Summary
Här presenterar vi ett protokoll för påvisande och kvantifiering av låg rikligt molekyler i komplexa lösningar med hjälp av molekylär prägling i kombination med en kapacitans biosensor.
Abstract
Förmågan att upptäcka och kvantifiera biomolekyler i komplexa lösningar har alltid varit mycket eftertraktade inom naturvetenskap; som används för detektion av biomarkörer, föroreningar och andra molekyler av intresse. En vanligt förekommande teknik för detta ändamål är Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), där ofta en antikropp är riktad mot en specifik målmolekyl och en andra märkt antikropp används för detektion av primär antikropp, vilket möjliggör den absolut kvantifiering av biomolecule under studien. Men begränsar användningen av antikroppar som erkännande element robustheten av metoden. som gör att behöva använda märkta molekyler. För att övervinna dessa begränsningar, har molecular imprinting genomförts, att skapa artificiell erkännande platser kompletterar mallen molekylen och obsoleting nödvändigheten av att använda antikroppar för inledande bindande. Ytterligare, för ännu högre känslighet, sekundära märkta antikroppen kan ersättas av biosensorer som förlitar sig på kapacitansen för kvantifiering av målmolekylen. I detta protokoll beskriver vi en metod för att snabbt och etikett-gratis detektera och kvantifiera låg-riklig biomolekyler (proteiner och virus) i komplexa prover, med en känslighet som är betydligt bättre än vanliga detekteringssystem såsom ELISA. Detta är alla medieras av molecular imprinting i kombination med en kapacitans biosensor.
Introduction
Kvantifiering av biomolekyler används inom många olika forskningsområden inom vetenskap, använda metoder som radioimmunoassay (RIA) eller ELISA1. Vissa av dessa metoder kräver en märkt reagens som en radioisotop eller enzym märkt antikropp/antigen, vilket gör dem arbetskrävande och tidsödande med komplexa procedurer2. Ytterligare, den robusthet, selektivitet och känslighet för dessa metoder är inte tillräckligt för alla analyser; i synnerhet räcker de inte när attogram mängder behöver analyseras, snarare än piktogram kvantiteter3. För detta ändamål vunnit biosensorer stort intresse4,5, särskilt i kombination med molecular imprinting för en ökad robusthet.
Molecular imprinting förlitar sig på att skapa hålrum genom polymeriserande funktionella monomerer runt mall6, skapa konstgjorda erkännande platser som helt liknar den mall7. Denna teknik har använts för flera olika tillämpningar, inklusive drug delivery system och analytiska separation, men också som biorecognition element i biosensorer8,9,10. Det finns dock fortfarande vissa svårigheter i utformningen av molekylärt präglade polymerer (MIPs) för makromolekylära mallar som proteiner och celler11,12. På grund av detta, har många forskare fokuserat på imprinting proteinet mallen direkt på ett substrat, vilket skapar en yta som känns igen av de mål protein12. Denna ytbehandling teknik används för att anställa erkännande hålrum för stora molekyler och församlingar inklusive proteiner kallas microcontact prägling13,14. Det allmänna förfarandet för metoden beror på polymerisation mellan två ytor - en mall stämpel och en polymer support - som mallen är adsorberat på en surface15,16, och kom i kontakt med den monomer-behandlad yta. Genom detta sätt bildas en tunn polymerfilm stöd via UV-polymerisation. Slutligen, mallen tas bort, lämnar bakom mallen specifika hålrum på ytan av präglade elektroden. Denna metod har några fördelar inklusive en minskad aktivitet förlust av präglade molekylen, samt som kräver mycket små mängder av mallen molekyler för imprinting bearbeta16,17. Således kan dessa kostnadseffektiva, stabil, känslig och selektiv ytor skapas på sensorn ytor, inriktning någon mall av användarens val.
