Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å visualisere forbigående DNA komprimeringsprosessen i Cyanobakterie. Synkron dyrking, overvåking av fluorescens mikroskopi, frysing og høy spenning cryo-elektron tomografi brukes. En protokoll for disse metodene er presentert, og fremtidige programmer og utviklingen er diskutert.
Abstract
Denne protokollen beskriver hvordan å visualisere forbigående DNA komprimeringsprosessen i Cyanobakterie. DNA komprimering er en dramatisk cytoplasmatiske hendelse nylig funnet for å oppstå i noen Cyanobakterie før celledeling. Store cellestørrelsen og forbigående karakter er det imidlertid vanskelig å undersøke strukturen i detalj. For å overvinne vanskelighetene, først er DNA komprimering reproduserbar produsert i cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 av synkron kultur med 12 h hver lys/mørke syklus. Andre er DNA komprimering overvåket av fluorescens mikroskopi og fanget av frysing. Tredje detaljert strukturen av DNA komprimert celler er visualisert i tre dimensjoner (3D) av høyspent cryo-elektron tomografi. Disse metodene er allment gjeldende undersøke forbigående strukturer i bakterier, f.eks celledeling, kromosom segregering, phage infeksjon osv., som er overvåket av fluorescens mikroskopi og direkte visualisert ved Cryo-elektron tomografi på riktig tidspunkt.
Introduction
DNA komprimering er en dramatisk cytoplasmatiske hendelse som er identifisert i noen Cyanobakterie. Når Synechococcus elongatus ble kultivert under 12 h hver lys/mørke syklus, DNA arbeidsøkt kondensert lys periode, som var klart forskjellig fra utseendet på den andre gangen poeng1. Det har blitt foreslått at denne prosessen kontrolleres av en circadian klokke basert på Kai proteiner2. Seki et al. har rapportert at DNA med Hoechst 33342 var komprimert i S. elongatus celler mot slutten av lys perioden og viste en bølget rød-figur under fluorescens mikroskop. Komprimerte DNA deretter delt i to på midten av stangen som cellen delt, og til slutt tilbake til en normal uniform fordeling i hver datter celle3. Imidlertid hindret sin forbigående natur og store størrelse elektronmikroskop strukturelle analysen. Murata et al. kombinert flere metoder, inkludert synkron kultur, fluorescens mikroskopi, frysing og høy spenning elektron cryo-tomografi (cryo-HVET), og identifisere strukturen i forbigående DNA komprimering, inkludert the kinetics av polyphosphate organer (PPBs)4. Manuskriptet gir visuell forklaring av slik et vanskelig materiale i detalj ved å kombinere de eksperimentelle prosedyrene.
S. elongatus har en kapsel form, en lengde på 2 til 5 µm og en bredde på om 0,5 µm perfekt DNA komprimeringsprosessen vises i levende celler for en svært kort tid. Derfor var strukturelle endringer forekommer i cyanobacterial DNA komprimeringsprosessen ukjent i detalj. For å undersøke disse strukturene av elektronmikroskop, er det nødvendig å overvinne to viktigste tekniske problemer. En er observasjon av slike en tykk prøven av hele på nær innfødt forhold, og den andre er rask fiksering av en dynamisk struktur. For det første problemet avhenger uelastisk betyr gratis banen (iMFP) av elektroner akselererende spenningen av elektronmikroskop5. I en girkasse elektron mikroskop (TEM) på 300 kV, det er 350 nm. For eksempel når en is-innebygd cyanobacterium (prøven tykkelse ≈ 600 nm) er observert i 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), strukturer inne cellen er vanskelige å observere. I motsetning 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) kan gi og bilde av cytoplasma i cellen (figur 1). I denne protokollen, som en del av løsningen, høyspenning elektron mikroskop (HVEM) med en akselererende spenning på 1 MV var ansatt. Men er fasiliteter som implementerer HVEM begrenset verden. Mulige alternative løsninger er også diskutert under diskusjon. Det andre problemet ble løst ved cryo-elektronmikroskop (cryo-EM). Dette er et kraftig verktøy for å visualisere dynamiske strukturer på nær innfødt forhold, hvor prøven er raskt frosset i flytende etan bruker en rask frysing enhet, og frosne øyeblikket er direkte observert med et minimum av modifikasjoner6. Kombinere med tomografi, kan et øyeblikksbilde av tredimensjonale (3D) strukturer bli rekonstruert fra tilt serie7. I dette eksperimentet, DNA komprimering ble gjengitt i S. elongatus bruker synkron kultur under 12 h hver lys/mørke syklus, og tidspunktet for frysing av prøven ble bestemt av overvåking under fluorescens mikroskop.
