Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تنويعات على سلبية وصمة عار أساليب الميكروسكوب الإلكتروني: أدوات للتصدي لتحدي الأنظمة

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/57199
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Astbury Biostructure Laboratory, University of Leeds

ERRATUM NOTICE

Summary

السلبية وصمة عار م تقنية قوية لتصور هيكل الجزيئات، ولكن يمكن أن تنتج تقنيات المصبوغة مختلفة نتائج متفاوتة بطريقة تعتمد عينة. هنا عدة نهج المصبوغة السلبية موصوفة بالتفصيل لتوفير سير عمل أولية للتصدي لتصور أنظمة صعبة.

Abstract

يسمح الميكروسكوب الإلكتروني وصمة سلبية (م) مراقبة بسيطة وسريعة نسبيا للجزيئات الكبيرة والجزيئات المجمعات من خلال استخدام التباين تعزيز كاشف وصمة عار. أن كانت محدودة في القرار بحد أقصى 20 ~ 18، وصمة سلبية م مفيدة لمجموعة متنوعة من المشاكل البيولوجية ويوفر أيضا وسيلة سريعة لتقييم العينات للمجهر الإلكتروني cryo (cryo-م). سير العمل وصمة سلبية أسلوب مباشر؛ العينة هي تمتز فوق ركيزة، ثم تطبيق وصمة عار ومسح والمجففة لإنتاج طبقة رقيقة من إلكترون الكثيفة التي يتضمنها الجسيمات وصمة عار. ومع ذلك، يمكن، تتصرف العينات الفردية بطرق تختلف اختلافاً كبيرا باختلاف ظروف المصبوغة. وادي ذلك إلى وضع مجموعة كبيرة ومتنوعة من تقنيات إعداد الركازة، سلبية يلطخ الكواشف، وشبكة للغسيل والتقنيات النشاف. تحديد الأسلوب الأنسب لكل عينة الفردية يجب أن يتم على أساس حالة بحالة وميكروسكوبيست يجب أن يكون لديك إمكانية الوصول إلى مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة لتحقيق النتائج وصمة سلبية أعلى مستوى من الجودة. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لأساليب إعداد سفلية مختلفة اثنين وثلاثة أساليب مختلفة النشاف، ويظهر مثال لنموذج الذي يظهر نتائج تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للطريقة المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف إعداد بعض الكواشف المصبوغة السلبية الشائعة، وهما رواية البقع لانثانيدات القائم، مع المناقشة المتعلقة بالاستخدام كل.

Introduction

على الرغم من الاهتمام مؤخرا بالقرار وصمة الثورة الناتجة عن تحقيق تقدم كبير في البرد-الإلكترون المجهر1 (cryo-م)، سلبية تبقى م تقنية قوية وعنصرا حاسما في مربع الأدوات إلكترون ميكروسكوبيستس. تلطيخ السلبية لا تزال أفضل طريقة للتقييم السريع من عينة قبل تحسين ظروف الشبكة cryo-2. التباين العالي وسرعة إعداد الشبكة من عينات الملون السلبية يجعلها مثالية لتقييم نقاوة العينة وتركيز وعدم التجانس والمرونة كونفورماشونال3. قد أدت إلى العديد من الهياكل الإعلامية بيولوجيا من إعادة البناء وصمة سلبية، على الرغم من قرار هذه التقنية تقتصر على ~ 18 Å القرار4،،من56، وتحقق نتائج أفضل من بعض العينات في وصمة عار من البرد-م لمجموعة متنوعة من الأسباب7.

في وصمة سلبية م، تمتز فوق سطح شبكة م الجسيمات ذات الاهتمام ويلفها بمصفوفة غير متبلور من مجمع إلكترون وصمة عار كثيفة. ويتم إنتاج عالي تباين نسبي بين الخلفية والجسيمات ذات الاهتمام، مع الجسيمات يجري الإلكترون أقل كثافة من وصمة عار المحيطة بها8. تظهر الجسيمات كالمناطق الخفيفة بسبب قوتها ونثر إلكترون منخفضة مقارنة بوصمة عار المحيطة الكثيفة، التي تنتشر الإلكترونات أكثر، ويبدو أكثر قتامة. ميزات سوبستروكتورال من الجسيمات يمكن استخلاصه من دراسة مفصلة للصور الناتجة كوصمة عار سوف تخترق أي شق وتنتج التباين غير النظامية من التفصيل9.

تبدأ عملية المصبوغة السلبية مع إعداد الدعم الركيزة التي يتم التقاطها بالجسيمات العينة، والطبقة من وصمة عار المجففة أيد. الركيزة الدعم الأكثر استخداماً طبقة من الكربون غير متبلور، تدعمها أحياناً طبقة رقيقة من البولي فينيل (مثل فورمفار) أو النيتروسليلوز (مثلاً الكولوديون) البوليمر. ركائز هذه يمكن شراؤها تجارياً أو إعداد داخلية باستخدام البروتوكولات المبينة أدناه.