Biosensor kan användas för detektion av enstaka proteiner och mycket större biomakromolekyler, inklusive virus. En viss grupp av virus som vinner senaste intresse är den bacteriophage, som är ett virus som infekterar bakterier. Snabb och känslig detektion av bakteriofager är viktigt under biotekniska och biofarmaceutiska processer för att fastställa infektionerna i bakteriekulturer med bakteriofager18. Den vanligaste biologiska test för bacteriophage upptäckt är den dubbla lager agar metod19, som är mödosam och tidskrävande. Flera försök har gjorts att utveckla nya diagnostiska verktyg för virus (inklusive bakteriofager) såsom atomic force microscopy (AFM)20, interferometri21, elektrokemi22och sensor system23, 24. en hel del arbete har fokuserats på biosensorer på grund av deras fördelar som enkel att använda, mycket känsliga och kan i realtid mätning15,25. En viss typ av biosensor är baserad på förändringar i kapacitans. Dessa kapacitiv biosensorer är de elektrokemiska sensorer som mäter förändringar i dielektriska egenskaper när en analyt interagerar med ett biorecognition inslag på sensorn ytan, orsakar en minskning av kapacitans2,4 . Kapacitiv biosensorer har använts för detektion av olika analyter som antigener, antikroppar, proteiner och tungmetall joner6,26,27,28. Dessa typer av biosensorer har många fördelar som inneboende snabbhet, hög känslighet, enkelhet, låg kostnad, lätt manipulation och realtid mätning utan märkning29.
Den metod som beskrivs häri syftar till att aktivera detektering och kvantifiering av låg-riklig biomolekyler i komplexa prover, utan att behöva använda någon märkning. I synnerhet är tekniken mest användbar i intervallet atto-pikogram av biomolekyler, där andra kommersiellt befintliga instrument misslyckas att exakt kvantifiera deras mål.
Protocol
1. ändring av glas täckglas (mall frimärken)
- För att rengöra glas täckglas, doppa dem sekventiellt i 10 mL 1,0 M HCl, avjoniserat vatten och 1,0 M NaOH, respektive, i 10 min i varje steg i ett ultraljud renare i rumstemperatur.
- Torka glas täckglas med kvävgas.
Obs: Täckglas torkas genom avdunstning under en ström av gasformigt kväve.
- Torka glas täckglas med kvävgas.
- Fördjupa de rengjorda och torkade täckglas i 10% (v/v), 10 mL lösning av 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) i etanol för 1 h att införa aminogrupper på täckglaset ytan, vid rumstemperatur.
- Skölj täckglas med avjoniserat vatten.
- Torka täckglas med kvävgas.
- Fördjupa de APTES modifierade täckglas i 5% (v/v), 10 mL lösning av glutaraldehyd i 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4) för 2 h för att aktivera amino grupper på ytan, vid rumstemperatur6,15.
- Skölj täckglas med 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4) för att avlägsna överflödig glutaraldehyd från ytan.
- Torka täckglas med kvävgas.
- Förbereda 1,0 mL mall (protein/bacteriophage) lösning i 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4) i 0,1 mg/mL koncentration.
Obs: Lös 0,1 mg protein i 1,0 mL fosfatbuffert (10 mM, pH 7,4). Om det behövs, en spektrofotometer (280 nm) kan användas för att bestämma proteinkoncentration.- Släppa 200 µL av denna mall lösning på de modifierade täckglas och inkubera vid 4 ° C över natten.
Obs: Överskott mall lösningen kan användas för att förbereda 1-2 fler mall frimärken som ska användas i karakterisering studierna. - Skölj täckglas med 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4) för att avlägsna obunden mallen från ytan.
Obs: För att skölja elektroderna, tvätta dem med fosfatbuffert (10 mM, pH 7,4) för 30 s. - Torka täckglas med kvävgas.
Obs: Täckglas ska förvaras vid 4 ° C tills de används i polymerisation steg.
- Släppa 200 µL av denna mall lösning på de modifierade täckglas och inkubera vid 4 ° C över natten.
2. ändring av kapacitiv guld elektroder
- Att rengöra elektroderna, sänk ned elektroderna i en liten bägare, sekventiellt, innehållande 5 mL etanol (70%), avjoniserat vatten, avjoniserat vatten, aceton, sura piranha lösning (3:1, H2SO4: H2O2, v/v), och avjoniserat vatten, respektive i 10 min i varje steg, i ett ultraljud renare i rumstemperatur.
- Torka elektroderna med kvävgas.
- För att utföra electropolymerization av tyramin, bereda 8 mL 10 mM tyramin lösning i 10 mM fosfat buffert (pH 7,4) innehållande etanol (2 mL)15.
Obs: Den totala volymen av tyramin lösningen måste vara 8 mL totalt inklusive 2 mL etanol.- Utföra cykliska voltametrisk skanningar (15 cykler) i den här lösningen använder en potentiostat täcker en potentiell intervallet 0 - 1,5 V (Ag/Granulatfyllda) och en avsökningshastighet av 50 mV/s30.