Metodene som er beskrevet her er allment gjeldende til studiet av dynamiske strukturer i bakterielle celler, f.eks celledeling, kromosom segregering og phage infeksjon, og har et potensial til å åpne nye muligheter i mikrobiologisk forskning.
Protocol
1. synkron kulturen i Cyanobakterie
- Kultur S. elongatus PCC 7942 på sterilisert BG 11 plate (i en 9 cm steril plast Petriskål) inneholder 1,5% (w/v) agar og 0,3% (w/v) natrium tiosulfat8.
- Plassere platene i en vekst kammer på 23 ° C med lav intensitet av 50 µE/m2/s med 12 h lys/12 h mørke sykluser.
- Overføre cellene på fersk BG11 agar plater en gang i uken.
Merk: Kulturer på agar vises som grønne band av aktivt voksende celler etter en uke under denne kultur-tilstanden. - Ta grønne klumper av celler med en flamme sterilisert wire loop og strek cellene på en fersk BG11 agar tallerken. Gjøre dette på en ren benk.
2. overvåking av fluorescens mikroskopi
- Bruke celler kultivert på agar plate for 6 dager for å observere DNA komprimering. Samle celler fra platen på slutten av lys perioden av helle 1 mL av 0,2 M sucrose løsning over cellene. Gjenta helle løsningen på cellene slik at de fleste cellene samles. Overføre suspendert-celle løsningen til et mikro rør for DNA flekker.
- Legge til DNA flekker fargestoff (f.eks Hoechst 33342) løsning på 500 µL av suspendert celle løsningen i et mikro rør til en siste konsentrasjon av 1 µg/mL. Så, holde røret i mørket 10 min.
- Sentrifuge for 1 min 2000 x g til sediment cellene. Forkaste nedbryting og legge 10 µL av 0,2 M sucrose løsning å oppnå en tett celle suspensjon.
- Overføre 1 µL av løsningen som inneholder farget celler til et lysbilde glass, sette en cover slip og observere med fluorescens mikroskop utstyrt med en UV-filter med en linsen med en forstørrelse på 100 X og neddyppingsolje.
- Bekrefte at DNA-komprimering er observert på dette punktet i de fleste cellene og deretter forberede prøven neste frysing trinn.
3. eksempel frysepunktet for Cryo-HVET
- Definere en spranget-underkjølt enhet. Fyll tanken med flytende nitrogen og starte kjøling cryo-kammeret etter koble tanken og kammer med en Teflon rør.
- Fylle flytende etan i en liten cupper pott inne i kammeret etter nedkjøling kammeret til flytende nitrogen temperatur. Briller under drift, fordi flytende etan er eksplosiv.
- Glød utslipp karbon-siden av en holey karbon-belagt EM rutenett (holey rutenett) for 30 s 50 mA bruker en plasma ion bombarder.
- Bruke 1 µL av BSA gull tracer (15 nm) til holey rutenettet som en fiducial markør.
- Bruke en 2,5 µL aliquot celler i DNA komprimering scenen i holey rutenettet. Blot av overflødig løsningen med filter papir. Stupe rutenettet i flytende etan bruker en plunger spranget frysing enheten umiddelbart.
- Lagre frosne rutenettene i flytende nitrogen oppbevaring før de er undersøkt.