بعد إعداد الركيزة الدعم، يمكن تطبيقها العينة، ومسح الحل الزائدة قبالة. ينبغي وقف عينات في المخزن مؤقت مناسبة لتلطيخ السلبية. فمن الأفضل تجنب استخدام المخزن المؤقت للفوسفات وارتفاع تركيزات الملح، التي يمكن أن تؤدي إلى رواسب البلورية التي يمكن أن تحجب العينة. ينبغي أيضا تجنب عوامل تخفيض المنظفات، السكروز، والغليسيرول وتركيزات عالية من النوكليوتيدات كما أنها تؤثر أيضا على وصمة عار الجودة4. عندما لا يمكن تغيير تكوين المخزن المؤقت، الغسيل على سطح الشبكة م مع الماء أو قد يقلل من المخزن مؤقت أكثر ملاءمة بعد الامتزاز وقبل تلوين التشكيل من المخزن المؤقت المتعلقة بالتحف وعموما تحسين الخلفية وصمة عار. إذا كان يشتبه في المخزن المؤقت للأعمال الفنية، يمكن أن تكون مفيدة وصمة عار شبكة المخزن المؤقت فقط تحديد ما إذا كانت مكونات المخزن المؤقت المصدر من القطع الأثرية الملحوظة.

بعد العينة تمتز، ومسح وغسلها إذا لزم الأمر، يتم تطبيق كاشف المصبوغة. تم العثور على مجموعة متنوعة من المواد الكاشفة لتكون فعالة البقع السلبية (الجدول 1)، ولكن يجب اختيار وصمة عار لتناسب العينة. واتهم 'هالة' أشكال وصمة عار حول الجسيمات بسبب تشريد الجزيئات وصمة عار بمنطقتي مسعور للبروتين والنفور من المجموعات. ولذلك، يجب اختيار وصمة عار حتى أن الدولة بروتونيشن لأي مجموعات مشحونة المحتملة على البروتين هو نفسه كوصمة عار على درجة الحموضة العامل. مقابل رسوم على سطح البروتين يمكن أن تسهم تلطيخ إيجابية التأثير، الذي على الرغم من أن تقنية مفيدة في جانبها الأيسر10 ليست في نطاق هذه الورقة. الكواشف المصبوغة السلبية الأكثر استخداماً هي خلات اليورانيل وفورمات اليورانيل. هذه البقع لها حجم الحبوب جيد نسبيا (4-5)9 وتقديم الصور دقة أعلى على البقع الأخرى مثل موليبدات أمونيوم11,9،والرمات-تونجستاتيس (8-9 حجم الحبوب)11وبعض على أساس لانثانيدات البقع12. خلات اليورانيل وفورمات بمثابة كما مثبت، الحفاظ على العديد من تفاعلات البروتين البروتين على مقياس ميلي ثانية الساعة13، على الرغم من أن درجة الحموضة منخفضة من وصمة عار وميلها التعجيل في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي قد تكون ضارة لبعض العينات14 . وعلى الرغم من فائدتها، أملاح اليورانيل أيضا تحديات لوجستية كما أنها هي السامة والمشعة أقل ما يقال، سواء التي يمكن أن تتطلب معالجة خاصة، تخزين، ومتطلبات التخلص منها، الأمر الذي يؤدي بعض المستخدمين للبحث عن بدائل غير المشعة.

وهناك مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأساليب الموصوفة لإعداد الركازة، نموذج التطبيق، وتلطيخ شبكات م. الأسلوب الأكثر ملاءمة لاستخدام العينة يتوقف ويكون من الصعب التأكد من عند التصدي لنظام جديد. ويصف هذه المخطوطة طريقتين لإعداد سفلية وثلاثة أساليب النشاف؛ الجانب النشاف و عبها5والسريع بيغ15. النشاف الجانب هو أبسط الأساليب المذكورة. الأسلوب عبها وأسلوب التفريغ السريع أكثر صعوبة لتنفيذ ولكن الحد من وقت الاتصال العينة مع الفيلم الدعم قبل التثبيت وقد ثبت أن تحسين تشكيل التحف وصمة عار لبعض العينات5. والهدف من هذه المخطوطة وبالتالي توفير سير عمل أولية للتصدي للتصور من تحديا لنظم م وصمة سلبية.