- Skölj elektroderna med avjoniserat vatten.
- Torka elektroderna med kvävgas.
- Sänk ned elektroderna i en lösning innehållande 30 mM acryloyl klorid och 30 mM trimetylamin i toluen (Vtotalt = 5 mL) i rumstemperatur över natten6,15,30.
- Skölj elektroderna med avjoniserat vatten.
Obs: För att säkerställa en bättre borttagning av oreagerad acryloyl klorid och trimetylamin rester, det är också möjligt att tvätta ytan med NaOH efter avjoniserat vatten. - Torka elektroderna med kvävgas.
- Skölj elektroderna med avjoniserat vatten.
3. beredning av mallen präglade kapacitiv guld elektroder
-
Beredning av bacteriophage präglade kapacitiv guld elektroder
- Innan polymerisation, Bered en monomer som innehåller vinylkloridmonomer (N-hydroxymetyl akrylamid) och cross-linker (polyetylenglykol-400-tarmkanalen) i förhållandet 1:5 (mol/mol) i 1 mL 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4).
Obs: Monomeren lösningen innehållande monomer och cross-linker kan användas i olika förhållanden, eller typerna av monomer och cross-linker kan ändras enligt mallen för optimering av specifika interaktionen. - Lägg till 1 mg av foto-initiativtagare till denna lösning.
Obs: Om polymerisation utförs under UV-ljus, sedan foto-initieraren måste användas för att initiera polymerisering. Om polymerisation utförs av fria radikaler polymerisation, måste typ av initieraren ändras. - Pipettera 1,5 µL av denna lösning på guld ytan av modifierade guld elektroden.
Obs: Guld ytan av elektroden visas schematiskt i figur 1. - Ta mallen stämpeln i kontakt med monomeren lösningen på toppen av guld elektrod ytan.
- Initiera UV polymerisation (365 nm, 400 W) och fortsätta för 15 min31.
Obs: UV polymerisation utförs inuti ett kylande skåp som är inställd på-25 ° C innan du initierar polymeriseringen. Sedan UV-ljus bota systemet är aktiverat och polymerisation fortsätter för 15 min innan du stänger av UV-ljus bota system. - Ta bort mallen stämpeln från ytan med hjälp av tången.
Obs: När du tar bort mallen stämpeln från ytan, polymera filmen på ytan skadas. Därför bör stämpeln tas bort från ytan mycket försiktigt och långsamt utan att använda våld. - Skölj av elektroden ytan med avjoniserat vatten och torka den med kvävgas.
- Sänk ned elektroderna i 1 mL av 10 mM 1-dodecanethiol förberett i etanol för 20 min för att täcka hål på elektrod ytan.
- Skölj elektroderna med avjoniserat vatten och torka elektroderna med kvävgas.
- Innan polymerisation, Bered en monomer som innehåller vinylkloridmonomer (N-hydroxymetyl akrylamid) och cross-linker (polyetylenglykol-400-tarmkanalen) i förhållandet 1:5 (mol/mol) i 1 mL 10 mM fosfatbuffert (pH 7,4).
-
Beredning av Protein präglade kapacitiv guld elektroder
- Innan polymerisation, Bered en monomer som innehåller monomerer (akrylamid: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µL; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) och cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) i 820 µL av ultrarent vatten30,32.
- Förbereda 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) i ultrarent vatten.
- Tillsätt 20 µL av TEMED lösningen i monomeren lösningen och rensa med kvävgas för 5 min.
- Förbereda 10% (w/v) ammonium persulfat (APS) i ultrarent vatten.
- Tillsätt 20 µL av APS lösningen i monomeren lösningen.
- Pipettera 1,5 µL av monomeren lösningen på modifierade guld elektrod ytan.
- Ta mallen stämpeln i kontakt med monomer-behandlade ytan.
- Starta polymerisation i rumstemperatur och fortsätta i 5 h.
Obs: För beredning av protein-präglade gold elektroder, i stället för UV-polymerisation, fria radikaler polymerisation i rumstemperatur (25 ° C) är utförda med APS-TEMED som initiator-katalysator. - Ta bort mallen stämpeln från ytan noggrant med hjälp av tången.
- Skölj elektroden med avjoniserat vatten och torka med kvävgas.
- Sänk ned elektroderna i 1 mL av 10 mM 1-dodecanethiol förberett i etanol för 20 min för att täcka hål på elektrod ytan.
- Skölj elektroderna med avjoniserat vatten och torka elektroderna med kvävgas.
4. karakterisering av elektrod ytan med svepelektronmikroskopi (SEM)
- Montera exemplaren på aluminium hållare med självhäftande carbon band.
- Coat elektroderna med 10 nm palladium/guld.
- Undersöka elektroderna med SEM.
5. realtid kapacitiv mätningar med mallen präglade kapacitiv guld elektroder
- Du kan infoga präglade kapacitiv guld elektroderna i elektrokemiska flöde cellen integreras till en kapacitiv biosensor.
- Bereda 100 mL regenerering buffert (25 mM glycin-HCl, pH 2.5, inklusive 50 mM Tween-20) och 1 L rinnande buffert (för bacteriophage präglade system: 10 mM fosfatbuffert, pH 7,4; för protein-präglade system: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).
- Börja analysen med injektion av regenerering buffert att regenerera systemet och kör buffert åter temperera systemet för 25 min.
- Förbereda standardmall lösningar i intervallet önskad koncentration i kör buffert.
Obs: Först förbereda ett lager av mallen lösningen genom upplösning 0,1 mg protein, eller cirka 108 pfu bakteriofager, i 1,0 mL fosfatbuffert (10 mM fosfatbuffert, pH 7,4). Sedan förbereda standardlösningarna för kalibreringskurvan genom tio sekventiell 10-faldig utspädningar från stamlösning. Dessa lösningar kommer att analyseras med den kapacitiv biosensor i steg 5,5. Protein kan mätas med hjälp av en spektrofotometer (280 nm). För att mäta bacteriophage koncentrationen, en dubbla lager agar metod kan användas, vilket beskrivs i Detaljer tidigare19. - Injicera 250 µL av dessa standardlösningar sekventiellt till systemet i optimala förhållanden (flödeshastighet: 100 µL/min, temperatur: 25 ° C).
Obs: I denna ansökan, lösningarna som standard protein var förberedda i koncentrationer av 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, medan bacteriophage koncentrationerna var i intervallet 1,0 x 101 - 1,0 x 105 pfu/mL. Lösningarna som placerades i injektion ventilen, och sekventiellt injiceras in i systemet, injicera proverna i exemplar genom enda sprutpumpen och multiport ventilen. Minskningen i kapacitans efter injicera standardlösningarna som härrör från bindningen av mallen präglade håligheter övervakas automatiskt av instrumentets programvara.
Representative Results
Genom att följa protokollet, enligt schematiskt figur 1, kommer att en bare guld elektroden vara märkta med en mall, som representerar strukturen för en biomacromolecule. Denna elektrod kan tillämpas i en kapacitiv biosensor (figur 2), möjliggör stabil tillämpningen av en mall på elektroden, och mätning av förändringar i kapacitans vid bindning av mallen.
En schematisk representation av den kapacitiv biosensor visas i figur 2. Centris pumpen, som ansvarar för kontinuerlig injektion av rinnande bufferten (10 mM fosfatbuffert, pH 7,4) och regenerering bufferten (25 mM glycin-HCl, pH 2.5) under regenerering i cellen flöde, kan ses tydligt i bild. Cellen flöde består av arbetande, referens och counter elektroder. Ventilens injektion består av standard protein/bacteriophage lösningar, som passerar genom degasser först och sedan injiceras sekventiellt i systemet. Så snart lösningarna nå arbetselektroden infogas i cellen flöde, övervakas resultatet i realtid. Kapacitans värdena kan registreras genom att följa sensorgrams på datorskärmen.
Figur 3 och figur 4 illustrerar skillnaderna mellan ytan av kala och märkta guld elektroder. Denna karakterisering är viktigt att se till att det finns polymera håligheter, ses som ojämnheter på ytan av elektroden efter imprinting. Bortsett från SEM, det finns också andra karakterisering metoder inklusive AFM, kontaktvinkel mätningar, ellipsometri etc., som kan användas för att karaktärisera ytan efter imprinting. Genom detta sätt kan det säkerställas att prägling är framgångsrik och att mallen hålrum bildas på ytan. Inom dessa håligheter, kan mallen binda med hög specificitet och affinitet.
Efter injicera standardlösningarna in kapacitiv systemet, ett genomsnitt av de sista fem avläsningarna beräknades automatiskt av programvara och kalibrering grafer erhölls genom plottning förändringen i kapacitans vs. koncentrationen av den för analyten. Minskningen i registrerade kapacitans uppstod från bindningen av mallen. Fler molekyler som binder till guld elektroden yta, ju högre minskade totala kapacitans, enligt den allmänna principen om kapacitiv mätningar. Figur 5 och figur 6 visar att ΔC med ökande koncentration av analyten, ökar som förväntat. Det dynamiska omfånget (mellan vilka är de koncentrationsintervall där systemet är användbart för detektion av ett specifikt mål) och detektionsgränsen (LOD) kan utvärderas genom att analysera dessa grafer. Enligt figur 6, den bacteriophage som präglat kapacitiv biosensor kan upptäcka bakteriofager i koncentrationer av 101 - 105 pfu/mL, med ett LOD värde 10 pfu/ml i denna studie. Både diagram 5 och figur 6 höjdpunkten nödvändigheten av att mäta kalibreringskurvan i samma intervall krävs också för mallen koncentrationen är tänkt, eftersom Linjäriteten av regressionen kan variera över koncentrationerna ( Figur 5), eller har olika backar (figur 6). Det bör också noteras att på grund av de låga koncentrationerna används, systemet är ganska känslig för variationer (grumlighet i provet, air utkast, etc.) och det är därför rekommenderat att köra minst exemplar att minska potentialen för inklusive extremvärden . Av samma anledning, kan standardavvikelsen vara ganska betydande för mycket utspädda prover, som kan ses i figur 6.
Figur 1 . Schematisk bild av den microcontact prägling metod. (A) förberedelse av glas täckglas (mall stämplar), (B) beredning av kapacitiv guld elektroderna, (C) microcontact prägling av mallen på guld elektrod ytan via UV-polymerisation och (D) borttagning av mallen från elektrod ytan (återges från Ertürk et al., bioteknik rapporter 2014 (3): 65-72 med tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk representation av den kapacitiv biosensor. Den allmänna layouten för den kapacitiv biosensor som används i denna studie (återges från Ertürk et al., bioteknik rapporter 2014 (3): 65-72 med tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Scanning Electron Microscopy protein präglade elektroder. SEM-bilder av (A) en bare guld elektrod (skalstapeln = 20 µm), och (B), ett protein som präglade kapacitiv guld elektrod (skalstapeln = 10 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Scanning Electron Microscopy av bacteriophage präglade elektroder. SEM-bilder av en bare guld elektrod (skalstapeln = 20 µm) (A), och en bacteriophage märkt kapacitiv guld elektrod i olika förstoringar (6600 x, skalstapeln = 10 µm) (B), och 11, 500 X, skala bar = 5 µm) (C). pilarna anger klibbade bakteriofager). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekten av buffert sammansättning för kalibrering grafer. Kalibreringskurva visar förändringen i kapacitans vs. en proteinkoncentration i optimala förhållanden (kör buffert: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; Regenerering buffert: 25 mM glycin-HCl, pH 2.5 inklusive 50 mM Tween-20; Flödeshastighet: 100 µL/min, provvolymen: 250 µL; T: 25 ° C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Representativa kalibreringskurvan för stora biomakromolekyler. Kalibreringskurva som visar förändringen i kapacitans vs. bacteriophage koncentration i optimala förhållanden (kör buffert: 10 mM fosfatbuffert, pH 7.4. Regenerering buffert: 25 mM glycin-HCl, pH 2.5 inklusive 50 mM Tween-20; Flödeshastighet: 100 µL/min, provvolymen: 250 µL; T: 25 ° C) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
När denna metod utförs, finns det några viktiga steg som måste beaktas när den följer protokollet. Ett kritiskt steg är rengöring steg med sura piranha lösning. Steg 2.1 får inte vara mer än 10 min. Den mall lösningen för steg 1.4 får inte överstiga 0,1 mg/mL, eftersom dessa värden har optimerats tidigare. Cyklisk voltametric skanningar får inte överstiga 15 cykler för att få optimal tjocklek. För steg 3.1.3 är 1,5 µL en optimerad värde. Detta värde får inte vara högre för denna särskilda typ av elektrod. Om UV bota system har en effekt på 400 W, måste sedan polymerisation utföras för högst 10-15 min. Så snart APS (initierare) läggs till lösningen efter TEMED, måste det efterföljande steget utföras mycket snabbt för att undvika omedelbara polymerisation (steg 3.2.5).