4. Cryo-HVET
- Definere HVEM på en høy spenning av 1 MV.
- Montere frosne rutenettet i en cryo-prøveholder for HVEM forkjøles og lagres i-150 ° c med flytende nitrogen i cryo-arbeidsstasjonen, og laste det inn på HVEM. Være forsiktig for å unngå forurensning av is.
- Merke et tenkelig område på forstørring av 1 000 X. Juste eucentric z høyden.
- Tilt prøven scenen til 60 ° og fjerne tilbakeslag av tilting rotasjon.
- Justere fokus nær målplasseringen ved en forstørrelse på 10 000 X. Angi en under fokus på 6 til 10 µm ved avvik fra fokusert bildet. Bildebehandling, satt dosen til 2 e-/Å-2 eller mindre på prøven på forhånd.
- Måle elektron dosen av nåværende tetthet på skjermbildet bildet i HVEM. Ta et bilde på et elektron film eller digitalt kamera på samme forstørrelse som i fokus prosessen.
- Innhente tilt bilder manuelt ved samme prosedyre som (4.5) fra-60 ° til + 60 ° på en tilt vinkel økning av 2 ° til 4 °.
Merk: I mange moderne elektron mikroskop, oppkjøpet av tilt serien er automatisert av kombinasjonen av et digitalt kamera. I så fall Følg bruksanvisningen. For negative filmer, utvikle filmene i 12 min ved 20° C i en utvikler tank med en full-styrke utvikler og fikse i en bestemt for 10 min. digitalisere filmer med en oppløsning på 4000 dpi (0.635 nm/bildepunkt på bildet) med en planskanner. I et digitalt kamera, underlagt samlet bildene direkte til neste bilde prosessering trinn. Eventuelt redusere bildestørrelsen ved et median filter på to til fire binning (størrelse reduksjon faktor) og riktig programvare (f.eks ImageJ).
5. tomographic rekonstruksjon
- Gjøre en stabel bildefil fra individet vippe bilder ved hjelp av kommandoen "tif2mrc" eller "newstack" i IMOD programvare9.
- Start eTomo GUI programvare i IMOD og angi bildeparametere: pikselstørrelsen, fiducial diameter, Bilderotering, etc. Deretter opprette skript.
- Kjøre enkelte programmer etter programvare som vises i tabellene av materialer, der tilt serien justeres med fiducial markører (med en mener restoljen feil mindre enn 0,5). Endelig rekonstruere en 3D tomogram ved hjelp av SIRT algoritmen i IMOD.
- Trekke ut et område av interesse (ROI) fra tomogram og støyfjerning bruke filtere denoise: en Anisotrop diffusjon filter i IMOD, bilaterale filtere i EMAN10eller en matematisk morfologi filtrere11, etc., med aktuelle parametere for å øke kontrasten.
6. segmentering av funksjonen rundt
Merk: Fremgangsmåten nedenfor gjelder den programvaren som brukes (se Materialer tabell), men andre programvarepakker kan brukes i stedet. Se deres brukerhåndboken.
- I 3D Viewer-vinduet, åpne filen tomogram på Amira programvare og generere en OrthoSlice.
- I vinduet segmentering Editor kan du opprette en segmentering fil ved å velge en ny "etikettfeltet".
- Manuelt spor grensen til funksjonen av interesse (FSM). Følg FOI gjennom alle tomogram skiver. For det andre FOI, opprette en ny "materiale" og gjentar den samme operasjonen.
- Generere en overflate gjengivelse ved å velge "SurfaceGen"-menyen. Velg "SurfaceView" for å visualisere segmentert volumet. Hvis du vil flytte, rotere og zoome inn 3D-volumet, kan du bruke verktøyene i 3D visningsvinduet.
- Bruk Magic Wand verktøyet for automatisk segmentering. Klikk på et objekt, og justerer skyvekontrollene i displayet og maskering for å dekke verdiområdet slik at objektet er fullt merket av dens funksjoner.