Protocol

1-إعداد الشبكات م

  1. أسلوب ورقة الكربون
    1. إعداد ورقة ميكا ملصوق طازجة.
      1. برفق إدراج إبرة حقنه دقة أو شفرة حلاقة في أحد أركان الورقة ميكا، مم قليلة ما بين الطبقات. قم بإدراج الأداة كقريبة من مركز رأسية الورقة قدر الإمكان لإنتاج قطعتين من سمك متساوية تقريبا.
      2. عناية الجائزة إلى جانب نصفي الورقة ميكا. يمكن أن يحدث هذا بالعين، أو تحت مجهر تشريح.
      3. قطع واحد من أركان كل من الأوراق ميكا ملصوق حديثا. في حالة ما إذا الورقة يتحول في المبخر الكربون خلال الإفراج عن فراغ، يمكن التعرف على الجانب الكربون المغلفة من الورقة.
    2. ضع ميكا ملصوق الورقة/s في الدائرة مبخر الكربون، مع سطح المشقوق طازجة مواجهة.
    3. تأكد من المبخر الكربون هو الإعداد بشكل صحيح مع قطب الكربون معدّة بشكل صحيح.
      ملاحظة: سوف تختلف طريقة إعداد قضبان الكربون تبعاً لمواصفات مبخر الكربون. بروتوكول لأداة واحدة على النحو التالي حتى الخطوة 1.1.5.
      1. شحذ قضيب من الكربون مع المبرأة طرف حاد وثم البولندية مع منشفة ورقية لإزالة أي نتوءات خشنة.
      2. استخدام الصنفرة غرامة تسطيح نهاية قضيب الثاني ومرة أخرى البولندية السلس مع منشفة ورقية.
      3. وضع قضبان الكربون اثنين في المبخر طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. ضمان نهاية شحذ على قضيب الأولى يجعل الاتصال الثابت مع وجه الأرض قضيب الثاني.
    4. ضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح نظيفة وجافة جزئيا تحت ميكا إذا كان سمك الكربون سوف يقاس بصريا. وبدلاً من ذلك، ضع شريحة مجهر بلوري أبيض بلمسة صغيرة من الشحوم فراغ جنبا إلى جنب مع ميكا لقياس سماكة الكربون.
    5. إيداع الكربون على الميكا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      1. مضخة الفراغ أسفل وانتظر حتى يتم في 10-5 [مبر]. تعيين الجهد الكهربائي إلى 4.0 الخامس (قد يكون ما يصل إلى 5 الخامس حسب المصدر قضيب الكربون).
      2. تشغيل متعددة نبضات قصيرة من حوالي 3.5 s في المدة عن طريق قطب كهربائي بإيداع 1-2 نانومتر افابوريشنز سميكة من الكربون على سطح ميكا.
        ملاحظة: كما يتم تطبيق الحالي إلى قضيب الكربون سوف توهج الأحمر والأبيض ثم. لا التحديق في الضوء الساطع كهذا يمكن أن تضر عينيك.
      3. السماح للكربون بإيداع ميكا حتى يتم التوصل إلى سمك المرجوة، مقيسة بسمك مبخر الكربون في أو بالملاحظة البصرية من الكربون المودعة على ورق الترشيح أو الشريحة المجهر. التأكد من أن طبقة الكربون النهائي 5-10 نانومتر سميكة.
        1. إذا كان يتم قياس سمك الكربون بصريا مقارنة الجزء متجمد من الشريحة المجهر مغلفة بفراغ الشحوم إلى المنطقة المعرضة، سوف تصبح أكثر قتامة كما تم إيداع المزيد من الكربون.
          ملاحظة: لا يوجد أي أسلوب كمي لتحديد سمك الكربون عند استخدام هذا الأسلوب.
    6. التنفيس عن فراغ الغرفة وإزالة ميكا المغلفة بالكربون من المبخر الكربون.
      ملاحظة: يمكن ترك ميكا المغلفة بالكربون لتسوية بين عشية وضحاها قبل المتابعة مع الخطوات اللاحقة
    7. استخدم إحدى حاويات المياه اثنين لتعويم الفيلم الكربون على الشبكات م: حاوية مع استنزاف صمام في أسفل حتى يمكن أن ينضب الماء وطبقة الكربون خفضت إلى الشبكات تنتظر أو منصة رفع يمكن تعيين الشبكات تحت الماء السطح، والتي يمكن بعد ذلك رفع الشبكات حتى الفيلم الكربون على سطح الماء.
    8. تعبئة الحاوية بالماء المقطر عالي النقاوة حيث يكون سطح الماء حوالي 5 مم من الأعلى. تنظيف سطح الماء بواسطة سحب ورقة أو اثنتين من نسيج العدسة فوق السطح لإزالة أي الجسيمات الطافية.
    9. ضع قطعة من الفولاذ المقاوم للصدأ نظيفة مش (1 بوصة × 2.5 بوصة حجم ملائم) تحت سطح الماء.
    10. استخدام زوج من ملاقط الجميلة، يكمن نظيفة وجافة م الشبكات الوجه للأعلى (وفقا لوصف الشركة المصنعة) على شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ. حزمة الشبكات معا محكم قدر الإمكان، ولكن لا تسمح لهم بالتداخل.
