Negativa fläcken EM är en kraftfull teknik för att visualisera makromolekylära struktur, men olika färgning tekniker kan ge varierande resultat på ett prov sätt. Här beskrivs flera negativa färgning metoder i detalj för att ge en inledande arbetsflöde för att ta itu med visualisering av utmanande system.
Negativa fläcken elektronmikroskopi (EM) tillåter relativt enkel och snabb observation av makromolekyler och makromolekylärt komplex med hjälp av kontrast öka fläcken reagens. Även om begränsade i resolution till maximalt ~ 18-20 Å, negativa fläcken EM är användbar för en mängd biologiska problem och ger också en snabb hjälp att bedöma prover för cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Det negativa fläck arbetsflödet är enkel metod; provet är adsorberas på ett substrat, då en fläck är tillämpas, utplånas, och torkas för att producera ett tunt lager av elektron tät fläcken där partiklarna är inbäddade. Enskilda prover kan dock uppträda på markant olika sätt under varierande färgning villkor. Detta har lett till utvecklingen av en stor mängd substrat tekniker för beredning, negativ färgning reagenser och rutnät tvätt och läska tekniker. Att bestämma den mest lämpliga tekniken för varje enskilt prov måste göras på grundval av fall och en botaniker måste ha tillgång till en mängd olika tekniker för att uppnå högsta kvalitet negativt fläcken resultat. Detaljerade protokoll för två olika substrat beredningsmetoder och tre olika blotting tekniker och visas ett exempel av ett prov som visar markant olika resultat beroende på vilken metod som används. Dessutom beskrivs beredning av vissa gemensamma negativa färgning reagenser och två nya Lanthanide-baserade fläckar, med diskussion om användningen av varje.
Trots senaste uppmärksamhet till resolutionen fläcken revolutionen som följd av betydande framsteg i cryo-elektron mikroskopi1 (cryo-EM), negativa EM förblir en kraftfull teknik och en avgörande del av elektron microscopists’ verktygslåda. Negativ färgning är fortfarande den bästa metoden för snabb bedömning av ett prov innan optimera cryo-grid villkor2. Hög kontrast och hastigheten på rutnätet beredning av negativa färgade prover gör den idealisk för att bedöma provet renhet, koncentration, heterogenitet och konfirmerande flexibilitet3. Många biologiskt informativ strukturer har resulterat från negativa fläcken rekonstruktioner, trots teknikens upplösning begränsas till ~ 18 Å upplösning4,5,6, och några prover ger bättre resultat i fläcken än cryo-EM för en mängd skäl7.
I negativa fläcken EM, är partikeln sevärdheter adsorberas på ytan av ett EM rutnät och omsluten av en amorf matris av elektron tät fläcken förening. En hög relativ kontrast produceras mellan bakgrunden och partikeln av intresse, med partikeln är mindre tät elektron än den omgivande fläck8. Partiklarna visas som ljusa områden på grund av deras låga elektron scattering makt i förhållande till täta omgivande fläcken, som skingrar elektronerna mer och visas mörkare. Substructural funktioner av partiklar kan härledas från en detaljerad granskning av resulterande bilder eftersom fläcken kommer att tränga in i varje skreva och producera oregelbundna kontrast detalj9.
Negativ färgning processen börjar med utarbetandet av ett stöd substrat som provet partiklarna fångas och lagret av torkade fläcken stöds. Vanligaste stöd substratet är ett lager av amorft kol, ibland stöds av ett tunt lager av polyvinylklorid (e.g. Formvar) eller nitrocellulosa (e.g. kollodium) polymer. Dessa substrat kan köpas kommersiellt eller förberett internt med de protokoll som beskrivs nedan.
När stöd substratet bereds, provet kan tillämpas och den överflödig lösningen utplånas. Prover bör upphöra i en lämplig buffert för negativ-färgning. Det är bäst att undvika användning av fosfatbuffert och hög salt koncentrationer, som kan ge upphov till kristallina fällningar som kan skymma preparatet. Reduktionsmedel, rengöringsmedel, sackaros, glycerol och höga koncentrationer av nukleotid bör också undvikas eftersom de påverkar också fläcken kvalitet4. När bufferten sammansättning kan inte ändras, tvätta ytan av rutnätet EM med vatten eller en mer lämplig buffert efter adsorption och före färgning kan minska bildandet av buffert relaterade artefakter och generellt förbättra fläck bakgrunden. Om buffert artefakter misstänks, kan det vara informativt att färga ett buffert-endast rutnät för att avgöra om buffert komponenterna är källan till de observerade artefakterna.
