ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
부정적인 얼룩 EM 고분자 구조를 시각화를 위한 강력한 기술 이지만 다른 얼룩 기법 샘플 종속 방식에서 다양 한 결과 얻을 수 있습니다. 여기 몇 가지 부정적인 얼룩 방법은 도전 시스템의 시각화를 태 클을 위한 초기 워크플로 제공 하는 자세히 설명 되어 있습니다.
Abstract
부정적인 얼룩 전자 현미경 (EM) 고분자 및 대비 향상 얼룩 시 약의 사용을 통해 고분자 복합물의 비교적 간단 하 고 빠른 관측을 허용 한다. ~ 18-20의 최대 해상도에서 제한 되지만 Å, 부정적인 얼룩 EM 다양 한 생물 학적 문제에 대 한 유용 하 고 또한 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)에 대 한 샘플 평가의 빠른 수단을 제공 합니다. 부정적인 얼룩 워크플로 간단 방법; 샘플을 기판에 흡착 후 얼룩을 적용, 얼룩이, 그리고 건조 입자 포함 하는 전자 조밀한 얼룩의 얇은 층을 생산 하. 그러나 개별 샘플 수,, 착 조건 변화에 따라 현저 하 게 다른 방법으로 작동 됩니다. 이 기판 준비 기술, 시 약, 및 그리드 세척 하 고 기술을 blotting 얼룩 네거티브의 큰 다양성의 개발을 주도하 고 있다. 각 개별 샘플에 대 한 가장 적합 한 기술 결정에 사건-의해-사건을 기준으로 수행 되어야 합니다 그리고는 현미경 부정적인 얼룩을 최고의 품질 결과 달성 하기 위해 다른 기술을 다양 한 권한이 있어야 합니다. 두 개의 다른 기판 준비 방법 및 3 개의 다른 더 럽 히 기술에 대 한 자세한 프로토콜 제공 되 고 사용 방법에 따라 현저 하 게 다른 결과 보여 주는 샘플의 예 표시 됩니다. 또한, 몇 가지 일반적인 부정적인 얼룩 시 약, 및 2 개의 소설 란타넘족 기반 얼룩의 준비는 각각의 사용에 관한 토론으로 설명 되어 있습니다.
Introduction
해상도에 최근 관심에도 불구 하 고 혁명 cryo 전자 현미경 검사 법1 (cryo-엠), 부정적인 중요 한 발전에서 발생 하는 강력한 기술과 전자 microscopists' 도구 상자의 중요 한 구성 요소 안에 남아 얼룩. 부정적인 얼룩이 아직도 cryo-그리드 조건2를 최적화 하기 전에 샘플의 신속한 평가 위한 최선의 방법 남아 있다. 부정적인 스테인드 샘플의 그리드 준비의 속도 및 높은 대비 적합 샘플 순도, 농도,이 질, 그리고 구조적 유연성3을 평가 합니다. 많은 생물학으로 유익한 구조 ~ 18 Å 해상도4,,56을 제한 되 고 기술의 해상도도 불구 하 고 부정적인 얼룩 개조에서 결과 및 일부 샘플 더 나은 결과 얻을 에 이유7의 다양 한 곳을 알아내는-그들 보다 얼룩.
부정적인 얼룩 EM, 관심의 입자는 그들 격자의 표면에 흡착 이며 전자 조밀한 얼룩 화합물의 비정 질 매트릭스에 의해 덮여. 상대 고대비 배경과 주변 얼룩8보다 적은 전자 밀도 되 고 입자와 관심, 입자 사이 생산 됩니다. 입자는 그들의 낮은 전자 분산 전원 밀도 주변 얼룩을 없앤다 더 전자 나타나고 어두운 기준 때문에 밝은 영역으로 나타납니다. 입자의 substructural 기능 얼룩 어떤 틈새에 침투 하 고 불규칙 한 대비 세부9생산 결과 이미지의 상세한 시험에서 연 역 될 수 있다.
부정적인 얼룩 프로세스 지원 말린된 얼룩의 레이어는 캡처된 샘플 입자, 지원 기판의 준비와 시작 합니다. 가장 일반적으로 사용 되는 지원 기질 비정 질 탄소, 폴 리 비닐 (예: Formvar) 또는 (예를 들어 콜) 니트로 폴리머의 얇은 층에 의해 때때로 지원의 계층입니다. 이러한 기판 상업적으로 구입 하거나 자체 아래에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 준비 될 수 있습니다.
지원 기판 준비 후에 예제를 적용할 수 있습니다, 그리고 초과 솔루션에서 얼룩이. 샘플은 부정적인 얼룩이 지기를 위한 적당 한 버퍼에 정지 한다. 이 표본 애매 수 결정 침전을 야기할 수 있는 높은 소금 농도 및 인산 염 버퍼의 사용을 피하기 위해 좋습니다. 감소 시키는 대리인, 세제, 자당, 글리세롤, 그리고 뉴클레오티드의 높은 농도 또한 피해 야 한다 그들은 또한 얼룩 품질4에 영향을 미칠. 물으로 EM 격자의 표면 세척 버퍼 구성 변경할 수 없습니다 또는 더 적당 한 버퍼 흡착 후와 전에 얼룩을 줄일 수 있습니다 때 버퍼의 형성 관련 아티팩트 및 일반적으로 얼룩 배경 개선. 버퍼 유물을 의심 하는 경우 그것은 수 있습니다 버퍼 구성 요소 관찰의 원본 확인 하려면 버퍼 전용 그리드를 얼룩 유익.