    11. حالما يتم ترتيب الشبكات، بقوة قبضة ورقة ميكا المغلفة الكربون في زوج من ملاقط أو الفيلم وضع ملقط.
    12. إدخال ورقة ميكا في الماء. ضمان أن يتم هذا في زاوية ضحلة جداً (~ 10 درجات).
      ملاحظة: ينبغي الميكا اختراق سطح الماء وتغرق، في حين ينبغي فصل من ميكا الفيلم الكربون وتطفو على سطح الماء. ينبغي عدم القيام بهذه الخطوة مباشرة عبر الشبكات، وتجنب الأضرار و/أو التلوث.
      1. للتقليل من احتمال إرادة الفيلم الكربون لا يفصل من ورقة ميكا، نقاط حول حافة الورقة ميكا بشفرة حلاقة أو قطع زاوية واحدة مع مقص صغير قبل إدخاله في الماء.
    13. مرة واحدة وقد فصل الكربون الفيلم، إزالة ورقة ميكا أو السماح لها تقع على الجزء السفلي من الحاوية.
    14. استخدام الملقط مقلوب غرامة، تطبيق ضغط لطيف جداً ومع حركات بطيئة دليل الفيلم الكربون عبر الجزء العلوي من الشبكات.
    15. إحضار ورقة الكربون على اتصال بسطح الشبكات أما باستنزاف المياه ببطء أو رفع الطوق رفع، اعتماداً على نوع الأجهزة المستخدمة.
    16. عناية رفع مش الفولاذ المقاوم للصدأ (الآن مع الشبكات المغلفة بالكربون) من الجهاز والفتيل بعيداً بعض من المياه الزائدة باستخدام قطعة من ورق الترشيح. ضمان أن يتم هذا عن طريق لمس الورقة عامل التصفية إلى حافة الشبكة من الصلب ولكن لا يأتي على اتصال بالشبكات أو الفيلم الكربون.
    17. وضع شبكة الشبكات في طبق بتري يحتوي على قطعة جافة من ورق الترشيح والسماح لأنها جافة تماما.
      ملاحظة: هذا أفضل تتأثر بتجفيف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ولكن الخطوة يمكن التعجيل بوضع الشبكات في فرن في حوالي 60 درجة مئوية.
  2. Float ومعطف (ترسب الكربون مباشرة). وقد وصفت هذا الأسلوب بالتفصيل سابقا16
    1. تماما ملء وعاء زجاج نظيفة كبيرة مملوءة بالماء المقطر حيث يشكل غضروف في الجزء العلوي.
    2. تطبيق قطره واحدة من الكولوديون الحل (النيتروسليلوز في خلات الأميل) على سطح الماء باستخدام ماصة باستور نظيفة، تسمح الحبرية لتنتشر ويجف تماما. وبمجرد جفاف طبقة رقيقة من الكولوديون تطفو فوق سطح الماء ستكون مرئية.
    3. إزالة بلطف طبقة الكولوديون باستخدام مسواك لإزالة الغبار أو التلوث الأخرى من سطح الماء.
    4. تطبيق معالجة تجميعية الكولوديون ثاني للمياه والسماح لتنتشر والجافة لمدة 2-3 دقائق.
      ملاحظة: كرر الخطوات 1.2.3-1.2.4 حتى يتم الحصول على ورقة مسطحة وتجعد مجاناً من الكولوديون.
    5. استخدام زوج من ملاقط خير مكان م الشبكات الوجه للأسفل (وفقا لوصف الشركة المصنعة) على ورقة الكولوديون العائمة. حزمة الشبكات معا محكم في صفيف سداسية، ولكن لا تسمح لهم بالتداخل.
      ملاحظة: إذا كانت شبكة هو في غير محله أو توضع رأسا على عقب فمن الأفضل عموما تركها في مكان بدلاً من خطر إتلاف الورقة الكولوديون عند محاولة نقله.
    6. حالما يتم وضع كافة الشبكات، تكمن بلطف ورقة تصفية عليها. تسمح هذه الورقة تصبح مشبعة بعمل شعري.
      ملاحظة: أي حجم أو سمك ورق الترشيح المناسب إذا كان يغطي تماما الشبكات.
    7. استخدام مسواك لإزالة أي فيلم الكولوديون الذي يمتد خارج نطاق الورقة عامل التصفية.
    8. قبضة من ورق الترشيح على الحافة وقشر من سطح الماء.
      ملاحظة: يجب أن تبقى الشبكات الالتزام بها الورق.
    9. ضع ورقة مسطحة والوجه الكولوديون أعلى في طبق بتري والسماح ليجف تماما.
    10. ضع ورق الترشيح مع الشبكات في الدائرة مبخر الكربون مع قطب الكربون معدّة بشكل صحيح كما هو مفصل في 1.1.2.
    11. اتبع الإجراء تبخر الكربون كما هو موضح في طريقة ورقة الكربون في
  3. السماح لعدة ثوان بين النبضات لتجنب الانهاك وإتلاف الورقة النيتروسليلوز.
    ملاحظة: إذا رغبت يمكن إزالة طبقة البوليمر بعد الشبكات الكربون المغلفة، على الرغم من أن هذه الخطوة ضرورية إلا نادراً. ضع الجانب الكربون الشبكات حتى على قطعة جديدة من ورق الترشيح ووضع عدة قطرات من الأسيتون في الورقة بالقرب من، ولكن ليس على الشبكات. تسمح الأسيتون انتشرت تحت الشبكات وحل واستيعاب طبقة البوليمر.

2-إعداد الكواشف تلطيخ السلبية

  1. إعداد خلات اليورانيل
    1. تقديم كمية صغيرة من الماء عالي النقاوة ليغلي والسماح لتغلي لمدة 10 دقائق دقة ديغا. السماح لتبرد قليلاً ومن ثم استخدامه لحل خلات اليورانيل (UA) في 1-2% (w/v).
      ملاحظة: تنفيذ هذا الإجراء في خزانة الأبخرة ومع معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. بعد قد بردت الحل، التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون أو ورق الترشيح.
    3. تخزين UA محمية من الضوء وفي 4 ˚C. الحل مستقر لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  2. إعداد فورمات اليورانيل من مسحوق. وقد وصفت هذا الأسلوب "التفصيل سابقا"8
    1. حل 20 ملغ اليورانيل فورمات (الجبهة المتحدة) مسحوق في 2 مل ماء عالي النقاوة المغلي يطرد (كما هو الحال في الخطوة 2.1.1) بالتحريك.
    2. بينما تواصل إثارة، إضافة 8 ميليلتر من 5 م هيدروكسيد الصوديوم، الحل يجب أن تتغير إلى لون أصفر أكثر قتامة، ولكن ينبغي أن تشكل لا متسرعا.
    3. تصفية الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون.
    4. مخزن وصمة عار الجبهة المتحدة محمية من الضوء. ولوحظ تجاهل وصمة ينبغي إذا أي يعجل أو بني اللون. الحل فقط مستقرة لمدة 1-2 يوما.
  3. إعداد فورمات اليورانيل من خلات اليورانيل
    1. يعجل 1 مل من 1% (w/v) تعميم الوصول إلى الخدمات وصمة عار بإضافة 100 ميليلتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. الطرد المركزي الخليط لمدة 2 دقيقة بأقصى سرعة في الطرد مركزي benchtop.
    3. تجاهل أي المادة طافية وحل متسرعا في 100 ميليلتر من حمض الفورميك 5% (v/v) بواسطة فورتيكسينج قوية.
    4. تمييع لوحدة تخزين نهائي 1 مل مع 900 ميليلتر ماء عالي النقاوة تسفر عن وصمة الجبهة المتحدة في حمض الفورميك 0.5% (v/v).
    5. مخزن وصمة عار الجبهة المتحدة محمية من الضوء. تجاهل وصمة عار إذا لم يتم ملاحظة أي تلون المتعجلة أو البنى.
  4. إعداد أخرى من الكواشف تلطيخ
    1. إعداد البقع خلات لانثانيدات
      1. حل ساماريوم ثلاثي اسيتات (الألغام)، خلات الجادولينيوم (GdAc)، خلات ثوليوم (TmAc) أو خلات الاربيوم (ErAc) في 1-2% (w/v) في الماء عالي النقاوة.
        ملاحظة: إذا تظهر عينات تلطيخ إيجابية أو الفقيرة الانضمام إلى الشبكة عند استخدام هذه البقع، أنها يمكن أن تكون أسيديفيد مع تصل إلى 0.5% (v/v) حمض الفورميك. تلطيخ إيجابية النتائج في العينة التي تظهر ككائن مظلمة محاطة بهالة بيضاء. سيؤدي إلى ضعف التمسك بالشبكة الجزيئات أقل من المتوقع ويحتفل على الشبكة.
    2. إعداد موليبدات الأمونيوم والصوديوم فوسفوتونجستاتي
      1. حل وصمة عار في 1-3% (w/v) في الماء عالي النقاوة. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم م 5 إذا رغبت في ذلك.

3-أدسوربينج عينات للكربون الركيزة وتلطيخ

  1. إعداد "سطح الشبكة" "تطبيق نموذج" بجعلها Hydrophilic
    1. ضع الشبكة مواجهة على شريحة مجهر في وحدة تفريغ توهج.
    2. علاج الشبكة لمدة 30 ثانية في 10 mA.
      ملاحظة: الأسلوب الدقيق توهج التفريغ سيتوقف على مواصفات قطعة معينة من المعدات المستخدمة.
    3. وبدلاً من ذلك قد يتحقق هذا باشعاع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية benchtop4.
  2. الأسلوب النشاف من جانب . وقد وصفت هذا الأسلوب "التفصيل سابقا"8
    1. قبضة على حافة الشبكة مع زوج من ملاقط الضغط السلبي، وتطبيق 3-5 ميليلتر من العينة إلى السطح التأييد.
    2. السماح بالعينة الجسميات على سطح الشبكة ل 10 ثانية إلى 1 دقيقة أمثلية وقت الامتزاز يجب للعينات الفردية.
    3. اللمس على حافة الشبكة لتصفية ورقة والسماح بعمل شعري لسحب قبالة السائل.
    4. اختياري: يغسل الشبكة. مكان 50 ميليلتر قطرات الماء عالي النقاوة أو الحل المناسبة العازلة المتقلبة على ورقة من الفيلم المختبر. بلطف بلمس سطح الكربون من الشبكة إلى الانخفاض ورفع إيقاف المعالجة تجميعية صغيرة على سطح الشبكة. اللمس على حافة الشبكة لتصفية ورقة والسماح بعمل شعري لسحب قبالة السائل.
    5. كرر هذه الخطوة يغسل عدة مرات حسب المطلوب.
    6. مكان اثنين 50 ميليلتر قطرات من تلطيخ كاشف على ورقة من الفيلم المختبر.
    7. بلطف بلمس سطح الكربون من الشبكة إلى الانخفاض ورفع إيقاف المعالجة تجميعية صغيرة على السطح العلوي للشبكة.
      ملاحظة: إذا كان وصمة عار وترحيل إلى الجزء الخلفي من الشبكة ثم الشبكة يجب أن يتم تجاهل.
    8. اللمس على حافة الشبكة لتصفية ورقة والسماح بعمل شعري رسم قبالة السائل. تنفيذ هذه الخطوة المصبوغة مرتين.
    9. تسمح الشبكة للهواء الجافة أو الجافة تحت مصباح المتوهجة.
  3. طريقة عبها
    1. قبضة على حافة الشبكة مع زوج من ملاقط الضغط السلبي، وتطبيق 3-5 ميليلتر من العينة إلى السطح التأييد.
    2. سرعة عقد الملاقط في يد واحدة، حيث أن الشبكة الزاوية في حوالي 45 درجة تواجه بعيداً، نفض الغبار المعصم من تلك اليد 'نفض الغبار قبالة' غالبية الحبرية التي على رأس الشبكة.
    3. اختياري: استخدام زجاج ماصة باستور تطبيق قطره حل الغسيل على السطح التأييد و 'نفض الغبار قبالة' كما هو الحال في 3.2.2. كرر حسب الضرورة.
    4. استخدام زجاج ماصة باستور تطبيق قطره من تلطيخ الكاشف إلى السطح التأييد و 'نفض الغبار قبالة' كما هو الحال في 3.2.2. كرر 1-3 مرات اعتماداً على عمق وصمة عار المطلوبة للتصور للعينة.
      ملاحظة: هذه ليست العامل الوحيد الذي يعزو إلى عمق وصمة عار النهائي (انظر المناقشة).
    5. إزالة وصمة عار الزائدة بلمس حافة قطعة من ورق الترشيح على حافة الشبكة الممزقة.
    6. تسمح الشبكة للهواء الجافة أو الجافة تحت مصباح المتوهجة.
  4. الأسلوب السريع فلاشينغ
    1. رسم ميليلتر 30-70 من وصمة (1% تعميم الوصول إلى الخدمات وعادة ما تستخدم) إلى طرف ماصة 200 ميليلتر، تحويل الطلب وحدة التخزين وضع 5 ميليلتر من الجو، ثم وضع الغسيل/خلط الكاشف (5-30 ميليلتر)، إذا كان المطلوب، تليها فجوة جوية صغيرة أخرى ومن ثم رسم حتى 5 ميليلتر من عينة.
    2. قبضة على حافة الشبكة مع زوج من ملاقط الضغط السلبي، عقد الملاقط حيث أن الشبكة الزاوية في حوالي 45 درجة تواجه بعيداً عن الباحث، إخراج محتويات بالكامل من طرف ماصة عبر وجه الشبكة م المغلفة بالكربون.
    3. إزالة وصمة عار الزائدة بلمس حافة قطعة من ورق الترشيح على حافة الشبكة الممزقة.
    4. تسمح الشبكة للهواء الجافة أو الجافة تحت مصباح المتوهجة.
      ملاحظة: جميع الطرق ينصح بالشريحة التي مزقتها حافة الورقة عامل التصفية على طول الملقط حتى تصل إلى الشبكة وهذا يزيل الحل محاصرين بين الجانبين من الملقط، الذي يمكن سحب الشبكة المجففة في الفكين الملقط بمجرد وهم فتحت. يمكن أيضا وضع الشبكة في الملقط على حافة غطاء الأبخرة الجافة. تدفق الهواء مستمر يمكن أن يساعد في إنتاج المزيد حتى تلطيخ.

Representative Results

جميع الكواشف المصبوغة اختبار إنتاجها تلطيخ سلبيا إلى حد ما، مع الجبهة المتحدة تسفر عن العينات مع تباين أكبر وجسيمات أكبر، وأكثرها تفصيلاً. للبقع لانثانيدات على أساس عينات متأصلة (الشكل 1) ErAc و TmAc أنتجت تلطيخ السلبية ذات جودة مكافئة لتعميم الوصول إلى الخدمات، كما يحكم بالتباين الواضح والحدة من الجسيمات الملون، مع TmAc تنتج أكثر وضوحاً، صوراً واضحة أكثر من ErAc. على الرغم من أن حجم الحبوب أكبر من TmAc يصبح واضحا في عالية التكبير، عندما كانت ملطخة جسيمات "فيروس تبرقش التبغ" (TMV) مع % 1 كرر TmAc ~ 23 Å الجسيمات تمف17 لا تزال واضحة للعيان بالعين، وكذلك خط طبقة ميريديونال في تحويل فورييه من الصورة الخام. أيا من غيرها لانثانيدات البقع اختبارها، ErAc أو الألغام أو GdAc، كانت قادرة على حل هذه الميزة. المتوسطات فئة تم إنشاؤها بواسطة استخراج شرائح متداخلة من جسيمات تمف حيث كان تكرار حلزونية مرئية. القطع المستخرجة ثم تتمشى وتصنيف استخدام ريليون18 لتصور أفضل ميزة الدوري (الشكل 2).

بعض العينات حساسة بشكل خاص إلى أسلوب التلوين، مثل العضلات المستمدة من البروتين ج. ج-البروتين، الذي يتكون من سلسلة مرنة للمفتش العام ومجالات مثل الجبهة الوطنية، تنتج صوراً مختلفة اختلافاً كبيرا حسب م وصمة سلبية تعتمد على الطريقة المستخدمة المصبوغة (الشكل 3). عند استخدام الأسلوب النشاف الجانب، انهارت الهياكل الشبيهة بخاتم لوحظت، بينما عندما ملطخة بالتنظيف السريع أو التحريك أساليب، ج-البروتين يلاحظ كسلسلة من المجالات التي تشبه الخرز في سلسلة.

كاشف تركيز الأس الهيدروجيني نوع
موليبدات أمونيوم 1-2% 5 – 7 أنيونى
خلات الاربيوم (ErAc) 1-2% 6 الأيوني
خلات الجادولينيوم (GdAc) 1-2% 6 الأيوني
تنغستات ميثيلاميني 2% 6 – 7 أنيونى
ساماريوم ثلاثي اسيتات (الألغام) 1% 6 الأيوني
سيليكوتونجستاتي الصوديوم 1-5% 5 – 8 أنيونى
فوسفوتونجستاتي الصوديوم 1-3% 5 – 8 أنيونى
خلات ثوليوم (TmAc) 1-2% 6 الأيوني
خلات اليورانيل (UA) 1 – 3% 3 – 4 الأيوني
فورمات اليورانيل (الجبهة المتحدة) 0.75 – 1% 3 – 4 الأيوني

الجدول 1: بعض المشتركة السلبية المصبوغة الكواشف.

Figure 1
رقم 1: ميكروجرافس مثال لفيروس تبرقش التبغ ملطخة بمختلف وصمة سلبية الكواشف 1% (أ) الجبهة المتحدة TmAc 2.5% (ب) (ج) ErAc 2.5%. (د) 1% تعميم الوصول إلى الخدمات (ه) 2.5% GdAc ( و) و) 2.5% الألغام. أشرطة مقياس من 100 نانومتر. صور الممثل من replicates متعددة مع مناطق متعددة تصويرها كل تكرار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تلطيخ فيروس تبرقش التبغ مع خلات ثوليوم (أ) الملون التكبير عالية للمنطقة من صورة مجهرية تمف مع 1% TmAc. هو مقياس بار 20 نانومتر. (ب) فئة المتوسط المستخرجة تمف شرائح. (ج) تحويل فورييه للصورة في لوحة بإظهار طبقة خط تأملات في ~ 23. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: آثار النشاف الأسلوب في المطابقة للبروتين ج. (أ) ج-البروتين ملطخة بتعميم الوصول إلى الخدمات باستخدام الأسلوب وصمة عار من جانب وأسلوب عبها (ب) . شريط مقياس اللوحة العلوية هو 50 نانومتر، شريط مقياس لوحة أقل من 20 نانومتر. صور الممثل من replicates متعددة مع مناطق متعددة تصويرها كل تكرار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذه المخطوطة أساليب متعددة لتلطيخ سلبية العينات للمجهر الإلكتروني باستخدام مجموعة متنوعة من تلطيخ الكواشف، بما في ذلك اثنان من الكواشف لانثانيدات رواية (TmAc و ErAc). العديد من الخطوات العملية المصبوغة السلبية يجب أن يكون الأمثل للعينات الفردية بما في ذلك الاختيار من وصمة عار ومقدار الغسيل المطلوبة أن وجدت، وتقنية بلوتينج. هذه المخطوطة يوفر بالتالي أساسا ميكروسكوبيستس تطوير مهام سير العمل الخاصة بهم لمعالجة السلبية يلطخ أنظمة صعبة.

اختيار وصمة عار الغاية عينة تعتمد. قد تتحلل العينات التي تكون حساسة بشكل خاص إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني بتعميم الوصول إلى الخدمات و/أو الجبهة المتحدة، وعلى الرغم من خصائص هذه البقع19مثبت. وفي هذه الحالات، يقوم لانثانيدات البقع مثل TmAc أو ErAc، قد يكون من الأنسب، على الرغم من أن الرقم الهيدروجيني عموما من الإعداد يجب أن يبقى أقل من نقطة isoelectric من البروتين عينة للمساعدة في منع تلطيخ إيجابية. يمكن أن يتحقق هذا يحمض وصمة عار مع حمض الخليك إذا لزم الأمر. لعينات حساسة pH منخفضة بشكل خاص، قد تكون البقع تنغستات أو موليبدات أنيونى أكثر فعالية. على الرغم من أن قد تم العثور على هذه البقع للحث على تشكيل التحف في بعض الحالات، مثل تشكيل رولو في البروتين الدهني عينات20. مرة أخرى، درجة الحموضة من وصمة عار قد تحتاج إلى تعديل، هذه المرة إلى أعلى نقطة isoelectric العينة، للحيلولة دون تلطيخ إيجابية.

غسيل العينة قبل تلطيخ قد تكون ضرورية إذا كان المخزن المؤقت الذي يحتفظ فيه العينة مكون الملح أو الفوسفات عالية. في كثير من الحالات، يمكن إجراء الغسيل بالماء عالي النقاوة ولكن لعينات أكثر حساسية، والتي قد تؤدي إلى تدهور أو تغيرات هيكلية عندما تتعرض للمياه وحدها، قد تحتاج الغسيل المراد تنفيذها مع عازلة متقلبة منخفضة القوة الأيونية8. حتى في ظل ظروف خاضعة للرقابة بعناية، يمكن أن تؤدي بعض إعادة ترتيب الهيكلية على سطح الكربون21الغسيل.

الأسلوب الذي يتم إعداد شبكة من حيث عينة الامتزاز، النشاف وتلطيخ يمكن أن تؤثر أيضا كثيرا ما يلاحظ. الأسلوب الأكثر ملاءمة هو هكذا، مرة أخرى، الغاية عينة تعتمد. ج-البروتين، على سبيل المثال، لوحظ كبنية تشبه خاتم كروي بعد تلطيخ الجانب-وصمة عار، ولكن يبدو أن ذلك قطعة أثرية من عملية المصبوغة، كما كشفت عندما يتم إعداد الشبكات بأسلوب عبها (أو بطريقة التفريغ السريع) (رقم 3 ). في أساليب التنظيف عبها والسريع، الوقت العينة يجب أن تتفاعل مع الكربون هو السطح التأييد قبل تثبيت مصغر15. أيضا تجارب العينة قوات أقل من غضروف انحسار عليها النشاف قبل التثبيت. وهذا يعني أن التغييرات الهيكلية في العينة التي يمكن أن تحدث عند وقت امتصاص المطول على الفيلم الكربون أو من خلال عمل الشعرية إلى أدنى حد. يمكن أيضا استخدام أسلوب التفريغ السريع لحل وقت تحليل عينات. العينة يمكن أن تكون مختلطة مع يجند أو كمادة مضافة في تلميح ماصة لمجموعة فترة من الوقت قبل تقديم الطلب إلى شبكة أو لحظات فقط على سطح الشبكة قبل التثبيت داخل ميلي ثانية.

