.133
Quantifoil EM grid Quantifoil MicroTools R3.5/1 Copper grid
Electron films Kodak SO-163
Developer Kodak D19
Fixer Kodak Rapid fixer Solution
Filter paper Whatman Grade 1
Growth chamber NKsystem LH-100SP
Fluorescent microscope Nikon ECLIPSE 50i
High voltage TEM HItachi H1250M
Cryo-specimen holder for HVEM Gatan
plunge-freezing device Leica EM CPC
Plasma Ion bombarder Vacuum device PIB-10
Liquid nitrogen storage Taylor-Wharton 25LDB
Developing tank Dosaka EM TB-3-75
flatbed scanner Nikon Coolscan 9000ED
Segmentation software FEI Amira https://www.fei.com/software/amira
Tomographic Reconstruction software eTOMO http://bio3d.colorado.edu/imod

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References

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जीव विज्ञान अंक १३७ तुल्यकालिक संस्कृति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तीव्र ठंड उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी विभाजन cyanobacteria डीएनए संकुचन सेल विभाजन मोटी नमूना
उच्च वोल्टेज क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा Cyanobacteria में डीएनए संपीड़न के दृश्य
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Murata, K., Kaneko, Y. Visualization … More

Murata, K., Kaneko, Y. Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography. J. Vis. Exp. (137), e57197, doi:10.3791/57197 (2018).

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