Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. Synchrone Anbau, Überwachung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Cryo-Elektron Tomographie verwendet. Ein Protokoll für diese Methoden vorgestellt, und zukünftige Anwendungen und Entwicklungen diskutiert.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. DNA-Verdichtung ist eine dramatische zytoplasmatischen Ereignis fand vor kurzem in einigen Cyanobakterien vor der Zellteilung auftreten. Jedoch aufgrund der großen Zellengröße und der vorübergehende Charakter ist es schwierig, die Struktur im Detail zu untersuchen. Um die Schwierigkeiten zu überwinden, ist zunächst DNA Verdichtung reproduzierbar in cyanobakteriums vorkommenden Elongatus PCC 7942 durch synchrone Kultur mit 12 h jedes Hell/Dunkel-Zyklus produziert. Zweitens ist die DNA Verdichtung durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht und aufgezeichnet durch schnelles gefrieren. Drittens: die detaillierte Struktur der DNA Zellen verdichtet wird in drei Dimensionen (3D) durch Hochspannung Cryo-Elektron Tomographie visualisiert. Dieser Satz von Methoden ist überall anwendbar, transiente Strukturen in Bakterien, z. B. die Zellteilung, Chromosom Abtrennung, Phagen Infektion etc.zu untersuchen., welche durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht und direkt visualisiert, indem Cryo-Elektron Tomographie zu geeigneten Zeitpunkten.
DNA-Verdichtung ist eine dramatische zytoplasmatischen Ereignis, das in einigen Cyanobakterien identifiziert wurde. Wenn vorkommenden Elongatus kultiviert wurde unter 12 h Zyklus hell/dunkel, erschien Ende der lichtperiode, unterscheidet sich deutlich von seinen Auftritt auf das andere Mal war kondensierten DNA Punkte1. Es wurde vermutet, dass dieser Prozess durch eine innere Uhr, die basierend auf dem Kai Proteine2gesteuert wird. Seki Et Al. haben berichtet, dass die DNA mit Hoechst 33342 befleckt war in S. Elongatus Zellen gegen Ende der lichtperiode verdichtet und zeigte eine wellige Stab-Form unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die verdichtete DNA dann getrennt in zwei in der Mitte der Stange wie die Zelle geteilt, und schließlich zurück zu einem normalen gleichmäßige Verteilung in jede tochterzelle3. Jedoch behindert seine Vergänglichkeit und große Größe für Elektronenmikroskopie Strukturanalyse. Murata Et Al. kombiniert mehrere Methoden, einschließlich der synchronen Kultur, Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Elektron Cryo-Tomographie (Cryo-HVET), und erfolgreich bei der Ermittlung der Struktur des vorübergehenden DNA Verdichtung einschließlich der Kinetics von Polyphosphat Körper (PPBs)4. Das Manuskript enthält bildliche Erklärung des Bildmaterials schwer im Detail durch die Kombination der experimentellen Verfahren.