Representative Results
I en presis synkron kultur under 12 h hver lys/mørke syklus, viser DNA merket med Hoechst en vanlig uniform fordeling i mørke tilstand (figur 2a). Men det gradvis komprimerer i cellen i lys perioden, og vises som en bølget rød-lignende struktur (figur 2b) på slutten av lys perioden. Endelig stangen deler på center (piler i figur 2 c) og to deler er fordelt på datter cellene (figur 2d). Etter celledeling, komprimerte DNA forsvinner umiddelbart og DNA tilbake til en normal uniform fordeling.
Når en aliquot av celler som inneholder cellene i sluttfasen av DNA komprimering ble umiddelbart overført til et holey rutenett og rask frosset i flytende etan, og frosne rutenettet ble observert av 1 MV cryo-HVEM, de interne strukturene i Cyanobakterie inkludert DNA, thylakoid membran lag, celle vegger og PPBs, dukket opp som et statisk utvalg ved frysing (figur 3a). Mange celler viste tydelig DNA komprimering i cellene (hvite pilene i figur 3a), og kunne lett skjelnes fra normale celler (hvit pilspisser i figur 3b). Noen utstilt en innsnevring på midten av cellene som forventet før celledeling (gul pil i figur 3a).
I 3D tomograms segmenteres store organeller cellen; cellen vegg, thylakoid membran lag, DNA og PPBs kunne skilles (Figur 4). Spesielt var komprimerte DNA atskilt med en distinkt gap i cytoplasma hvor DNA var omgitt av lav tetthet materiale og thylakoid membran lagene ble forvrengt langs bølgete stangen komprimerte DNA. Dynamiske oppførselen til PPBs ble nylig observert: i DNA komprimert celler, mange små PPBs ble sett å overholde DNA, mens de er store og færre i normale celler. Dessuten, de fleste av PPBs dukket opp som par, og noen DNA syntes å være i en prosess med separasjon fra PPBs. Dette foreslo at PPBs selv er delt i to av DNA duplisering og funksjon som leverandører av fosfat for DNA-syntese.
Figur 1. Cryo-EM bilder av is-innebygd normal Cyanobakterie, S. elongatus PCC 7942 med forskjellige akselererende spenninger. a) 200kV og b) 1000kV. Skala bar = 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fluorescens mikroskopi av cyanobacterium S. elongatus celler. Etter synkron kultur under 12 timer hver lys/mørke sykluser, var celler farget med Hoechst 33342. (a) celler etter 2 timer med utbruddet av mørke Vis uniform DNA merking. DNA i mange celler kondensert gradvis i lys perioden. Til slutt dannet en tykk bølgete stang (b) typisk for DNA komprimering. Etter dette stadiet, de komprimerte DNA-strukturene raskt delt på sine sentre (pilspisser) under celledeling (c), og to fragmenter adskilt datter celler (d). Datter cellene tilbake til uniform DNA merking igjen i mørke perioden. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cryo-HVEM bildet av Cyanobakterie innebygd i amorfe ice. (a) viser et raw-bilde på 0 ° tilt. Bildene ble tatt på slutten av lys perioden. Noen celler viser bølgete stav-formet DNA organer ligner eukaryote kondensert kromosomene (hvite piler). I normale celler viser Cyanobakterie en synlig DNA struktur i cytoplasma (hvit pilspisser). Noen viser en innsnevring på midten av cellene som forventet før celledeling (gul pil). (b) xy, xz, yz-skiver av en 3D tomogram. Gul prikkete linjene viser kryss av skiver. Skala bar = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Ultrastructure av celler som inneholder komprimerte DNA. Hovedkomponentene er segmentert: cellevegg (gule), thylakoid membraner (rød) og DNA (blå). (a) viser en z-bit av en 3D tomogram. (b) alle segmenter. Innsnevring indikerer celle separasjon vises i midten av cellen (pil). PPBs er modellert som gule eller orange kuler; hver oransje kule representerer motstykket til den nærmeste gul kulen. Skala bar = 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi har presentert en rekke protokoller for å visualisere forbigående DNA komprimering i Cyanobakterie. Det grunnleggende konseptet er lik som correlative lys og elektronmikroskop (CLEM)12. I tillegg i denne metoden, ble live Cyanobakterie overvåket av fluorescens mikroskopi raskt frosset på EM rutenett og direkte visualisert med høy spenning cryo-elektron tomografi. Som et første program, detaljert strukturen av DNA komprimert bakterieceller var vellykket visualisert i 3D. Foreløpig denne prosedyren gjelder dette emnet, men det brukes mer omfattende med endret metodikk i noen tilfeller. Her, blir fordelene og begrensningene fremtidens muligheter av denne metoden diskutert.