샘플은 흡착, 얼룩이 있고 필요한 경우 세척, 착 색 시 약 적용 됩니다. 시 약의 다양 한 효과가 부정적인 얼룩 (표 1), 수 발견 되었습니다 하지만 얼룩 샘플에 맞게 선택 해야 합니다. '후광' 얼룩 형태의 입자 주위 모두 얼룩 분자의 변위로 인해 소수 성 영역에 의해 단백질의 반발에 의해 청구 그룹. 따라서, 얼룩은 단백질에 어떤 잠재적인 청구 그룹의 protonation 상태 작업 pH에 얼룩 같은 선택 되어야 한다. 단백질의 표면에 요금이 반대 긍정적인 얼룩에 기여할 수 있는 효과는 자체 오른쪽10 유용한 방법은이 문서의 범위에서 비록. 가장 일반적으로 사용 되 부정적인 얼룩 시 약 uranyl 아세테이트 uranyl 편대는. 이 얼룩 상대적으로 미세 입자 크기는 (4-5 Å)9 인 텅스텐 산 염 (8-9 Å 입자 크기)9,11, 황화 몰 리브 덴11, 등 일부 다른 얼룩 이상 더 높은 해상도 이미지를 제공 하는 고 란타넘족 기반 12얼룩. Uranyl 아세테이트와 편대도 정착 액, 얼룩 및 생리 적인 pH에서 침전 하는 성향의 낮은 산도 일부 샘플14에 해로운 수 있지만 많은 단백질 단백질 상호 작용에는 밀리초 시간 규모13, 보존 역 . 그들의 유틸리티에도 불구 하 고 uranyl 소금 또한 물류 도전을 제시 그들은 독성 및 약간 방사성 수 필요로 특별 한 취급, 저장, 및 처리 요구 사항, 비 방사능 대안을 추구 하는 일부 사용자를 리드.
기판 준비, 샘플 응용 프로그램에 대 한 설명 및 EM 격자의 얼룩이 지기 방법의 큰 다양 한이 있다. 가장 적절 한 방법을 사용 하 여 종속 샘플 이며 때 새로운 시스템을 태 클 확인 하기 어려울 수 있습니다. 이 원고 기판 준비의 두 가지 방법을 설명 합니다 더 럽 히는 세 가지 방법; 사이드 럽, 터치5, 그리고 빠른15홍 조. 사이드 blotting 설명 하는 방법 중 가장 간단한입니다. 터치 방법 및 급속 한 물 내리는 방법은 구현 하지만 고정 하기 전에 지원 영화와 샘플의 접촉 시간을 제한 하 고 일부 샘플5얼룩 유물의 형성을 ameliorate 표시 되었습니다에 더 어렵다. 이 원고의 목표는 이렇게 부정적인 얼룩 그들에 의해 도전 시스템의 시각화를 태 클을 위한 초기 워크플로 제공 하.
Protocol
1입니다. EM 격자의 준비
- 탄소 시트 방법
- 갓 쪼개진된 운 모 시트를 준비 합니다.
- 운 모 시트, 레이어 사이 몇 mm의 한 모퉁이에 정밀 주사기 바늘 이나 면도날 부드럽게 삽입 합니다. 약 같은 두께의 두 가지를 생산 가능한 시트의 수직 중심가 도구를 삽입 합니다.
- 신중 하 게 촬영 떨어져 운 모 시트의 두 반쪽. 눈, 또는 해 현미경이 수를 할.
- 새로 쪼개진된 운 모 시트의 각각의 모서리를 잘라. 시트 진공 릴리스 동안 탄소 증발 기에서 인계, 그 시트의 탄소 코팅 면을 확인할 수 있습니다.
- 쪼개진된 운 모 시트/s 탄소 증발의 챔버에 갓 죽 습 표면 위로 향하도록 넣습니다.
- 탄소 증발 적절히 탄소 전극으로 올바르게 설정 되어 있는지 확인.
참고: 탄소 막대를 준비 하는 방법은 탄소 증발 기의 사양에 따라 달라 집니다. 하나의 장비에 대 한 프로토콜은 단계 1.1.5까지 다음과 같습니다.- 날카로운 팁을 다음 어떤 거친 털을 제거 하는 종이 타월로 닦는 숫 돌과 탄소 막대를 선명 하 게.
- 정밀한 사 포를 사용 하 여 두 번째 막대의 끝을 평평 하 게 하 고 다시 종이 타월 부드러운 폴란드어.
- 제조업체의 지침에 따라 증발 기에 두 개의 탄소 막대를 놓습니다. 첫 번째 막대에 날카롭게 끝은 두 번째 막대의 병합 된 얼굴로 회사 연락처를 확인 하십시오.
- 탄소 두께 시각적으로 측정 될 경우 부분적으로 운 모 아래 깨끗 하 고 마른 필터 종이의 작은 조각을 놓습니다. 또는 탄소 두께 측정 하기 위해 운 모와 함께 진공 그리스의 작은 소량 함께 하얀 서 리 낀된 현미경 슬라이드를 배치 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 운에 탄소 예금.
- 아래로 진공 펌프 그리고 10-5 mbar에서 될 때까지 기다립니다. 설정 전극의 전압 4.0 V (5 V 최대 탄소 막대 소스에 따라 필요할 수 있습니다).
- 여러 개의 짧은 펄스의 약 3.5 실행 운 모 표면에 탄소 1-2 nm 두꺼운 evaporations 입금 전극을 통해 기간에 s.
: 참고 현재 붉은 노이 되며 다음 화이트 탄소 막대에 적용 됩니다. 눈을 손상 시킬 수이 밝은 빛에 응시 하지 않습니다. - 탄소 또는 탄소 필터 종이 또는 현미경 슬라이드에 시각적 관찰에 의해 탄소 증발 기의 두께 게이지에 의해 측정 된 원하는 두께 도달할 때까지 고 운 모에 입금 하실 수 있습니다. 최종 탄소 레이어 5-10 nm 두께 인지 확인 합니다.
- 탄소 두께 시각적으로 측정 하는 경우 노출된 영역에 진공 기름으로 코팅 하는 현미경 슬라이드의 젖 빛된 부분, 그것은 더 많은 탄소 예금으로 어둡게 될 것 이다.
참고: 때이 메서드를 사용 하 여 탄소 두께 결정 하기 위해 양적 방법이 있다.
- 탄소 두께 시각적으로 측정 하는 경우 노출된 영역에 진공 기름으로 코팅 하는 현미경 슬라이드의 젖 빛된 부분, 그것은 더 많은 탄소 예금으로 어둡게 될 것 이다.
- 진공 챔버를 환기 하 고 탄소 증발 기에서 탄소 코팅 운을 제거 합니다.
참고: 탄소 코팅 운 모는 하룻밤 이후 단계를 진행 하기 전에 정착을 남아 있을 수합니다 있습니다. - EM 격자에 탄소 필름을 두 개의 물 컨테이너 중 하나를 사용: 컨테이너 물 밖으로 배수 될 수 있도록 아래쪽 및 탄소 층에 드레인 밸브를 기다리는 격자 또는 격자는 물 아래에 설정할 수 있는 리프팅 장비 인하 표면 이후 물 표면에서 탄소 필름까지 격자를 발생 시킬 수 있습니다.
- 되도록 물 표면 위에서 약 5mm 초순 증류수와 컨테이너를 작성. 어떤 떠 있는 미 립 자 제거 표면 시트 또는 렌즈 조직의 2 드래그 하 여 물 표면 청소.
- 깨끗 한 스테인레스 스틸 메쉬 조각을 넣으십시오 (2.5 인치 1 인치는 적절 한 크기로) 물 표면에서.
- 고급 핀셋의 쌍을 사용 하 여, 깨끗 하 고 마른 EM 격자 얼굴을 (에 따라 제조업체의 설명) 스테인리스 메쉬에 누워. 함께 밀접 하 게 가능한 격자를 팩 하지만 중복을 허용 하지 마십시오.
- 격자 정렬, 일단 단단히 핀셋 이나 집게를 개발 하는 영화의 쌍에서 탄소 코팅된 운 모 시트 그립.
- 물에 운 모 시트를 소개 합니다. 확인이 매우 얕은 각도 (~ 10도)에서 이루어집니다.
참고:는 운 모 물 표면 돌파 하 고 잠수함, 탄소 필름은 운에서 분리 하 고 물 표면에 플 로트 해야 해야 합니다. 이 단계는 격자, 손상 및 오염 방지를 통해 직접 하지 수행 합니다.- 운 모 시트에서 분리 하지 탄소 필름 지의 가능성을 최소화, 면도날으로 운 모 시트의 가장자리 주위 점수 또는 잘라 한 구석에 작은 위 물에 그것을 소개 하기 전에.
- 탄소 필름 분리는 일단 운 모 시트를 제거 하거나 컨테이너의 하단에가 보자.
- 잘 밀고 핀셋을 사용 하 여, 매우 부드러운 압력을 적용 하 고 느린 움직임과 함께 격자 위에 탄소 필름 가이드.
- 천천히 물 배출 또는 장치 사용의 유형에 따라 드는 반지에 의해 격자 중의 표면 접촉 탄소 시트를가지고.
- 조심 스럽게 들어올립니다 기구를 심지 떨어져 (지금 탄소 코팅 격자)와 스테인리스 스틸 메쉬 필터 종이 사용 하 여 초과 물 중 일부. 이 강철 메시의 바로 가장자리에 필터 종이 만지고 있지만 하지 격자 또는 탄소 필름 만남 이루어집니다 있는지 확인 합니다.
- 격자의 메쉬를 건조 장의 필터 종이 포함 하는 페 트리 접시에 놓고 건조 완전히 그것을 허용 합니다.
참고:이 최고의 하룻밤 실 온에서 건조에 의해 영향을 받습니다 하지만 단계 약 60 ° c.에 오븐에 격자 배치 하 여 빠른 하실 수 있습니다.
- 갓 쪼개진된 운 모 시트를 준비 합니다.
- 플 로트와 코트 (직접 탄소 증 착). 이 방법은 이전 자세히 설명 하고있다16
- 완전히 채워 깨끗 한 큰 유리 그릇 테두리에 증류수는 초승달 모양 위쪽에 형성 하는 그래서.
- 깨끗 한 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 물 표면에 콜 솔루션 (아 초 산에 니트로)의 한 방울을 적용, 방울 밖으로 확산 하 여 완전히 건조 허용 합니다. 일단 건조 수 면 위에 떠 있는 콜의 얇은 층이 표시 됩니다.
- 부드럽게 먼지나 다른 오염 물 표면에서 제거 하는 이쑤시개를 사용 하 여 콜 레이어를 제거 합니다.
- 두 번째 콜 방울 물에 적용 하 고 밖으로 확산 하 여 2-3 분 동안 건조 그것을 허용.
참고: 반복 단계 1.2.3-1.2.4 콜의 평면 및 주름 무료 시트 얻을 때까지. - 고급 핀셋 (에 따르면 제조업체의 설명) 다운 EM 격자 얼굴의 한 쌍을 사용 하 여 부동 콜 시트에. 6 각형 배열에서에 격자 함께 단단히 팩 하지만 중복을 허용 하지 마십시오.
참고: 격자 잃어버렸던 또는 거꾸로 배치 하는 경우 일반적으로 최상 이다 보다는 그것을 이동 하려고 할 때 콜 시트를 손상 하는 위험 장소에 두고. - 격자의 모든 배치 되 면 부드럽게 바닥 필터 종이 그들. 종이 모 세관 작용에 의해 포화 될 수 있습니다.
참고: 모든 크기 또는 필터 종이의 두께 완전히 격자를 포함 하는 경우 적절 한. - 이쑤시개를 사용 하 여 필터 종이 넘어 어떤 콜 필름 제거.
- 가장자리에 필터 종이 물 표면에서 껍질.
참고: 격자 종이 준수 유지 한다. - 종이 평면 및 콜 얼굴을 페 트리 접시에 놓고 완전히 건조 그것을 허용 합니다.
- 1.1.2에 설명된대로 적절히 탄소 전극과 탄소 증발의 상공에는 격자 필터 종이 놓습니다.
- 탄소 시트 방법에 설명 된 대로 탄소 증발 절차에 따라
- 과열 및 니트로 시트 손상을 방지 하기 위해 펄스 사이 몇 초를 허용 합니다.
참고: 후에 격자 탄소 코팅,이 단계는 거의 필요 하지 않습니다 하지만 폴리머 레이어를 제거할 수 있습니다 필요한 경우. 격자 탄소 측을 신선한 필터 종이에 놓고 근처, 종이에에, 격자 아세톤의 몇 방울을 넣어. 격자에서 밖으로 확산 하 고 해산 하 고 흡수 폴리머 레이어 아세톤을 허용 합니다.
2입니다. 부정적인 얼룩이 지기 시 약의 준비
-
Uranyl 아세테이트의 준비
- 종 기에 초순의 작은 볼륨을가지고 고 철저 하 게 드를 10 분 동안 끓인. 그것은 약간, 냉각을 허용 하 고 해산 uranyl 아세테이트 (UA) 1-2% (w/v)에 그것을 사용 하 여.
참고: 적절 한 개인 보호 장비와 증기 찬에서이 절차를 수행 합니다. - 솔루션은 냉각 후 0.2 µ m 주사기 필터 또는 필터 종이 통해 필터링.
- 4 ˚C에서 빛 으로부터 보호 하는 UA를 저장 합니다. 이 솔루션은 최대 1 년 동안 안정.
- 종 기에 초순의 작은 볼륨을가지고 고 철저 하 게 드를 10 분 동안 끓인. 그것은 약간, 냉각을 허용 하 고 해산 uranyl 아세테이트 (UA) 1-2% (w/v)에 그것을 사용 하 여.
-
분말에서 Uranyl 편대의 준비입니다. 이 방법은 이전 세부 사항에서 설명 하고있다8
- (2.1.1 단계)로 삶은 degassed 초순의 2 mL에 20mg uranyl 편대 (UF) 분말 교 반에 의해 해산.
- 계속 저 어, 8 µ L 5 M NaOH의 추가, 솔루션 어두운 노란색 컬러를 변경 해야 하지만 아무 침전을 형성 한다.
- 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
- 스토어 UF 얼룩 빛 으로부터 보호입니다. 얼룩 경우 침전 또는 갈색으로 변색 한다 삭제 관찰 됩니다. 이 솔루션은만 1-2 일 동안 안정.
-
Uranyl 아세테이트에서 Uranyl 편대의 준비
- 1 M NaOH의 100 µ L을 추가 하 여 1% (w/v) UA 얼룩의 1 mL를 침전.
- 벤치탑 원심 분리기에서 최대 속도에서 2 분 동안 혼합 원심
- 어떤 상쾌한 무시 하 고 활발 한 vortexing에 의해 5% (v/v) 포 름 산의 100 µ L에서 침전을 분해.
- 0.5% (v/v) 포 름 산에 UF 얼룩을 900 µ L 초순 물 1 mL의 최종 볼륨을 희석.
- 스토어 UF 얼룩 빛 으로부터 보호입니다. 어떤 촉진 이나 갈색 변색을 관찰 하는 경우 얼룩을 삭제 합니다.
-
다른 염색 시 약의 준비
-
란타넘족 아세테이트 얼룩의 준비
- 초순에 1-2% (w/v) 사마륨 아세테이트 (SmAc), 가돌리늄 아세테이트 (GdAc), 툴 륨 아세테이트 (TmAc), 또는 르 븀 아세테이트 (ErAc)를 분해.
참고: 경우 샘플 보여 긍정적인 얼룩 또는 그리드 가난한 준수 이러한 얼룩을 사용 하는 경우, 그들은 수 수 산성화 최대 0.5% (v/v) 포 름 산. 하얀 달무리에 의해 포위 하는 어두운 개체로 나타나는 샘플 결과 긍정적인 얼룩. 불 쌍 한 준수는 그리드를 격자에 관찰 되 고 예상 보다 적은 분자에 발생 합니다.
- 초순에 1-2% (w/v) 사마륨 아세테이트 (SmAc), 가돌리늄 아세테이트 (GdAc), 툴 륨 아세테이트 (TmAc), 또는 르 븀 아세테이트 (ErAc)를 분해.
-
암모늄 몰 리브 덴 및 나트륨 Phosphotungstate의 준비
- 1-3% (w/v) 초순에 얼룩을 디졸브. 원하는 경우 5 M NaOH를 사용 하 여 7.0 pH를 조정 합니다.
-
란타넘족 아세테이트 얼룩의 준비
3. 탄소 샘플 adsorbing 기판 및 얼룩
-
친을 렌더링 하 여 샘플 응용 프로그램에 대 한 격자 표면 준비
- 그리드는 글로우 방전 장치에는 현미경 슬라이드에 향하도록 놓습니다.
- 30의 최소 눈금을 치료 10 s mA.
참고: 글로우 방전의 정확한 방법을 사용 하는 장비의 특정 조각의 사양에 따라 달라 집니다. - 또는이 벤치탑 UV 램프4를 사용 하 여 10 분 동안 UV 방사선에 의해 수행할 수 있습니다.
-
사이드 Blotting 방법입니다. 이 방법은 이전 세부 사항에서 설명 하고있다8
- 부정적인 압력 핀셋의 쌍을 가진 격자의 가장자리를 지원 표면에 샘플의 3-5 µ L를 적용.
- 샘플 10 격자 표면에 흡착을 허용 s 1 분 최적화를 흡착 시간 개별 샘플에 대 한 해야 합니다.
- 필터 종이의 시트에 격자의 가장자리 및 모 세관 동작을 해 액체 허용.
- 옵션: 세척 그리드. 장소 50 µ L 초순 또는 실험실 영화에 적절 한 휘발성 버퍼 솔루션의 삭제합니다. 부드럽게 드롭 격자의 탄소 표면 및 격자의 표면에 작은 물방울에서 리프트. 필터 종이의 시트에 격자의 가장자리 및 모 세관 동작을 해 액체 허용.
- 원하는 횟수 만큼이 세 단계를 반복 합니다.
- 장소 두 50 µ L 방울 시 약 실험실 필름 시트에 얼룩.
- 부드럽게 드롭 격자의 탄소 표면 및 모눈의 위쪽 표면에 작은 물방울에서 리프트.
참고: 얼룩 마이그레이션합니다 경우 그리드 그리드 뒤쪽을 폐기 해야한다. - 필터 종이의 시트에 격자의 가장자리를 터치 하 고 액체에서 그릴을 모 세관 작업을 허용. 이 착 단계를 두 번 수행 합니다.
- 건조 또는 백열 램프 아래 건조 공기에 그리드를 허용 합니다.
-
터치 방법
- 부정적인 압력 핀셋의 쌍을 가진 격자의 가장자리를 지원 표면에 샘플의 3-5 µ L를 적용.
- 그리드 위에 물방울의 대부분에서 ' 영화 ' 그 손의 손목 끄 적 빠르게 그리드 향함을 멀리 약 45 ° 각도 한 손으로 핀셋을 잡고.
- 선택 사항: 사용 유리 파스퇴르 피 펫 지원 표면에 세척 솔루션의 방울을 적용 하 고 '에서 영화' 3.2.2에서. 필요한 만큼 반복 합니다.
- 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 한 방울 시 약 지원 표면에 얼룩을 적용 하 고 '3.2.2로 '에서 영화. 얼룩 깊이 견본의 시각화에 필요한에 의존 하는 1-3 회 반복 합니다.
참고: 이것은 최종 얼룩 깊이 특성 유일한 요인은 아닙니다 (토론 참조). - 격자의 가장자리에 필터 종이의 찢어진된 가장자리를 만져 초과 얼룩을 제거 합니다.
- 건조 또는 백열 램프 아래 건조 공기에 그리드를 허용 합니다.
-
급속 한 플러싱 메서드
- 얼룩이의 30-70 µ L를 그리기 (1% 일반적으로 UA 사용) 200 µ L 피 펫의 끝에 공기의 5 µ L를 그릴 다음 세척/혼합 시 약 (5-30 µ L), 필요한 경우, 다른 작은 어 갭에 의해 다음 다음 샘플의 5 µ L를 세우 세우 볼륨 다이얼을 설정.
- 그립 그리드 연구원, 멀리 직면 약 45 ° 각도 족집게를 들고 부정적인 압력 핀셋의 쌍을 가진 격자의 가장자리 탄소 코팅 EM 격자의 얼굴에 걸쳐 피 펫 팁의 전체 내용을 추출할.
- 격자의 가장자리에 필터 종이의 찢어진된 가장자리를 만져 초과 얼룩을 제거 합니다.
- 건조 또는 백열 램프 아래 건조 공기에 그리드를 허용 합니다.
참고: 모든 방법에 대 한 그것은이 제거 그들은 일단은 집게의 문 턱에 말린된 그리드를 뽑을 수 있는 집게의 두 측면 사이 갇혀 솔루션으로 그리드를 도달할 때까지 겸 따라 필터 종이의 찢어진된 가장자리를 밀어 하는 것이 좋습니다. 열. 족집게에 그리드 건조 증기 두건의 가장자리에 배치할 수 있습니다. 일정 한 공기 수 있습니다 더 생산도 얼룩.
Representative Results
착 색 시 약 테스트의 모든 생산 최고의 콘트라스트와 선명한, 가장 상세한 입자 샘플 저조한 UF로 어느 정도 부정적인 얼룩. 얼룩을 위해 깊이 임베디드 샘플 (그림 1) 기반 란타넘족 ErAc TmAc 생산 UA 명백한 대조 스테인드 입자의 선명도 의해 심판을 동일한 품질의 부정적인 얼룩이 지기, TmAc 생산 명확 하 게, 더 선명 하 고 이미지 ErAc 보다. 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 입자 1 %TmAc ~ 23 Å TMV 입자의 반복으로 물 했다 때 TmAc의 큰 입자 크기, 높은 확대에 명백한 되더라도17 은 여전히 명확 하 게 보이는 눈으로 그리고 a 남부 레이어 줄에 Raw 이미지의 푸리에 변환입니다. 아무도 다른 란타넘족 얼룩 테스트, ErAc, SmAc, 또는 GdAc,이 기능을 확인할 수 있었다. 클래스 평균 TMV 입자가 나선형 반복 했다 표시에서 겹치는 세그먼트를 추출 하 여 생성 되었다. 추출 된 세그먼트 다음 정렬 했다 그리고 RELION18 를 사용 하 여 더 나은 시각화 주기적인 기능 (그림 2) 분류.
일부 샘플은 근육 파생 C 단백질 같은 얼룩의 방법에 특히 민감한. C-단백질, Ig와 Fn 같은 도메인의 유연한 문자열로 이루어진 부정적인 얼룩 EM 얼룩 사용된 (그림 3)의 방법에 의존 하 여 상당히 다른 이미지를 생성 합니다. 축소 측면 blotting 메서드를 사용 하는 경우에, 반면 C 단백질 도메인 유사한 문자열에 구슬의 일련으로 관찰 때 빠른 홍 조 또는 방법 flicking 스테인드, 고리 모양의 구조 관찰 된다.
| 시 약 | 농도 | pH | 유형 |
| 암모늄 몰 리브 덴 | 1-2% | 5-7 | 음이온 |
| Erbium 아세테이트 (ErAc) | 1-2% | 6 | 양이온 |
| 가돌리늄 아세테이트 (GdAc) | 1-2% | 6 | 양이온 |
| Methylamine tungstate | 2% | 6-7 | 음이온 |
| 사마륨 아세테이트 (SmAC) | 1% | 6 | 양이온 |
| 나트륨 silicotungstate | 1-5% | 5-8 | 음이온 |
| 나트륨 phosphotungstate | 1-3% | 5-8 | 음이온 |
| 툴 륨 아세테이트 (TmAc) | 1-2% | 6 | 양이온 |
| Uranyl 아세테이트 (UA) | 1-3% | 3-4 | 양이온 |
| Uranyl 편대 (UF) | 0.75-1% | 3-4 | 양이온 |
표 1: 몇 가지 일반적인 부정적인 얼룩 시 약입니다.
그림 1: 다양 한 부정적인 얼룩 시 약으로 담배 모자이크 바이러스의 현미경 사진 예 물 (A) 1 %UF (B) 2.5 %TmAc (C) 2.5 %ErAc. (D) 1 %UA (E) 2.5 %GdAc 및 (F) 2.5 %SmAc. 스케일 바는 100 nm. 여러 복제 복제 당 몇 군데 여러 영역에서 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 담배 모자이크 바이러스 툴 륨 아세테이트와 얼룩 (A) TMV의 현미경 사진에서 영역의 높은 확대 1%로 얼룩진 TmAc. 눈금 막대는 20 nm. (B) 추출 된 TMV 세그먼트의 평균 클래스. (C) 푸리에 변환 패널 A ~ 23에서 보여주는 레이어 라인 반사에서 이미지의 Å. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 메서드 C 단백질의 구조를 더 럽 히기의 효과. (A) C 단백질 사이드 오 점 방법 및 (B) 터치 메서드를 사용 하 여 UA와 스테인드. 상단 패널 눈금 막대는 50 nm, 낮은 패널 눈금 막대는 20 nm. 여러 복제 복제 당 몇 군데 여러 영역에서 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 원고에는 부정적인 얼룩 전자 현미경 시 약, 두 소설 란타넘족 시 약 (TmAc 및 ErAc)를 포함 하 여 얼룩이 지기의 다양 한 사용에 대 한 샘플의 여러 방법을 설명 합니다. 많은 부정적인 얼룩 프로세스의 단계의 얼룩, 필요한 경우, 세척 하 고 더 럽 히 기술 선택 등 개별 샘플에 대 한 낙관 되어야 한다. 이 원고는 따라서 도전적인 시스템의 부정적인 얼룩이 태 클을 위한 그들의 자신의 워크플로 개발 하는 microscopists에 대 한 기초를 제공 한다.
얼룩의 선택은 매우 종속 샘플. 특히 낮은 pH에 민감한 샘플 이러한 얼룩19의 통 속성에도 불구 하 고 UA/UF, 또는 저하 될 수 있습니다. 이러한 경우에, 란타넘족 기초 얼룩 같은 TmAc 또는 ErAc 더 적절 한 수 있습니다, 비록 긍정적인 얼룩 방지 샘플 단백질의 전자 포인트 아래 준비의 전반적인 pH 유지 되어야 합니다. 이 필요한 경우 초 산으로 얼룩을 산성화 하 여 수행할 수 있습니다. 특히 낮은 pH 과민 한 샘플에 대 한 음이온 tungstate 또는 몰 리브 덴 얼룩 더 효과적일 수 있습니다. 비록 이러한 얼룩이 발견 되었습니다 어떤 경우에 인공 물의 형성을 유도와 같은 지 단백질에 rouleaux 형성20을샘플링 합니다. 다시, 얼룩의 pH는 긍정적인 얼룩을 방지 하기 위해 샘플의 전자 포인트 이상이 시간을 조정할 수 필요가 있습니다.
세척 얼룩 이전 샘플의 경우 표본 유지 관리 하는 버퍼는 높은 소금 또는 인산 염 구성 요소가 필요할 수 있습니다. 대부분의 경우, 세척 초순 수행할 수 있습니다 하지만 수 저하 나 혼자 물에 노출 되 면 구조적인 변화를 받아야, 더 중요 한 샘플에 대 한 세척 낮은 이온 강도8의 휘발성 버퍼를 사용 하 여 수행 해야 할 수도 있습니다. 신중 하 게 통제 조건 에서도 세척 탄소 표면21에 일부 구조적 재배열 될 수 있습니다.
한 그리드 샘플 흡착, blotting과 얼룩의 관점에서 준비 하는 방법 또한 크게 무엇 관찰은 달라질 수 있습니다. 가장 적절 한 방법을 따라서, 다시, 높은 샘플 의존 합니다. 예를 들어 C-단백질, 구형 고리 모양의 구조 측면 얼룩 얼룩, 다음으로 관찰 하지만이 나타납니다 얼룩 프로세스의 아티팩트 격자 터치 방법 (또는 의해 급속 한 세 정 방법에 의해) 준비가 때 공개 (그림 3 ). 터치 하 고 빠른 세 정 방법, 샘플 탄소와 상호 작용 하는 시간 고정 하기 전에 지원 표면에서는 최소화 된15입니다. 샘플 또한 고정 하기 전에 blotting에 필사적으로 초승달 모양에서 더 적은 힘을 경험 한다. 즉, 탄소 필름에 또는 모 세관 작용을 통해 장기간된 흡수 시간에 발생할 수 있는 표본에 구조적인 변화 최소화 됩니다. 급속 한 물 내리는 방법 또한 표본 분석 시간 해결을 위해 사용할 수 있습니다. 샘플 ligand 또는 집합에 대 한 피 펫 팁 내는 첨가제와 혼합 수 밀리초 내 고정 하기 전에 그리드 화면에서 응용 프로그램을 또는 잠시 전에 시간의 기간.
얼룩 특정 견본의 최적의 이미지는 다시 샘플 종속2제공 하는 데 필요한의 깊이. 분자 전자 빔에 의해 손상 될 수 있습니다 얼룩 너무 얕은 경우에, 그러나 얼룩 너무 두꺼운 경우 구조 기능 손실 될 수 있습니다. 얼룩 깊이 그리드 표면, 탄소 층의 균일성, 그리드, 얼룩 blotting, blotting의 범위와 시간 전에 그리드 접촉은 그것의 길이에 적용 된이 얼룩의 양을의 화란 등 여러 요인에 의해 영향을 kes에 격자에 대 한 완전히 건조. 표 전체에 걸쳐 얼룩의 동등한 배급을 없을 것입니다 하 고 따라서 이미징에 대 한 적절 한 눈금 영역 신중 하 게 선택 해야. 실제로, 격자는 종종 동일한 조건 하에서 같은 날에 준비 하는 경우에 품질에서 변화 한다. 얼룩 깊이 변화에 미치는 분자와 적절 한 얼룩 깊이의 모양을 이미징 버 지 스에 의해 제공 됩니다에 대 한 좋은 예 외5.
불구 하 고 부정적인 얼룩 매우 빠르고, 다양 하 고 간단한 방법, 모든 생물 표본이이 방법으로 시각화 의무가 있습니다. 깨지기 쉬운 어셈블리 축소 하거나 얼룩 또는 EM 표22에 건조 시 흡착, 분해 수 있습니다. 부정적인 얼룩 분자의 병합 이어질 고 탄소 지원 영화7에 분자의 선호 방향 유도 또한 수 있습니다.
부정적인 얼룩 자체 오른쪽에 및 또한 cryo-EM 분석 전 표본 평가 하기 위한 유용한 도구 이지만 샘플 과정에서 발생 하는 물리적 힘의 대부분은 제대로 이해. 따라서, 사용 하는 가장 좋은 방법은 매우 종속 샘플은 고 재판 및 오류 보다는 고정 된 프로토콜에 따라 학에 의해 결정 되어야 합니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 매우 유용한 토론 및 원고의 중요 한 검토에 대 한 피터 기사 감사입니다. 우리는 유용한 토론 Astbury Biostructure 실험실 직원과 닐 Ranson의 스티븐 Muench의 실험실의 구성원 모두 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 (FP7 2007-2013 년)에 의해 투자 되었다 ERC 부여 계약 322408 /. C-단백질 영국 심장 재단 보조금 (BHF PG/13/83/30485)에서 제공 하는 리소스를 사용 하 여 제작 되었다. 우리는 또한 Wellcome 트러스트 장비 리즈 (090932/Z/09/Z 및 094232/Z/10/Z)에 전자 현미경을 지원 하기 위해 자금에 대 한 감사 합니다. CS는 Wellcome 신뢰 국제식 보조금에 의해 자금입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh copper EM grids | Sigma-Aldrich | G4776-1VL | Other materials and/or mesh sizes can also be used |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | 277908 | |
| Carbon evaporator | Ted Pella Inc. | 9620 | Cressington 208 or equivalent |
| Collodion solution 2% in amyl acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | |
| Dumont #5 negative pressure tweezers | World Precision Instruments | 501202 | Or other tweezers as preferred |
| Erbium Acetate | Sigma-Aldrich | 325570 | |
| Gadolinium Acetate | Sigma-Aldrich | 325678 | |
| Mica Sheets. 75x25x0.15mm. | AGAR Scientific | AGG250-1 | |
| Microscope slides, white frosted | Fisher Scientific | 12607976 | Or equivalent |
| Parafilm | Fisher Scientific | 10018130 | Or equivalent |
| Pasteur pipette (glass) | Fisher Scientific | 10343663 | Or equivalent |
| Razor blade | Fisher Scientific | 11904325 | Or equivalent |
| Sandpaper | Hardware store | Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested) | |
| Samarium Acetate | Sigma-Aldrich | 325872 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 | |
| Sodium Phosphotungstate | Sigma-Aldrich | P6395 | |
| Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size). | AGAR Scientific | AGG252 | |
| Thulium Acetate | Sigma-Aldrich | 367702 | |
| Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods | Ted Pella Inc. | 57-10 | Or equivalent for carbon evaporator used |
| Ultra pure water | |||
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
| Vacuum grease | Fisher Scientific | 12719406 | Or equivalent |
| Whatman #1 Filter paper. | Fisher Scientific | 1001 090 | Or equivalent |
| Whatman #40 filter paper | Fisher Scientific | 10674122 | Or equivalent |
References
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
- Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
- Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
- Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
- Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
- Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
- Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
- Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
- Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
- Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
- Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179 (2015).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
- Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
- Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
- Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
- Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
- Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).
Tags
생화학 문제점 132 전자 현미경 부정적인 얼룩 생물학 가장 더럽혀 전자 현미경 격자 탄소 코팅Erratum
Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 01/30/2020.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
Matthew G. Iadaza
to:
Matthew G. Iadanza