S. Elongatus hat eine Kapsel Form, eine Länge von 2 bis 5 µm, einer Breite von über 0,5 µm und die perfekte DNA-Verdichtung erscheint in lebenden Zellen nur für sehr kurze Zeit. Daher waren die strukturellen Veränderungen in der Cyanobakterien DNA Verdichtung im Detail unbekannt. Um diese Strukturen durch Elektronenmikroskopie untersuchen, ist es notwendig, zwei technische Probleme zu überwinden. Ist die Beobachtung einer dicken Probe des ganzen Bakteriums bei in der Nähe von einheimischen Bedingungen, und die andere ist die schnelle Fixierung einer dynamischen Struktur. Für das erste Problem hängt die unelastische mittlere freie Weglänge (iMFP) der Elektronen die Beschleunigungsspannung der Elektronen-Mikroskop5. In einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) von 300 kV, es ist weniger als 350 nm. Zum Beispiel, wenn ein Eis eingebettet cyanobakteriums (Probe Dicke ≈ 600 nm) wird bei 200kV TEM beobachtet (iMFP ≈ 250 nm), die Strukturen im Inneren der Zelle sind schwer zu beobachten. Durch Kontrast, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) geben kann und Bild der cytoplasmatische Struktur in der Zelle (Abbildung 1). In diesem Protokoll, als ein Teil der Lösung, eine Hochspannungs-Elektronen-Mikroskop (HVEM) bei einer Beschleunigungsspannung von 1 MV war beschäftigt. Allerdings sind Einrichtungen, die HVEM implementieren weltweit begrenzt. Mögliche alternative Lösungen sind auch in die Diskussion Abschnitt diskutiert. Das zweite Problem wurde durch Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) gelöst. Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Visualisierung von dynamischen Strukturen auf in der Nähe von einheimischen Bedingungen, wo die Probe ist in flüssigem Ethan mit einem schnellen Einfrieren Gerät schnell eingefroren, und der eingefrorene Moment wird direkt mit einem Minimum an Modifikationen6beobachtet. Kombination mit Computertomographie, kann eine Momentaufnahme der dreidimensionalen (3D) Strukturen aus der Neigung der Serie7rekonstruiert werden. In diesem Experiment DNA Verdichtung wurde in S. Elongatus mit synchronen Kultur unter 12 h Zyklus jeder hell/dunkel wiedergegeben, und der Zeitplan für das Einfrieren der Probe wurde durch Überwachung unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
Die hier beschriebenen Vorgehensweisen gelten allgemein für die Untersuchung von dynamischen Strukturen in Bakterienzellen, z. B. die Zellteilung, Chromosom Segregation und Phagen-Infektion, und haben ein Potenzial, neue Wege in der mikrobiologischen Forschung zu öffnen.
Wir haben eine Reihe von Protokollen zur Visualisierung von Transienten DNA Verdichtung in Cyanobakterien vorgestellt. Das grundlegende Konzept ist ähnlich dem Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM)12. Darüber hinaus in dieser Methode waren live Cyanobakterien überwacht durch Fluoreszenz-Mikroskopie, schnell eingefroren auf EM Gittern und direkt mit der Hochspannung Cryo-Elektron Tomographie visualisiert. Als eine erste Anwendung, die detaillierte Struktur der DNA Bakterienzellen verdichtet wurde erfolgreich in 3D visualisiert. Derzeit, dieses Verfahren ist speziell für dieses Thema, aber intensiver, mit modifizierten Methodik in einigen Fällen angewendet wird. Hier werden die Vorteile, die Einschränkungen und die zukünftigen Möglichkeiten dieser Methode diskutiert.
Ein Vorteil dieser Methode ist die 3D Visualisierung der gesamten Zelle. 1 MV HVEM erfolgreich visualisiert die dynamische Struktur der subzellularen Organellen in der DNA Zellen verdichtet. Allerdings könnte die feine Struktur in normalen Zellen nicht aufgrund geringer Bildkontrast unterschieden werden. Erhöhung der unelastisch und Mehrfachstreuung bei dicken Exemplaren verwischt das Bild13. NULL- und die meisten wahrscheinliche Verlust Bildfilterung durch einen Energie-Filter kann durch die Reduzierung inelastische Streuung14,15Bildkontrast verbessern, aber es funktioniert nicht für Proben, die dicker als iMFP. Die NULL- und die meisten wahrscheinliche Verlust Gipfel verringern drastisch mit Dicke der Probe. Es ist besonders schwierig, einen ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis für die Elektron sensible Eis eingebettete Proben zu erhalten. Murata Et Al. haben gezeigt, dass 1MV Scan Übertragung Mikroskopie (STEM) gibt höheren Kontrast als ein Hellfeld-Bild in Kunststoff eingebettet Hefezellen mit 5 µm Dicke, wo den Kontrast des Bildes in erster Linie von Amplitude Kontrast13 gegeben . Allerdings wird erwartet, dass die Wirkung von Domino Schaden auf höhere beschleunigten Elektronen eine weitere Einschränkung auf die Bestrahlungsdosis für Schaden-Sensitive Cryo-Proben16schafft. Die Anwendung der Volta und Zernike Phase Platten17,18 für HVEM möglicherweise nachteilige Schäden verringern, indem die Gesamtdosis in der Zukunft. Eine weitere Einschränkung mit HVEM bei dicken Proben kommt von der Tatsache, dass die Benutzer Einrichtungen, die HVEM weltweit knapp sind.