En av fordelene med denne metoden er 3D-visualisering av hele cellen. 1 MV HVEM er visualisert dynamisk oppbygning subcellular organeller i DNA komprimert celler. Men kan den fine strukturen innenfor normale celler ikke skilles på grunn av lav bildekontrasten. Øke uelastisk og flere spredning tykk prøver gjør uskarpt bilde13. Zero-tap og mest-mulig-tap bilde filtrering av en energi-filteret kan forbedre kontrasten i bildet ved å redusere inelastic spredning14,15, men fungerer ikke for prøver tykkere enn iMFP. Zero-tap og mest-mulig-tap toppene redusere drastisk med prøven tykkelse. Det er spesielt vanskelig å få en tilstrekkelig signal-til-støy-forhold for elektron følsom is-embedded prøver. Murata et al. har vist at 1MV skanning overføring mikroskopi (STEM) gir høyere image kontrast enn en lysende felt bildet i plast innebygd gjærceller med 5 µm tykkelse, hvor image kontrasten er hovedsakelig gitt av amplituden kontrast13 . Men er det forventet at effekten av knockout skade på høyere akselerert elektroner skaper en annen begrensning til bestråling dose skade-sensitive cryo-prøver16. Anvendelsen av Volta og Zernike fase plater17,18 for HVEM kunne redusere knockout skade ved å redusere den totale dosen i fremtiden. En annen begrensning å bruke HVEM for tykk prøver kommer fra det faktum at de bruker fasilitetene som gir HVEM er knappe over hele verden.
Bruke en alternativ metode for å observere tykk prøver, cryo-STAMMEN tomografi på 300 har kV vist høy kontrast bilder på frosset og hydratisert prøver med tykkelse over flere hundre nanometer19. For å gjenerverve kontrast i cryo-STAMMEN, blitt elektronmikroskop pthychographic også innført, som fase platen i kondensatoren linsen transposes en fase-modulert Diffraksjon til en pixelated 2D detektor20. Bildene er hentet ved beregning fra flere diffractions. Direkte og rask 3D cryo-imaging av store innfødte frosne prøvene, cryo-FIB-SEM kan også være brukt21, hvor føljetong snitting med en fokusert ion strålen og blokkere ansikt imaging brukes for bildebehandling fullt hydrated frosne prøvene. Selv om disse teknologiene utvide området visning av biologiske prøver, er det vanskelig å finne målplasseringen av bakterier, f.eks merket bakterier, fordi målet er helt under isen og kan ikke identifiseres før beskjæring.
DNA komprimering produserer en distinkt struktur i Cyanobakterie. DNA komprimert celler er lett selv uten å bli misfarget på grunn av en stor tetthet skjevhet i cellene som ikke finnes i normale celler. Men for å visualisere mer lokale arrangementer i cellen, er det nødvendig å overføre fluorescently merket Avkastningen til elektronmikroskop. Correlative lys og elektronmikroskop (CLEM), er lys mikroskop bilder og elektronmikroskop bilder vanligvis korrelert med fluorescerende latex perler eller kvante prikker på EM finder rutenett12. Etiketteringsmaskiner partikler må være av høy elektron tetthet i tillegg til fluorescens. De kan nøyaktig og pålitelig sammenligne stillingene mellom de to bildene. Videre, ved å bekrefte merket området med cryo-lys mikroskopi, fullstendig overlapping av Avkastningen kan oppnås mellom de to mikroskop. Når karakterisere mer strukturelle hendelser i DNA komprimering, vil disse partikler og cryo-lys mikroskop bli et uunnværlig verktøy for en mer robust og nøyaktig sammenheng i fremtiden.
Denne artikkelen viser hvordan å karakterisere forbigående strukturen i DNA komprimering i Cyanobakterie av en kombinasjon av synkron kultur, fluorescens mikroskopi og høy spenning cryo-elektron tomografi. Denne protokollen fokuserer på observasjon av komprimerte DNA. Ved å kombinere denne metoden med andre nye teknologier som nevnt ovenfor, vil det være mulig å undersøke prosessen med DNA komprimering nærmere, og passende endrede metoder er vidt gjelder andre dynamiske strukturelle hendelser i bakterier.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Tammo Reisewitz for kritisk lesing av manuskriptet, og både Mako Hayashi og Sayuri Hagiwara for forsiktige dyrking og observasjon av Cyanobakterie, Yoshitaka Kimori for bildebehandling, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki og Miyoko Nagayoshi for å hjelpe med segmentering av strukturer. Dette arbeidet ble støttet av programmet for samarbeidende studie av National Institute for fysiologiske Sciences (NIPS) til Y.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 346-07951 | 1mg/mL in H2O |
| Agar Powder (for plant culture) | Wako | 016-11875 | |
| Boric acid | Wako | 027-02192 | 99.5% |
| Manganese chloride tetrahydrate | Wako | 139-00722 | 99% |
| Zinc sulfate heptahydrate | Wako | 264-00405 | 99.5% |
| Sodium molybdate | Wako | 196-02472 | 99% |
| Copper sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | 99.5% |
| Cobalt nitrate hexahydrate | Wako | 031-03752 | 99.5% |
| Sodium nitrate | Wako | 191-02542 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Wako | 131-00405 | 99.5% |
| Calcium chloride dehydrate | Wako | 031-00435 | 99.5% |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | 98% |
| EDTA-2Na | Dojindo | 343-01861 | 99.5% |
| Sodium carbonate | Wako | 197-01581 | 99.8% |
| Potassium phosphate dibasic | Wako | 164-04295 | 99% |
| TES (Good’s buffer) | Dojindo | 344-02653 | 99% |
| Ferric ammonium citrate | Wako | 092-00802 | 1st Grade |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Wako | 197-03585 | 99% |
| BSA gold tracer 15nm | Aurion | 215.133 | |
| Quantifoil EM grid | Quantifoil MicroTools | R3.5/1 Copper grid | |
| Electron films | Kodak | SO-163 | |
| Developer | Kodak | D19 | |
| Fixer | Kodak | Rapid fixer | Solution |
| Filter paper | Whatman | Grade 1 | |
| Growth chamber | NKsystem | LH-100SP | |
| Fluorescent microscope | Nikon | ECLIPSE 50i | |
| High voltage TEM | HItachi | H1250M | |
| Cryo-specimen holder for HVEM | Gatan | ||
| plunge-freezing device | Leica | EM CPC | |
| Plasma Ion bombarder | Vacuum device | PIB-10 | |
| Liquid nitrogen storage | Taylor-Wharton | 25LDB | |
| Developing tank | Dosaka EM | TB-3-75 | |
| flatbed scanner | Nikon | Coolscan 9000ED | |
| Segmentation software | FEI | Amira | https://www.fei.com/software/amira |
| Tomographic Reconstruction software | eTOMO | http://bio3d.colorado.edu/imod |
References
- Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).
- Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
- Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).
- Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934 (2016).
- Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).
- Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176 (2017).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
- Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
- Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
- Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).
- Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
- Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
- Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).
- Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18 (8), 903-912 (2010).
- Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
- Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