Efter provet adsorberas, och utplånas och tvättas vid behov, används en färgning reagens. En mängd reagens har visat sig vara effektiva negativa fläckar (tabell 1), men fläcken måste väljas för att passa provet. En ‘halo’ fläck former runt partikeln på grund av både förskjutningen av fläcken molekylerna av hydrofoba regionerna av protein och repulsion av laddade grupper. Fläcken måste därför väljas så att den protonation staten i några potentiella laddade grupper på proteinet är samma som fläcken på arbetande pH. Motsatta laddningar på ytan av proteinet kan bidra till en positiv färgning effekt, som trots en användbar teknik i sin egen rätt10 inte är omfattas av detta papper. De vanligaste negativa färgning reagenserna är uranyl acetat och uranyl formate. Dessa fläckar har en relativt fin kornstorlek (4-5 Å)9 och ge högre upplösning bilder över andra fläckar såsom phospho-wolframater (8-9 Å kornstorlek)9,11, ammonium molybdat11och några lanthanide-baserade fläckar12. Uranyl acetat och formate också fungera som ett fixativ, bevara många protein-protein interaktioner på en millisekund tid skala13, även om fläcken och dess benägenhet att fällningen vid Fysiologiskt pH lågt pH kan vara skadlig för vissa prover14 . Trots deras nytta presentera uranyl saltar också logistiska utmaningar som de är både giftig och milt radioaktivt, vilket kan kräva särskild hantering, lagring, och bortskaffande krav, vilket leder vissa användare att söka icke-radioaktiva alternativ.
Det finns en stor mängd olika metoder beskrivs för substrat förberedelse, exempelprogrammet och färgning av EM rutnät. Den lämpligaste metoden att använda är provet beroende och kan vara svårt att fastställa när du hanterar ett nytt system. Detta manuskript beskriver två metoder för substrat beredning och tre blotting metoder; sida blotting, snärta5och snabb spolning15. Sida-analys är den enklaste av de metoder som beskrivs. Både metoden snärta och snabba bokföringsmetoden är svårare att genomföra men begränsa kontakttiden av provet med stöd filmen innan fixering och har visat sig lindra bildandet av fläcken artefakter för vissa prover5. Målet med detta manuskript är således att ge en inledande arbetsflöde för att ta itu med visualisering av utmanande system av negativ-fläcken EM.
Detta manuskript beskrivs flera metoder för negativ färgning av prover för elektronmikroskopi med hjälp av olika färgning reagenser, inklusive två roman lanthanide reagens (TmAc och ErAc). Många av stegen i den negativa färgning processen måste optimeras för enskilda prover inklusive valet av fläcken, mängden tvätt krävs om någon och blotting tekniken. Detta manuskript ger därmed en grund för microscopists att utveckla sina egna arbetsflöden för att hantera de negativa-färgningen av utmanande system.
Valet av fläcken är mycket prov beroende. Prover som är särskilt känsliga för lågt pH kan försämras av UA eller UF, trots dessa fläckar19fixativ egenskaper. I dessa fall baserat lanthanide fläckar såsom TmAc eller ErAc kan vara mer lämpligt, även om den övergripande pH av preparatet måste hållas under den isoelektriska punkten av proteinet prov för att förhindra positiv färgning. Detta kan åstadkommas genom försurande fläcken med ättiksyra vid behov. För särskilt lågt pH känsliga prover, kan anjoniska volframhaltigt eller molybdat fläckar vara mer effektiva. Även om dessa fläckar har hittats inducera bildandet av artefakter i vissa fall, såsom bildandet av rouleaux i lipoprotein prover20. Igen, pH-värdet i fläcken kan behöva justeras, denna gång till ovanför den isoelektriska punkten av provet, förhindra positiv färgning.
Tvätt av provet före färgning kan behövas om bufferten där preparatet underhålls har en hög salt- eller fosfathalter komponent. I många fall tvätt kan utföras med ultrarent vatten men för mer känsliga prover, som kan försämra eller genomgår strukturella förändringar när de utsätts för enbart vatten, tvätt kan behöva utföras med flyktiga buffert av låg jonstyrka8. Även under noggrant kontrollerade förhållanden, kan tvätt resultera i vissa strukturella rearrangering på kol yta21.
Metoden som ett rutnät är beredd när det gäller prov adsorption, blotting och färgning kan också påverka vad som observerats. Den lämpligaste metoden är således igen, mycket prov beroende. C-protein, till exempel noteras som en klotformig ringliknande struktur efter sida-blot färgning, men detta verkar vara en artefakt av färgning processen, som avslöjas när galler är beredda av metoden snärta (eller av den snabba bokföringsmetoden) (figur 3 ). I de snabba och snärta bokföringsmetoder, den tid provet att interagera med kolet stödytor före fixering är minimerade15. Provet erfarenheter också färre krafter från den vikande menisken på blotting före fixering. Detta innebär att strukturella förändringar i preparatet som kan uppstå vid långvarig absorption tid på carbon film eller genom kapillärkraften minimeras. Snabb bokföringsmetoden kan också användas för tid-löst analys av prover. Provet kan blandas med en ligand eller tillsats inom en pipettspetsen för en uppsättning under en tid innan ansökan till ett rutnät eller endast tillfälligt på rutnätet ytan före fixering inom millisekunder.
Djupet av fläcken som krävs för att ge optimala bilder av ett särskilt exemplar är igen prov beroende2. Om fläcken är för grunt, molekyler kan skadas av elektronstrålen men om fläcken är för tjock strukturella funktioner kan gå förlorade. Fläcken djup påverkas av flera faktorer såsom hydrophilicitet rutnät ytan, jämnhet av lagrets kol, mängden fläcken tillämpas på rutnätet, tiden fläcken är i kontakt med rutnätet före blotting, omfattningen av blotting och tid det ta KES för rutnätet till helt torra. Ett rutnät kommer aldrig att ha en jämn fördelning av fläcken i sin helhet och områden i rutnätet som är lämplig för avbildning måste därför väljas noggrant. Faktiskt, gridteknik ofta varierar i kvalitet även när tillagas samma dag på samma villkor. Ett bra exempel på hur variation i fläcken djup påverkar uppkomsten av molekyler och lämpliga fläcken djupet för imaging ges av Burgess et al5.
Trots negativ färgning att en mycket mångsidig, snabb och enkel metod, är inte alla biologiska prover mottagliga för visualisering av denna metod. Bräckliga församlingar kan kollapsa eller ta isär vid adsorption, färgning eller torkning på EM rutnät22. Negativ färgning kan också leda till utplaning av molekyler och inducera Rekommenderad riktlinjer av molekyler på kol stöd film7.
Negativa fläcken är ett värdefullt verktyg för bedömning av exemplar i sin egen rätt och även före cryo-EM analys men många av de fysiska krafterna provet uppstår under processen är dåligt känd. Därför, den bästa metoden att använda är mycket prov beroende och måste fastställas genom trial-and-error i stället för lärs ut efter ett fast protokoll.
The authors have nothing to disclose.
Vi är ytterst tacksamma för Peter Knight för bra diskussioner och kritisk granskning av manuskriptet. Vi vill tacka alla ledamöter av Neil Ranson och Stephen Muench labs och Astbury Biostructure laboratorium personal för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats av Europeiska forskningsrådet (FP7/2007-2013) ERC bevilja avtal 322408. C-protein producerades med hjälp av resurser som tillhandahålls av en brittisk hjärtat Foundation grant (BHF PG/13/83/30485). Vi tackar också Wellcome Trust för utrustning finansiering för att stödja elektronmikroskopi i Leeds (090932/Z/09/Z och 094232/Z/10/Z). CS är finansierat av Wellcome Trust ISSF bidrag.
200 mesh copper EM grids | Sigma-Aldrich | G4776-1VL | Other materials and/or mesh sizes can also be used |
Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | 277908 | |
Carbon evaporator | Ted Pella Inc. | 9620 | Cressington 208 or equivalent |
Collodion solution 2% in amyl acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | |
Dumont #5 negative pressure tweezers | World Precision Instruments | 501202 | Or other tweezers as preferred |
Erbium Acetate | Sigma-Aldrich | 325570 | |
Gadolinium Acetate | Sigma-Aldrich | 325678 | |
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. | AGAR Scientific | AGG250-1 | |
Microscope slides, white frosted | Fisher Scientific | 12607976 | Or equivalent |
Parafilm | Fisher Scientific | 10018130 | Or equivalent |
Pasteur pipette (glass) | Fisher Scientific | 10343663 | Or equivalent |
Razor blade | Fisher Scientific | 11904325 | Or equivalent |
Sandpaper | Hardware store | Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested) | |
Samarium Acetate | Sigma-Aldrich | 325872 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 | |
Sodium Phosphotungstate | Sigma-Aldrich | P6395 | |
Stainless Steel Mesh, 150×150 mm (cut to size). | AGAR Scientific | AGG252 | |
Thulium Acetate | Sigma-Aldrich | 367702 | |
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods | Ted Pella Inc. | 57-10 | Or equivalent for carbon evaporator used |
Ultra pure water | |||
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Vacuum grease | Fisher Scientific | 12719406 | Or equivalent |
Whatman #1 Filter paper. | Fisher Scientific | 1001 090 | Or equivalent |
Whatman #40 filter paper | Fisher Scientific | 10674122 | Or equivalent |