Verwenden eine alternative Methode, um Dicke Proben, Cryo-STEM-Tomographie bei 300 zu beobachten hat kV kontrastreiche Bilder auf gefrorene hydratisiert Proben mit einer Dicke von mehr als einige hundert Nanometer19gezeigt. Phasenkontrast in Cryo-STEM abzurufen, hat Pthychographic Elektronenmikroskopie auch eingeführt, in denen transponiert der Phase-Platte im Kondensator Objektiv eine Phase moduliert Beugung eine Pixelige 2D Detektor20. Die Bilder werden durch Berechnung aus mehreren Talfüllung abgerufen. Für direkte und schnelle 3D Cryo-Imaging von großen Native gefrorene Proben, Cryo-FIB-SEM kann auch gebrauchte21, wo seriellen Schnitt mit einem fokussierten Ionenstrahl und Gesicht Bildgebung blockieren ist für Bildgebung vollständig gefrorene Proben hydratisiert aufgetragen. Obwohl diese Technologien die Sichtweite des biologischen Proben erweitern, es ist schwer zu finden, den Zielspeicherort der Bakterien, z.B. Bakterien, bezeichnet, weil das Ziel vollständig unter dem Eis steht und nicht vor dem Trimmen identifiziert werden.
DNA-Verdichtung erzeugt eine klare Struktur in Cyanobakterien. DNA verdichtet Zellen unterscheiden sich leicht auch ohne wird durch eine große Dichte Tendenz innerhalb der Zellen, die nicht in normalen Zellen ist befleckt. Jedoch um weitere lokalen Veranstaltungen innerhalb der Zelle sichtbar zu machen, ist es notwendig den eindringmittel beschrifteten ROI in das Elektronenmikroskop zu übertragen. Für Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) sind in der Regel Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop Bilder korreliert mit fluoreszierenden Latex-Kügelchen oder Quantenpunkte auf EM Finder Raster12. Die Kennzeichnung Partikel muss hohe Elektronendichte neben Fluoreszenz. Sie können genau und zuverlässig die Positionen zwischen den beiden Bildern korrelieren. Darüber hinaus kann durch die Bestätigung des markierten Bereich mit Cryo-Licht-Mikroskopie, vollständige Überlappung der ROI zwischen zwei Mikroskopen erreicht werden. Wenn genauere strukturelle Ereignisse in DNA Verdichtung zu charakterisieren, werden diese Partikel und Cryo-Licht Mikroskop ein unverzichtbares Werkzeug für eine robuste und präzise Korrelation in der Zukunft.
Dieser Artikel zeigt, wie die vorübergehende Struktur der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch eine Kombination von synchronen Kultur, Fluoreszenz-Mikroskopie und Hochspannung Cryo-Elektron Tomographie zu charakterisieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beobachtung der verdichteten DNA. Durch die Kombination dieser Methode mit anderen neuen Technologien erwähnt, es wird möglich sein, den Prozess der DNA Verdichtung näher untersuchen und entsprechend modifizierte Methoden sind allgemein anwendbar auf anderen dynamischen strukturellen Ereignisse in Bakterien.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Tammo Reisewitz für kritische Lesart der Handschrift, und Mako Hayashi und Sayuri Hagiwara für sorgfältige Pflege und Beobachtung von Cyanobakterien, Yoshitaka Kimori für die Bildverarbeitung, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki und Miyoko Nagayoshi für die Hilfe bei Segmentierung der Strukturen. Diese Arbeit wurde durch die Collaborative Study Program des National Institute für physiologische Wissenschaften (NIPS), Y.K unterstützt.
Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
Electron films | Kodak | SO-163 | |
Developer | Kodak | D19 | |
Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |