Summary
Denne protokol beskriver hvordan man visualisere den forbigående DNA komprimering i cyanobakterier. Synkron dyrkning, overvågning af Fluorescens mikroskopi, Hurtig nedfrysning og høj spænding cryo-elektron tomografi bruges. En protokol for disse metoder præsenteres, og fremtidige programmer og udviklingen diskuteres.
Abstract
Denne protokol beskriver hvordan man visualisere den forbigående DNA komprimering i cyanobakterier. DNA jordpakning er en dramatisk cytoplasmatisk begivenhed for nylig fundet for at forekomme i nogle cyanobakterier før celledeling. På grund af den store Cellestørrelse og forbigående karakter, er det imidlertid vanskeligt at undersøge strukturen i detaljer. For at overvinde vanskelighederne, først, er DNA jordpakning reproducerbar produceret i cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 af synkron kultur bruger 12t hvert lys/mørke cyklus. Andet er DNA jordpakning overvåget af Fluorescens mikroskopi og fanget af Hurtig nedfrysning. For det tredje den detaljerede struktur af DNA komprimeret celler er visualiseret i tre dimensioner (3D) af højspænding cryo-elektron tomografi. Dette sæt af metoder er almindeligt gældende at undersøge forbigående strukturer i bakterier, fx celledeling, kromosom segregation, phage infektion osv., som overvåges af Fluorescens mikroskopi og direkte visualiseret ved Cryo-elektron tomografi på passende tidspunkter.
Introduction
DNA jordpakning er en dramatisk cytoplasmatisk begivenhed, der er blevet identificeret i nogle cyanobakterier. Hvornår Synechococcus elongatus var kulturperler under 12 timer hver lys/mørke cyklus, DNA syntes kondenseret i slutningen af perioden lys, som var klart adskiller sig fra dens udseende på andre tid point1. Det er blevet foreslået, at denne proces styres af en døgnrytmen ur baseret på Kai proteiner2. Seki et al. har rapporteret, at DNA farves med Hoechst 33342 blev komprimeret i S. elongatus celler mod slutningen af perioden lys og viste en bølget stang-form under et fluorescens mikroskop. Sammenpresset DNA derpaa adskilles i to i centrum af stangen som celle opdelt, og endelig vendte tilbage til en normal ensartet fordeling i hver datter celle3. Men dens forbigående natur og store størrelse for elektronmikroskopi hæmmet strukturel analyse. Murata et al. kombineret flere metoder, herunder synkron kultur, Fluorescens mikroskopi, Hurtig nedfrysning og høj spænding elektron cryo-tomografi (cryo-HVET), og på at identificere strukturen af forbigående DNA jordpakning, herunder kinetik af polyphosphate organer (PPBs)4. Håndskriftet indeholder visuelle forklaring af vanskelige materiale i detaljer ved at kombinere de eksperimentelle procedurer.
S. elongatus har en kapsel form, en længde på 2-5 µm, en bredde på omkring 0,5 µm, og den perfekte DNA jordpakning vises i levende celler kun for meget kort tid. Derfor, de strukturelle forandringer i de cyanobakteriel DNA jordpakning var ukendt i detaljer. For at undersøge disse strukturer ved elektronmikroskopi, er det nødvendigt at overvinde to vigtigste tekniske problemer. Ene er observation af sådan en tyk eksemplar af hele bakterien på nær indfødte betingelser, og den anden er den hurtig fiksering af en dynamisk struktur. Hvad angår det første problem afhænger den uelastisk gennemsnitlige omkostningsfrit bane (iMFP) af elektroner elektronmikroskop5accelererende spænding. I et transmissions-elektronmikroskop (TEM) 300 kV, det er mindre end 350 nm. For eksempel, når en ice-embedded cyanobacterium (modellen tykkelse ≈ 600 nm) observeres i 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), strukturerne inde i cellen er vanskeligt at observere. Af kontrast, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) kan give og billede af cytoplasmatisk strukturen i hele cellen (figur 1). I denne protokol, som en del af løsningen, en høj spænding elektron mikroskop (HVEM) ved en accelererende spænding på 1 MV var ansat. Faciliteter, der implementerer HVEM er dog begrænset på verdensplan. Mulige alternative løsninger er også diskuteret i afsnittet diskussion. Det andet problem blev løst ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Dette er et kraftfuldt værktøj til at visualisere dynamiske strukturer på nær oprindelige betingelser, hvor modellen er hurtigt frosset i flydende Ethan ved hjælp af en hurtig nedfrysning enhed, og den frosne øjeblik er direkte observeret med et minimum af ændringer6. Kombinere med tomografi, kan et øjebliksbillede af tre-dimensionelle (3D) strukturer blive rekonstrueret fra tilt serie7. I dette eksperiment, DNA jordpakning blev gengivet i S. elongatus bruger synkron kultur under 12 timer hvert lys/mørke cyklus, og timingen af indefrysningen af modellen var bestemt af overvågning under et fluorescens mikroskop.
Metoderne beskrevet her er alment gældende for studiet af dynamiske strukturer i bakterieceller, fx celledeling, kromosom adskillelse og phage infektion, og har et potentiale til at åbne nye veje i mikrobiologiske forskning.
Protocol
1. synkron kultur af cyanobakterier
- Kultur S. elongatus PCC 7942 på steriliseret BG 11 plade (i en 9 cm sterile plastik petriskål) indeholdende 1,5% (w/v) agar og 0,3% (w/v) natrium thiosulfate8.
- Placer pladerne i en vækst kammer ved 23 ° C med en lysintensitet af 50 µE/m2/s og 12 h lys/12 h mørke cyklusser.
- Overfør celler på friske BG11 agar plader en gang om ugen.
Bemærk: Kulturer på agaren vises som grønne bands af aktivt prolifererende celler efter en uge under denne kultur betingelse. - Tage grøn klumper af celler med en flamme steriliseret teleslynge og streak celler på en frisk BG11 agar plade. Gøre dette på en ren bænk.
2. overvågning af Fluorescens mikroskopi
- Bruge celler dyrkes på agar plade i 6 dage til at observere DNA jordpakning. Indsamle celler fra pladen i slutningen af perioden lys ved at hælde 1 mL 0,2 M rørsukkeropløsning over cellerne. Gentag hælde løsningen på cellerne, så at de fleste af cellerne er indsamlet. Oploesningen suspenderet celle til en mikro tube for DNA farvning.
- Tilføje DNA farvning farvestof (fx Hoechst 33342) løsning til 500 µL af opløsningen suspenderede celle i en mikro rør til en endelig koncentration på 1 µg/mL. Derefter holde røret i mørke i 10 min.
- Der centrifugeres i 1 min på 2.000 x g til sediment cellerne. Supernatanten og tilsæt 10 µL af 0,2 M rørsukkeropløsning at opnå en tæt cellesuspension.
- Overføre 1 µL af den løsning, der indeholder farvede celler til et dias glas, sætte en cover slip og observere med et fluorescens mikroskop udstyret med UV-filter ved hjælp af en målsætning linse med en forstørrelse på 100 X og immersionsolie.
- Bekræfte, at DNA jordpakning er observeret ved dette punkt i de fleste celler og derefter forberede den næste indefrysning trin prøven.
3. prøven frysning for Cryo-HVET
- Oprette en springet-frysning enhed. Fyld tanken med flydende kvælstof og starte køling cryo-salen efter forbinder tanken og kammer med en Teflon tube.
- Fyld flydende Ethan i en lille kobber pot inde i salen efter afkøling ned i salen til flydende kvælstof temperatur. Bære briller under drift, fordi flydende Ethan er eksplosive.
- Glød udledning CO2-side af en holey carbon-belagt EM gitter (holey gitter) for 30 s på 50 mA ved hjælp af en plasma ion bombarder.
- Anvende 1 µL af BSA guld tracer (15 nm) til gitteret holey som en fiducial markør.
- Anvende en 2,5 µL alikvot af celler i DNA jordpakning fase til holey gitteret. DUP off overskydende løsningen med et filtrerpapir. Styrte gitteret i flydende Ethan ved hjælp af et stempel i springet frysning enhed straks.
- Gemme de frosne gitre i flydende nitrogen opbevaring, indtil de er undersøgt.
4. Cryo-HVET
- Opsætning af HVEM ved en høj spænding på 1 MV.
- Montere gitteret frosset i en cryo-præparatholderen for HVEM forkølede til-150 ° C med flydende kvælstof i cryo-arbejdsstation, og indlæse den i HVEM. Vær omhyggelig med at undgå forurening af is.
- Vælg en billeddiagnostiske område ved lavere forstørrelse af 1, 000 X. Justere eucentric z-aksen højde.
- Vippe modellen scenen-60 ° og fjerne modreaktion af vippe rotation.
- Fokusér nær destinationsplaceringen ved en forstørrelse på 10 000 X. Angive en under fokus på 6 til 10 µm af afvigelse fra det fokuserede billede. Imaging, sætte dosis til 2 e-/Å-2 eller færre på modellen på forhånd.
- Måle elektron dosis af strømtæthed i HVEM billedet på skærmen. Tage et billede på en elektron film eller digital kamera på samme forstørrelse som fokus processen.
- Indsamle tilt billeder manuelt efter samme procedure som i (4.5) fra-60 ° til + 60 ° på en tilt vinkel tilvækst på 2 ° til 4 °.
Bemærk: I mange moderne elektronmikroskoper, erhvervelse af tilt-serien er automatiseret ved en kombination af et digitalt kamera. I så fald følge brugsanvisningen. For negativ film, udvikle film i 12 min. ved 20° C i en udvikler tanken ved hjælp af en fuld-styrke udvikler og løse i en fixer for 10 min. digitalisere film med en opløsning på 4000 dpi (0.635 nm/pixel på billedet) bruger en flatbedscanner. I tilfælde af et digitalt kamera, er underlagt de indsamlede billeder direkte til det næste billede behandlingstrin. Hvis det er nødvendigt, reducere billedstørrelsen med en median filter ved hjælp af to til fire binning (størrelse reducerende faktor) og passende software (fx ImageJ).
5. tomografisk genopbygning
- Lave en stak image fil fra enkelt vippe billeder ved hjælp af kommandoen "tif2mrc" eller "newstack" i IMOD software9.
- Start eTomo GUI software i IMOD og indstille billedet parametre: pixelstørrelse, fiducial diameter, billedrotation, osv. Derefter oprette scripts.
- Udføre individuelle programmer ifølge den software, der er anført i tabeller af materialer, hvor tilt-serien er justeret ved hjælp af fiducial markører (med en gennemsnitlig resterende fejl mindre end 0,5). Endelig, rekonstruere et 3D tomogram med SIRT algoritme i IMOD.
- Udtrække en region af interesse (ROI) fra tomogram og tilføjes et vandmærke ved hjælp af en tilføjes et vandmærke filter: en anisotrope diffusion filter i IMOD, en bilateral filter i EMAN10eller en matematisk morfologi filter11, osv., med relevante parametre at øge kontrasten.
6. segmentering af funktionen af interesse
Bemærk: Nedenstående fremgangsmåde er specifikke for den programmel anvendte (Se Materialer tabel) men andre software-pakker kan bruges i stedet. Henvise til deres brugervejledning.
- Åbn filen tomogram på Amira software i 3D Viewer-vinduet, og generere en OrthoSlice.
- I vinduet segmentering Editor skal du oprette en segmentering fil ved at vælge et nyt "label felt".
- Manuelt spore grænsen til funktionen af interesse (FOI). Følg FOI gennem alle tomogram skiver. For det andet FOI, oprette et nyt "materiale" og gentage den samme operation.
- Generere en overflade gengivelse ved at vælge menuen "SurfaceGen". For at visualisere den segmenterede diskenhed, skal du vælge menuen "SurfaceView". For at flytte, rotere og zoome i 3D-versionen, skal du bruge værktøjerne i 3D Viewer-vinduet.
- Automatisk segmentering, bruge Magic Wand Tool. Klik på et objekt, og justere skyderne i Display og maskering til at dække intervallet af værdier, så at det er fuldt markeret af dens funktioner.
Representative Results
I en præcis synkron kultur under 12 timer hvert lys/mørke cyklus, viser DNA mærket med Hoechst en normal ensartet fordeling i den mørke tilstand (figur 2a). Men det gradvis sammentrykker i cellen i den lyse periode, og fremstår som et bølget stang-lignende struktur (figur 2b) i slutningen af perioden lys. Endelig stangen opdeler på center (pile i fig. 2 c) og dets to dele er uddelt i datter celler (figur 2d). Efter celledeling, sammenpresset DNA forsvinder øjeblikkeligt, og DNA vender tilbage til en normal ensartet fordeling.
Når en alikvot af celler, der indeholder cellerne i den afsluttende fase af DNA jordpakning blev straks overført til et holey gitter og hurtig frosset i flydende Ethan, og gitteret frosne blev observeret af 1 MV cryo-HVEM, de interne strukturer af cyanobakterier herunder DNA, tylakoid membran lag, cellevægge og PPBs, optrådte som et øjebliksbillede på tidspunktet for nedfrysning (figur 3a). Mange celler viste forskellige DNA jordpakning i celler (hvide pile i figur 3a), og kunne være let at skelne fra normale celler (hvide pilespidser i figur 3b). Nogle udstillet en konstriktion i midten af cellerne som forventet før celledeling (gul pil i figur 3a).
I 3D Tomogrammer, kan store organeller af cellen segmenteres; cellevæg, tylakoid membran lag, DNA, og PPBs kunne skelnes (figur 4). Især var den komprimerede DNA adskilt af et særskilt hul i cytoplasmaet hvor DNA var omgivet af lav befolkningstæthed materiale og tylakoid membran lag blev fordrejet langs bølget stangen af sammenpresset DNA. Dynamiske opførsel af PPBs var nyligt observerede: i DNA komprimeret celler, mange små PPBs var set at overholde DNA, der henviser til, at de er store og færre i normale celler. Desuden, de fleste af PPBs dukkede op som par, og nogle DNA syntes at være i en proces af separation fra PPBs. Dette foreslog, at PPBs selv er opdelt i to af DNA dobbeltarbejde og funktion som leverandører af fosfat for DNA-syntese.
Figur 1. Cryo-EM billeder af ice-embedded normale cyanobakterier, S. elongatus PCC 7942 på forskellige accelererende spændinger. en) 200kV og b) 1000kV. Skalalinjen = 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fluorescens mikroskopi af cyanobacterium S. elongatus celler. Efter synkron kultur under 12 time hver lys/mørke cyklusser, blev celler farves med Hoechst 33342. (a) celler efter 2 h af udbruddet af den mørke tilstand vise ensartet DNA mærkning. DNA i mange celler gradvist kondenseret i den lyse periode. I sidste ende dannede en tykke bølget stang (b) typisk for DNA jordpakning. Efter denne fase, de komprimerede DNA strukturer hurtigt opdelt på deres Centre (pilespidser) under celledeling (c), og de to fragmenter adskilles i datter celler (d). Til datterceller vendte tilbage til ensartet DNA mærkning igen i den mørke periode. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cryo-HVEM billede af cyanobakterier indlejret i amorfe ice. (a) viser et raw-billede på 0 ° tilt. Billeder blev taget i slutningen af perioden lys. Nogle celler Vis bølget stavformet DNA organer svarende til eukaryote kondenseret kromosomer (hvide pile). I normale celler udviser cyanobakterier en mærkbar DNA struktur i cytoplasma (hvid pilespidser). Nogle udviser en konstriktion i midten af celler som forventet før celledeling (gul pil). (b) xy-, xz, yz-skiver af en 3D tomogram. Gul stiplede linjer viser krydsene med skiver. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ultrastruktur af celler, der indeholder komprimeret DNA. De vigtigste bestanddele er segmenteret: cellevæg (lyse gule), tylakoid membraner (rød) og DNA (blå). (a) viser en z-skive af en 3D tomogram. (b) alle segmenter. Konstriktion angiver celleseparering vises i midten af cellen (pil). PPBs er modelleret som gul eller orange kugler; hver orange sfære repræsenterer modstykke til den nærmeste gul kugle. Skalalinjen = 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har præsenteret en sekvens af protokoller til at visualisere forbigående DNA jordpakning i cyanobakterier. Det grundlæggende koncept er svarer til korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM)12. Derudover i denne metode, blev live cyanobakterier overvåget af Fluorescens mikroskopi, hurtigt frosset på EM gitre og direkte visualiseret med højspænding cryo-elektron tomografi. Som en første ansøgning, den detaljerede struktur af DNA komprimeret bakterieceller var med held visualiseret i 3D. I øjeblikket, denne procedure er specifik for dette emne, men det vil blive anvendt mere udførligt med modificerede metode i nogle tilfælde. Her, diskuteres fordelene, begrænsningerne og de fremtidige muligheder for denne metode.
En af fordelene ved denne metode er den 3D visualisering af hele cellen. 1 MV HVEM visualiseret med held dynamiske struktur af de subcellulært organeller i DNA komprimeret celler. Fine strukturen inde i normale celler kunne dog ikke skelnes på grund af lav billedets kontrast. Stigende uelastisk og flere spredning i tyk prøver slører billedet13. Nul-tab og mest sandsynlige tab billede med et filter for energi kan forbedre billedets kontrast ved at reducere inelastic spredning14,15, men det vil ikke arbejde nemlig prøver tykkere end iMFP. De nul-tab og mest sandsynlige tab peaks falde drastisk med modellen tykkelse. Det er særlig vanskeligt at opnå en tilstrækkeligt signal-støj-forholdet for elektron følsomme is-embedded-enheder. Murata et al. har vist at 1MV scanning transmission mikroskopi (STEM) giver højere billedkontrast end en lysfelt billede i plast indlejret gærceller med 5 µm tykkelse, hvor billedets kontrast er primært givet ved amplitude kontrast13 . Det forventes dog, at effekten af afsmittende skader på højere accelereret elektroner skaber en anden begrænsning til bestråling dosis for skader-følsomme cryo-prøver16. Anvendelsen af Volta og Zernike fase plader17,18 for HVEM kan muligvis reducere afsmittende skade ved at reducere den samlede dosis i fremtiden. En anden begrænsning til bruger HVEM for tyk enheder kommer fra det faktum, at de bruger faciliteter, der giver HVEM er knappe på verdensplan.
Ved hjælp af en alternativ metode til at observere tyk prøver, cryo-STAMCELLER tomografi på 300 har kV demonstreret høj kontrast billeder på frosne-hydreret prøver med tykkelse over flere hundrede nanometer19. For at hente fasekontrast i cryo-STAMCELLER, er elektronmikroskopi pthychographic også blevet indført, hvor den fase plade i kondensatoren linse gennemfører en fase-moduleret diffraktion til en pixeleret 2D detektor20. Billederne er hentet ved beregning ud fra flere diffractions. For direkte og hurtig 3D cryo-billeddannelse af store indfødte frosne prøver, cryo-FIB-SEM kan også være brugt21, hvor seriel skæring med en fokuseret ion stråle og blokere ansigt billeddannelse anvendes til billedbehandling fuldt hydreret frosne prøver. Selv om disse teknologier udvide rækken visning af biologiske prøver, det er svært at finde destinationsplaceringen af bakterier, fx mærket bakterier, fordi målet er fuldstændig under isen og kan ikke identificeres før trimning.
DNA jordpakning producerer en tydelig struktur i cyanobakterier. DNA komprimeret celler kan let adskilles selv uden at være farvet på grund af en stor tæthed bias i celler, der ikke er til stede i normale celler. For at visualisere flere lokale arrangementer inden for cellen, er det imidlertid nødvendigt at overføre fluorescently mærket ROI i elektron mikroskop. For korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM), er lysmikroskop og elektronmikroskop billeder generelt korreleret med fluorescerende latex perler eller quantum dots på EM finder gitre12. De mærkning partikler skal være af høj electron density ud over fluorescens. De kan præcist og pålideligt korrelere positioner mellem de to billeder. Desuden bekræfter området mærket med cryo-lys mikroskopi, kan komplet overlapning af ROI opnås mellem de to mikroskoper. Når kendetegner mere detaljerede strukturelle begivenheder i DNA jordpakning, bliver disse partikler og cryo-lys mikroskop et uundværligt redskab for en mere robust og nøjagtig korrelation i fremtiden.
Denne artikel viser, hvordan til at karakterisere den forbigående struktur af DNA jordpakning i cyanobakterier ved en kombination af synkron kultur, Fluorescens mikroskopi og højspænding cryo-elektron tomografi. Denne protokol fokuserer på observation af sammenpresset DNA. Ved at kombinere denne metode med andre nye teknologier, der er nævnt ovenfor, det vil være muligt at undersøge processen med DNA jordpakning nærmere og passende modificeret metoder er almindeligt gældende på andre dynamiske strukturelle begivenheder i bakterier.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takke Tammo Reisewitz for kritisk læsning af manuskript, og både Mako Hayashi og Sayuri Hagiwara for omhyggelige dyrkning og observation af cyanobakterier, Yoshitaka Kimori til billedbehandling, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki og Miyoko Nagayoshi for at hjælpe med segmentering af strukturer. Dette arbejde blev støttet af den kollaborative studiet af det nationale Institut for fysiologiske Sciences (NIP) til Y.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
| Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
| Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
| Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
| Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
| Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
| Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
| Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
| Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
| Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
| EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
| Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
| Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
| TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
| Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
| BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
| Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
| Electron films | Kodak | SO-163 | |
| Developer | Kodak | D19 | |
| Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
| Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
| Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
| Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
| High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
| Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
| plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
| Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
| Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
| Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
| flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
| Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
| Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |
References
- Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).
- Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
- Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).
- Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934 (2016).
- Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).
- Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176 (2017).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
- Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
- Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
- Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).
- Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
- Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
- Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).
- Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18 (8), 903-912 (2010).
- Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
- Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