En av de viktigaste stegen är borttagande av mallen stämpeln från yta efter UV polymerisation. Om detta steg inte utförs på rätt sätt, finns det en risk att den polymera filmen på ytan av elektroden kan tas bort med stämpel. Därför är det rekommenderat att Sänk ned elektroden och protein stämpeln på topp i en lösning av vatten efter polymerisation, ta sedan bort stämpeln mycket långsamt och försiktigt från ytan (steg 3.1.6).
Baserat på den mall som används, får ändringar i typ och förhållandet av monomerer som används (funktionell monomer och cross-linker) bedömas när det gäller genererar högre känslighet. Detta måste bestämmas empiriskt. Vidare att affinitet av mallen molekylen oftast flera olika interaktioner samtidigt. Därför kan detta leda till problem under regenerering stegen. Om mallen bundna inte frigörs från ytan ordentligt, kan detta påverka reusabilityen av elektroden för vidare analys. Dessa multipoint tillhörighet kan också resultera från att binda via svagare interaktioner. I sådana system, kan icke-specifik bindning ske, vilket kan påverka negativt selektivitet av system16. Dessa är gemensamma och allmänna, begränsningar av metoden.
Förutom dessa specifika begränsningar finns det många betydande fördelar av diskuteras metoden jämfört med befintliga metoder. RIA, ELISAs och fluorometric mätningar är mycket känsliga, men de måste användningen av märkt material (mall eller detektor), medan biosensor är helt etikett-fri. Dessa metoder är också dyrare och mer tidskrävande. En biosensor tillvägagångssätt möjliggör snabb, parallell syntes mips i olika sammansättningar på samma tid16. Eftersom bara några mikroliter av monomeren lösningen krävs för förberedelse, är metoden praktiskt när du använder dyra eller på annat sätt begränsad monomerer. Ytterligare, enda MIP elektroder kan användas för ca 80 analyser utan en avsevärd minskning i prestanda, vilket är betydligt högre än andra befintliga metoder30. Befintliga metoder också lida, i varierande grad, av låg känslighet och selektivitet, medan den beskrivna metoden möjliggör identifiering och kvantifiering av molekyler i intervallet pM med hög selektivitet.
På grund av kostnadseffektivitet, användarvänlighet verksamma instrumentet, och realtid känsliga upptäckt på kort tid jämfört med befintliga metoder, biosensorer är mycket lovande punkt-av system för upptäckt av vård under fältmässiga förhållanden; t.ex., miljöövervakning och för program i utvecklingsländer. I många applikationer inom diagnos av sjukdomen är realtid, känslig, selektiv och snabb påvisande av en biomarkör i en komplex blandning som serum krävs15,25. Här, är biosensorer överlägsna befintliga metoder, i synnerhet på grund av deras robusthet och känslighet. Specifikt för upptäckt av smittämnen betraktas bakteriofager nyligen som alternativa biorecognition element för biosensorer på grund av sin värd bakterier specificitet33,34,35. Byte av antikroppar med bakteriofager är mycket lovande för att minska kostnaderna och öka den stability ytterligare36. Ett sådant system kan även för påvisande och kvantifiering av specifika Fager i miljön och från kliniska prover. På grund av förekomsten av bakteriofager, och deras förmåga att transduce bakterier med antibiotikaresistens gener37,38, kan en sådan metod vara värdefulla studera spridningen av resistenta bakterier.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Maria Baumgarten (IQ bioteknik plattform, infektionsmedicin, Lunds universitet) är erkänt för att utföra och ge skanning elektronmikrografier. Detta arbete stöds av bidrag från The Forskningsrådet Formas (2017-00100) som en del av det europeiska tredje gemensamma Programming initiativet på antimikrobiell resistens (JPIAMR) samtal ”Transmission Dynamics”. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, tolkning, skrivande, beredning av manuskriptet, beslut att skicka, eller beslut att publicera arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
| 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
| acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
| tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
| CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
| Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
| Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
| acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
| triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
| toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
| N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
| poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
| UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
| forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
| acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
| N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
| N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
| methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
| N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
| ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
| Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
| Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
| Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
| NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
| DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
| Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
| 2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
| CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |
References
- Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
- Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
- Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
- Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
- Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
- Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
- Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
- Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
- Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
- Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
- Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
- Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
- Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
- Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
- Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
- Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
- Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
- Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
- Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
- Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
- Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
- Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
- Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
- Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
- Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
- Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
- Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
- Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
- El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
- Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
- Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
- Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
- Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
- Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
- Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).