عمق وصمة عار المطلوبة لتوفير صور الأمثل لنموذج معين هو مرة أخرى تعتمد نموذج2. إذا كان وصمة عار ضحلة جداً، يمكن أن تتلف الجزيئات بشعاع الإلكترون ولكن إذا كان وصمة عار سميكة جداً السمات الهيكلية يمكن أن تضيع. ويتأثر بعوامل متعددة مثل هيدروفيليسيتي على سطح الشبكة، سيفيد طبقة الكربون، ومقدار وصمة عار المطبقة على الشبكة، طول الوقت وصمة عار على اتصال بالشبكة قبل النشاف، مدى النشاف والوقت تا عمق وصمة عار kes للشبكة ليجف تماما. شبكة لن يكون توزيعاً حتى وصمة عار في مجملها وذلك مجالات الشبكة المناسبة لتصوير يتم اختيارها بعناية. وفي الواقع، الشبكات كثيرا ما تختلف في الجودة حتى عندما أعدت في نفس اليوم نفس الظروف. مثال جيد لكيفية تأثير الاختلاف في عمق وصمة عار على مظهر الجزيئات وعمق وصمة عار مناسبة لتصوير يتم توفيرها من قبل برجس وآخرون5.

على الرغم من سلبية المصبوغة بطريقة مرنة وسريعة وبسيطة جداً، العينات البيولوجية ليست كلها قابلة للتصور بهذا الأسلوب. يمكن طي تجميعات هشة أو تفكيكه على الامتزاز، تلطيخ أو التجفيف على الشبكة م22. تلطيخ السلبية يمكن أيضا يؤدي إلى تسطيح الجزيئات والحث على توجهات المفضل من جزيئات الكربون دعم الفيلم7.

وصمة سلبية أداة قيمة لتقييم العينات في حد ذاتها، وأيضا قبل التحليل م البرد ولكن العديد من القوى المادية العينة واجه خلال العملية تكون غير مفهومة. ولذلك، أفضل نهج لاستخدام هو عينة تعتمد درجة عالية ويجب أن تتقرر بالتجربة والخطأ بدلاً من درس بعد بروتوكول ثابت.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

نحن ممتنون جداً لبيتر نايت لإجراء مناقشات مفيدة واستعراض نقدي للمخطوطة. ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبرات نيل رانسون وستيفن مونش وموظفي المختبر بيوستروكتوري أستبوري لإجراء مناقشات مفيدة. تم تمويل هذا العمل من قبل "مجلس البحوث الأوروبي" (FP7-2007-2013)/منسق الإغاثة الطارئة منح اتفاق 322408. ج-البروتين أنتجت باستخدام الموارد التي توفرها منحة "مؤسسة القلب البريطانية" (بهف بيكوغرام/13/83/30485). كما نشكر مؤسسة ويلكوم ترست للمعدات التمويل لدعم الميكروسكوب الإلكتروني في ليدز (090932/Z/09/Z و 094232/Z/10/Z). وتمول "منحة ويلكوم ترست الرياضي" CS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh copper EM grids Sigma-Aldrich G4776-1VL Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate Sigma-Aldrich 277908
Carbon evaporator Ted Pella Inc. 9620 Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate Sigma-Aldrich 9817
Dumont #5 negative pressure tweezers World Precision Instruments 501202 Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate Sigma-Aldrich 325570
Gadolinium Acetate Sigma-Aldrich 325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. AGAR Scientific AGG250-1
Microscope slides, white frosted Fisher Scientific 12607976 Or equivalent
Parafilm Fisher Scientific 10018130 Or equivalent
Pasteur pipette (glass) Fisher Scientific 10343663 Or equivalent
Razor blade Fisher Scientific 11904325 Or equivalent
Sandpaper Hardware store Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate Sigma-Aldrich 325872
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1.06462
Sodium Phosphotungstate Sigma-Aldrich P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size). AGAR Scientific AGG252
Thulium Acetate Sigma-Aldrich 367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods Ted Pella Inc. 57-10 Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22450
Vacuum grease Fisher Scientific 12719406 Or equivalent
Whatman #1 Filter paper. Fisher Scientific 1001 090 Or equivalent
Whatman #40 filter paper Fisher Scientific 10674122 Or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  2. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  3. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  4. Ha, J. Y., et al. Molecular architecture of the complete COG tethering complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).
  5. Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules. J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).
  6. Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose. J Biol Chem. , (2017).
  7. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  8. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).
  9. Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).
  10. Massover, W. H. Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin. Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).
  11. Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy. Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).
  12. Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate. Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).
  13. Zhao, F., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).
  14. Cao, B., Xu, H., Mao, C. Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites. Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).
  15. Imai, H., et al. Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules. Nat Commun. 6, 8179 (2015).
  16. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
  17. Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus. Virology. 369 (1), 226-227 (2007).
  18. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).
  19. Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy? Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).
  20. Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).
  21. Walker, M. L., et al. Two-headed binding of a processive myosin to F-actin. Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).
  22. Orlova, E. V., Saibil, H. R. Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy. Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 132، الميكروسكوب الإلكتروني، ووصمة سلبية، "تيم البيولوجية"، النشاف، الشبكات الميكروسكوب الإلكتروني، وطلاء الكربون

Erratum

Formal Correction: Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems
Posted by JoVE Editors on 01/30/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

Matthew G. Iadaza

to:

Matthew G. Iadanza

تنويعات على سلبية وصمة عار أساليب الميكروسكوب الإلكتروني: أدوات للتصدي لتحدي الأنظمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G.,… More

Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. J. Vis. Exp. (132), e57199, doi:10.3791/57199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter