Summary
Vi præsenterer her, en protokol til påvisning og kvantificering af lav rigelige molekyler i komplekse løsninger ved hjælp af molekylære prægning i kombination med en kapacitans biosensor.
Abstract
Evne til at detektere og kvantificere biomolekyler i komplekse løsninger har altid været meget efterspurgte inden for naturvidenskab; anvendes til påvisning af biomarkører, forurenende stoffer og andre molekyler af interesse. Et almindeligt anvendte teknik til dette formål er det enzym-forbundet Immunosorbent Assay (ELISA), hvor ofte et antistof er rettet mod et bestemt mål molekyle, og en anden mærket antistof bruges til påvisning af det primære antistof, giver mulighed for at absolut kvantificering af biomolekyle under undersøgelsen. Men brugen af antistoffer som anerkendelse elementer begrænser robustheden af metoden. som gør brug af ved hjælp af mærket molekyler. For at overvinde disse begrænsninger, har Molekylær prægning gennemført, at skabe kunstige genkendelsessekvenser supplerer skabelon molekyle, og obsoleting nødvendigheden af at bruge antistoffer for første bindende. Yderligere, for endnu højere følsomhed, den sekundære mærket antistof kan erstattes af biosensorer afhængige kapacitans for kvantificering af mål-molekyle. I denne protokol beskriver vi en metode til hurtigt og etiket-fri detektere og kvantificere lav-rigelige biomolekyler (proteiner og vira) i komplekse prøver, med en følsomhed, der er væsentligt bedre end almindeligt anvendte detektionssystemer såsom ELISA. Dette er alle medieret af molekylære prægning i kombination med en kapacitans biosensor.
Introduction
Kvantificering af biomolekyler bruges i mange forskellige forskningsområder inden for videnskab, beskæftiger metoder som radioimmunoassay (RIA) eller ELISA1. Nogle af disse metoder kræver en mærket reagens som en radioisotop eller enzym mærket antistof/antigen, hvilket gør dem arbejdskrævende og tidskrævende med komplekse procedurer2. Yderligere, robusthed, selektivitet og følsomhed af disse metoder er ikke tilstrækkeligt for alle analyser; især er de ikke tilstrækkelige, når attogram mængder skal analyseres, i stedet for piktogram mængder3. Til dette formål, har biosensorer opnået betydelig interesse4,5, især i kombination med molekylær prægning for en øget robusthed.
Molekylær prægning bygger på at skabe hulrum af polymeriserende funktionelle monomerer omkring den skabelon6, at skabe kunstige genkendelsessekvenser, der perfekt ligner skabelon7. Denne teknik er blevet brugt til flere applikationer, herunder drug delivery systems og analytisk adskillelse, men også som biorecognition elementer i biosensorer8,9,10. Men der er stadig nogle vanskeligheder i udformningen af molekylemæssigt påtrykt polymerer (MIPs) for makromolekylære skabeloner som proteiner og celler11,12. På grund af dette, har mange forskere fokuseret på prægning skabelon protein direkte på et substrat, således at der skabes en overflade, der vil blive genkendt af target protein12. Denne overfladebehandling teknik, der anvendes for at ansætte anerkendelse hulrum for store molekyler og forsamlinger, herunder proteiner kaldes microcontact prægning13,14. Den generelle fremgangsmåde for metoden afhænger polymerisering mellem to flader - en skabelon stempel og en polymer støtte - som skabelonen er adsorberet på en overflade15,16, og bragt i kontakt med den monomer-behandlet overflade. Ved denne måde dannes en tynd polymerfilm på support via UV-polymerisering. Endelig, fjernes skabelonen, efterlod skabelon specifikke hulrum på overfladen af den påtrykt elektrode. Denne metode har nogle fordele, herunder et reduceret aktivitet tab af påtrykt molekylet, såvel som der kræver meget små mængder af skabelon molekyler til prægning behandle16,17. Således, disse omkostningseffektive, stabile, følsom og selektiv overflader kan oprettes på sensor overflader, rettet mod en skabelon af brugerens valg.
Biosensor kan anvendes til påvisning af enkelt proteiner og meget større biomacromolecules, herunder vira. En bestemt gruppe af virus at få de seneste interesse er den bacteriophage, som er en virus, der inficerer bakterier. Hurtige og følsomme påvisning af Bakteriofager er vigtigt under bioteknologiske og biofarmaceutiske processer for at bestemme infektioner af bakteriel kulturer med Bakteriofager18. De mest almindeligt anvendte biologiske analyse for bacteriophage påvisning er dobbelt lag agar metode19som er besværlig og tidskrævende. Har gjort flere forsøg på at udvikle nye diagnostiske redskaber for vira (herunder Bakteriofager) atomic force mikroskopi (AFM)20, interferometri21, elektrokemi22og sensor system23, 24. en masse arbejde har været fokuseret på biosensorer på grund af deres fordele som er nem at betjene, meget følsomme, og i stand til real-time måling15,25. En bestemt type af biosensor er baseret på ændringer i kapacitans. Disse kapacitiv biosensorer er de elektrokemiske sensorer, der måler forandringer i de dielektriske egenskaber når en analysand interagerer med et biorecognition element på sensoren overfladen, forårsager et fald i kapacitans2,4 . Kapacitiv biosensorer har været anvendt til påvisning af forskellige analysander som antigener, antistoffer, proteiner og heavy metal ioner6,26,27,28. Disse typer af biosensorer har mange fordele som iboende hurtighed, høj følsomhed, enkelhed, lave omkostninger, nem manipulation og real-time måling uden mærkning29.
Den metode beskrevet heri er rettet mod muliggør påvisning og kvantificering af lav-rigelige biomolekyler i meget komplekse prøver, uden savn i bruger nogen mærkning. Især er teknikken mest nyttige i atto-pikogram vifte af biomolekyler, hvor andre kommercielt eksisterende instrumenter undlader at nøjagtigt kvantificere deres mål.
Protocol
1. ændring af glas dækning glider (skabelon frimærker)
- For at rengøre glas dækning underkjoler, Fordyb dem sekventielt i 10 mL af 1.0 M HCl, deioniseret vand og 1,0 M NaOH, henholdsvis, for 10 min i hvert trin i en ultralydsrenser ved stuetemperatur.
- Tørre glas dækning underkjoler med nitrogen gas.
Bemærk: Cover glider er tørret ved fordampning under en strøm af luftformigt kvælstof.
- Tørre glas dækning underkjoler med nitrogen gas.
- Fordyb rengjort og tørret dække smutter i 10% (v/v), 10 mL opløsning af 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) i ethanol for 1 h at indføre amino grupper på dækker glasoverfladen, ved stuetemperatur.
- Skyl dæksel glider med deioniseret vand.
- Tørre dæksel glider med nitrogen gas.
- Fordyb APTES-modificeret dække smutter i 5% (v/v), 10 mL opløsning af glutaraldehyd i 10 mM fosfat buffer (pH 7,4) i 2 timer for at aktivere de amino grupper på overfladen ved stuetemperatur6,15.
- Skyl dæksel glider med 10 mM fosfat buffer (pH 7,4) for at fjerne overskydende glutaraldehyd fra overfladen.
- Tørre dæksel glider med nitrogen gas.
- Forberede 1,0 mL af skabelon (protein/bacteriophage) løsning i 10 mM fosfat buffer (pH 7,4) i 0,1 mg/mL koncentration.
Bemærk: Opløses 0,1 mg protein i 1,0 mL af fosfat buffer (10 mM, pH 7,4). Hvis det er nødvendigt, et spektrofotometer (280 nm) kan bruges til at bestemme proteinkoncentration.- Drop 200 µL af denne skabelon løsning på de modificeret dække underkjoler og inkuberes ved 4 ° C natten over.
Bemærk: Den overskydende skabelon løsning kan bruges til at forberede 1-2 flere skabelon frimærker til at blive brugt i karakterisering undersøgelser. - Skyl dæksel glider med 10 mM fosfat buffer (pH 7,4) for at fjerne den ubundne skabelon fra overfladen.
Bemærk: For at skylle elektroderne, vaske dem med fosfat buffer (10 mM, pH 7,4) for 30 s. - Tørre dæksel glider med nitrogen gas.
Bemærk: Cover underkjoler skal opbevares ved 4 ° C, indtil de anvendes i trinnet polymerisering.
- Drop 200 µL af denne skabelon løsning på de modificeret dække underkjoler og inkuberes ved 4 ° C natten over.
2. ændring af kapacitiv guld elektroder
- At rengøre elektroderne, fordybe elektroder i et lille bæger, sekventielt, der indeholder 5 mL ethanol (70%), deioniseret vand, acetone, deioniseret vand, sure piranha løsning (3:1, H2SO4: H2O2, v/v), og deioniseret vand vand, henholdsvis i 10 min i hvert trin i en ultralydsrenser ved stuetemperatur.
- Tørre elektroder med nitrogen gas.
- For at udføre electropolymerization af tyramin, forberede 8 mL af 10 mM tyramin løsning i 10 mM fosfat buffer (pH 7,4) der indeholder ethanol (2 mL)15.
Bemærk: Det samlede volumen af tyramin løsning skal være 8 mL i alt herunder 2 mL ethanol.- Udføre cyklisk voltammetric scanninger (15 cykler) i denne løsning ved hjælp af en potentiostat, der dækker en potentiel vifte af 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) og en scan rate af 50 mV/s30.
- Skyl elektroder med deioniseret vand.
- Tørre elektroder med nitrogen gas.
- Fordyb elektroder i en oploesning indeholdende 30 mM acryloyl chlorid og 30 mM trimethylamin i toluen (Vsamlede = 5 mL) ved rumtemperatur natten over6,15,30.
- Skyl elektroder med deioniseret vand.
Bemærk: For at sikre en bedre fjernelse af ureageret acryloyl chlorid og trimethylamin rester, det er også muligt at vaske overfladen med NaOH efter deioniseret vand. - Tørre elektroder med nitrogen gas.
- Skyl elektroder med deioniseret vand.
3. forberedelse af skabelon præget kapacitiv guld elektroder
-
Forberedelse af bacteriophage præget kapacitiv guld elektroder
- Før polymerisering, forberede en monomer løsning indeholdende monomer (N-hydroxymethyl acrylamid) og tværs linker (polyethylenglycol-400-dimethacrylate) i et forhold på 1:5 (mol/mol) i 1 mL af 10 mM fosfat buffer (pH 7,4).
Bemærk: Monomer løsning indeholdende monomere og tværs linker kan bruges i forskellige nøgletal, eller typerne monomere og tværs linker kan ændres efter skabelonen til optimering af den konkrete interaktion. - Tilføj 1 mg af foto-initiativtager til denne løsning.
Bemærk: Hvis polymerisering er udført i UV-lys, derefter foto-initiativtager skal bruges til at indlede polymerisering. Hvis polymerisering udføres af frie radikaler polymerisering, skal type af initiatoren ændres. - Der afpipetteres 1,5 µL af denne løsning på guld overfladen af den modificerede guld elektrode.
Bemærk: Guld overfladen af elektroden er vist skematisk i figur 1. - Bringe skabelon stempel i kontakt med monomer løsning på toppen af guld elektrode overflade.
- Indlede UV polymerisation (365 nm, 400 W) og Fortsæt til 15 min31.
Bemærk: UV polymerisering udføres inde en afkøling kabinet, der er indstillet til 25 ° C før indlede polymerisering. Derefter, UV-lys hærdende systemet er tændt og polymerisering er fortsat for 15 min før du slukker for UV-lys hærdende system. - Fjerne skabelon-stempel fra overfladen ved hjælp af pincet.
Bemærk: Mens du fjerner skabelonen stempel fra overfladen, de polymere film på overfladen kan være beskadiget. Derfor, stempel skal fjernes fra overfladen meget forsigtigt og langsomt uden brug af kraft. - Skyl elektrode overfladen med deioniseret vand og tør det med nitrogen gas.
- Fordyb elektroder i 1 mL af 10 mM 1-dodecanethiol udarbejdet i ethanol i 20 min. for at dække pinholes på elektrode overflade.
- Skyl elektroder med deioniseret vand og tørre elektroder med nitrogen gas.
- Før polymerisering, forberede en monomer løsning indeholdende monomer (N-hydroxymethyl acrylamid) og tværs linker (polyethylenglycol-400-dimethacrylate) i et forhold på 1:5 (mol/mol) i 1 mL af 10 mM fosfat buffer (pH 7,4).
-
Forberedelse af Protein præget kapacitiv guld elektroder
- Før polymerisering, forberede en monomer løsning indeholdende monomerer (acrylamid: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µL; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) og tværs linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) i 820 µL af ultra rent vand30,32.
- Forberede 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) i ultra-rene vand.
- Tilføj 20 µL af opløsningen TEMED oploesningen monomere og rense med nitrogen gas for 5 min.
- Forberede 10% (w/v) ammonium persulphate (APS) i ultra-rene vand.
- Tilføj 20 µL af opløsningen APS i monomer løsning.
- Der afpipetteres 1,5 µL af opløsningen monomer overfladen, modificerede guld elektrode.
- Bringe skabelon stempel i kontakt med den monomer-behandlet overflade.
- Starte polymerisering ved stuetemperatur og fortsætte for 5 h.
Bemærk: Forberedelsen af protein-præget guld elektroder, i stedet for UV-polymerisering, er frie radikaler polymerisering ved stuetemperatur (25 ° C) udføres ved hjælp af APS-TEMED som initiator-katalysator. - Fjerne skabelon-stempel fra overfladen grundigt ved hjælp af pincet.
- Skyl elektrode med deioniseret vand og tør med nitrogen gas.
- Fordyb elektroder i 1 mL af 10 mM 1-dodecanethiol udarbejdet i ethanol i 20 min. for at dække pinholes på elektrode overflade.
- Skyl elektroder med deioniseret vand og tørre elektroder med nitrogen gas.
4. Karakteristik af elektrode overfladen med Scanning elektronmikroskopi (SEM)
- Monter enhederne på aluminium indehavere med selvklæbende carbon bånd.
- Coat elektroder med 10 nm palladium/guld.
- Undersøge elektroder med SEM.
5. realtid kapacitive målinger med skabelon præget kapacitiv guld elektroder
- Indsæt den elektrokemiske flow celle integreret til en kapacitiv biosensor påtrykt kapacitiv guld elektroderne.
- Forberede 100 mL regenerering buffer (25 mM glycin-HCl, pH 2,5, herunder 50 mM Tween-20) og 1 L kører buffer (for bacteriophage præget system: 10 mM fosfat, pH 7,4; for protein-præget system: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).
- Starte analysen med injektion af regenerering buffer til at regenerere system og kører buffer til re reagensglasset system i 25 min.
- Forberede standard skabelon løsninger i området ønskede koncentration i kører buffer.
Bemærk: Først forberede en bestand af skabelon løsningen ved at opløse 0,1 mg protein, eller cirka 108 pfu Bakteriofager, i 1,0 mL fosfat buffer (10 mM fosfat, pH 7,4). Derefter forberede standardopløsningerne for kalibreringskurven ved at gøre ti sekventielle 10-fold fortyndinger fra stamopløsningen. Disse løsninger vil blive analyseret med den kapacitive biosensor taktfast 5.5. Proteinkoncentration kan måles ved hjælp af et spektrofotometer (280 nm). For at måle bacteriophage koncentrationen, en dobbelt lag agar-metode kan bruges, der er beskrevet i detaljer tidligere19. - Injicere 250 µL af disse standardopløsninger sekventielt til systemet under optimale betingelser (strømningshastighed: 100 µL/min, temperatur: 25 ° C).
Bemærk: Denne ansøgning, standard protein løsninger blev udarbejdet i koncentrationsområde på 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, mens bacteriophage koncentrationer var i range 1,0 x 101 - 1,0 x 105 pfu/mL. Løsningerne, der var placeret i injektion ventil og sekventielt sprøjtes ind i systemet, indsprøjte prøver i tre gennem enkelt sprøjten pumpe og multiport ventil. Fald i kapacitans efter indsprøjtning kalibreringsopløsningerne som følge af binding af skabelon til påtrykt hulrum overvåges automatisk af instrumentets software.
Representative Results
Ved at følge protokollen, ifølge skematisk i figur 1, bliver en bare guld elektrode være påtrykt en skabelon, der repræsenterer en biomacromolecule struktur. Denne elektrode kan anvendes i en kapacitiv biosensor (figur 2), giver en stabil anvendelse af en skabelon på elektroden, og måling af ændringer i kapacitans ved binding af skabelonen.
En skematisk fremstilling af den kapacitive biosensor er vist i figur 2. Centris pumpen, som er ansvarlig for kontinuerlig indsprøjtning kører bufferen (10 mM fosfat, pH 7,4) og regenerering buffer (25 mM glycin-HCl, pH 2,5) under regenerering i cellen flow, ses tydeligt i figur. Flow-cellen består af arbejde, referencenummer og counter elektroder. Injektion ventilen er sammensat af standard protein/bacteriophage løsninger, der passerer gennem afgasser først og derefter injiceres sekventielt i systemet. Så snart løsningerne når arbejder elektrode indsat i cellen flow, er resultatet overvåget i realtid. Kapacitans værdier kan registreres ved at følge sensorgrams på computerskærmen.
Figur 3 og figur 4 skildrer forskelle mellem overfladen af nøgne og påtrykt guld elektroder. Trinnet karakterisering er vigtigt at sikre, at der er polymere hulrum, set som ruhed på overfladen af elektroden efter prægning. Bortset fra SEM, er der også andre karakterisering metoder herunder AFM, kontakt vinkel målinger, ellipsometry osv., der kan bruges til at karakterisere overfladen efter prægning. Ved på denne måde kan det sikres, at den prægning er vellykket og at skabelon hulrum er dannet på overfladen. Inden for disse hulrum, kan skabelonen binde med høj specificitet og affinitet.
Efter indsprøjtning af standardopløsninger i kapacitiv systemet, gennemsnit af de sidste fem aflæsninger var beregnes automatisk af softwaren, og kalibrering grafer blev indhentet af plotte ændringen i kapacitans vs koncentrationen af den analysandens. Faldet i registrerede kapacitans opstod fra bindingen af skabelonen. De mere molekyler, der bindes til den guld elektrode overflade, jo højere reduktion i samlede kapacitans, ifølge det almindelige princip om kapacitiv målinger. Figur 5 og figur 6 viser, at med stigende koncentration af analysanden, ΔC øger som forventet. Det dynamiske område (mellem hvilke er det koncentrationsområde, hvor systemet er nyttigt til påvisning af en specifik target) og detektionsgrænsen (LOD) kan evalueres ved at analysere disse grafer. Ifølge figur 6, bacteriophage præget kapacitiv biosensor kan registrere Bakteriofager i koncentrationsområde 101 - 105 pfu/mL, med en LOD værdien af 10 pfu/mL i denne undersøgelse. Figur 5 og figur 6 også fremhæve nødvendigheden af at måle kalibreringskurven i det samme interval påkrævet for skabelon koncentration formodes, da regression linearitet kan variere over koncentrationer ( Figur 5), eller har forskellige skråninger (figur 6). Det skal også bemærkes, at på grund af de lave koncentrationer anvendes, systemet er meget følsomme over for udsving (turbiditet i prøven, luft udkast, etc.), og det anbefales derfor, at køre mindst tre til at reducere potentialet i herunder outliers . Af samme grund kan standardafvigelsen være ganske betydelig for stærkt fortyndede prøver, som det ses i figur 6.
Figur 1 . Skematisk repræsentation af microcontact prægning metode. (A) forberedelse af glas dækning underkjoler (skabelon frimærker), (B) forberedelsen af de kapacitive guld elektroder, (C) microcontact prægning af skabelonen på guld elektrode overflade via UV-polymerisering, og (D) fjernelse af skabelon fra elektrode overflade (gengivet fra Ertürk et al., bioteknologi rapporter 2014 (3): 65-72 med tilladelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk fremstilling af den kapacitive biosensor. Det generelle layout af den kapacitive biosensor anvendes i denne undersøgelse (gengivet fra Ertürk et al., bioteknologi rapporter 2014 (3): 65-72 med tilladelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Scanning elektronmikroskopi af protein præget elektroder. SEM billeder af (A) en nøgne guld elektrode (skalalinjen = 20 µm), og (B) en protein præget kapacitiv guld elektrode (skalalinjen = 10 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Scanning elektronmikroskopi af bacteriophage præget elektroder. SEM billeder af en nøgen guld elektrode (skalalinjen = 20 µm) (A), og en bacteriophage præget kapacitiv guld elektrode i forskellige forstørrelser (6600 x skalalinjen = 10 µm) (B), og 11, 500 X, skala bar = 5 µm) (C); pile betegne overholdt Bakteriofager). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effekt af buffer sammensætning for kalibrering grafer. Kalibreringskurven viser ændringen i kapacitans vs en proteinkoncentration under optimale betingelser (kører Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; Regenerering Buffer: 25 mM glycin-HCl, pH 2,5 herunder 50 mM Tween-20; Strømningshastigheden: 100 µL/min, Sample volumen: 250 µL; T: 25 ° C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Repræsentativ kalibreringskurve for store biomacromolecules. Kalibreringskurven, der viser ændringen i kapacitans vs bacteriophage koncentration under optimale betingelser (kører Buffer: 10 mM fosfat, pH 7,4; Regenerering Buffer: 25 mM glycin-HCl, pH 2,5 herunder 50 mM Tween-20; Strømningshastigheden: 100 µL/min, Sample volumen: 250 µL; T: 25 ° C) venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Når denne metode udføres, er der nogle vigtige skridt, der skal overvejes, mens efter protokollen. Et kritisk trin er trinnet rengøring med sure piranha løsning. Trin 2.1 må ikke være mere end 10 min. Skabelon-løsning til trin 1.4 må ikke overstige 0,1 mg/mL, da disse værdier er blevet optimeret tidligere. Cyklisk voltametric scanninger må ikke overstige 15 cykler for at opnå den optimale tykkelse. For trin 3.1.3 er 1,5 µL en optimeret værdi. Denne værdi må ikke være højere for denne specifikke type af elektrode. Hvis UV hærdende system har en effekt på 400 W, skal så af polymerisering udføres til et maksimum på 10-15 min. Så snart APS (initiator) er tilføjet til løsningen efter TEMED, skal de efterfølgende trin udføres meget hurtigt for at undgå umiddelbare polymerisation (trin 3.2.5).
En af de mest kritiske trin er fjernelse af skabelon stempel fra overfladen efter UV polymerisering. Hvis dette trin ikke er udført korrekt, er der risiko for, at de polymere film på overfladen af elektrode kan blive fjernet med stempel. Det anbefales derfor, at nedsænke elektroden og protein stempel på toppen i en opløsning af vand efter polymerisering, derefter fjerne stempel meget langsomt og omhyggeligt fra overfladen (trin 3.1.6).
Baseret på skabelonen bruges, kan ændringer i type og forholdet mellem monomerer anvendes (funktionel monomere og tværs linker) vurderes med hensyn til generering af højere følsomhed. Dette skal bestemmes empirisk. Yderligere, affinitet bindingen af skabelon molekyle som regel involverer flere forskellige interaktioner samtidigt. Derfor kan dette føre til problemer under regenerering trin. Hvis den bundne skabelon ikke er udgivet fra overfladen korrekt, kan dette påvirke genbrugelighed af elektrode til yderligere analyse. Disse multipoint tilhørsforhold kan også skyldes bindende via svage vekselvirkninger. I sådanne systemer, kan ikke-specifik binding finde sted, som kan have en negativ indflydelse selektivitet system16. Disse er fælles, og generelle, begrænsninger af metoden.
Ud over disse specifikke begrænsninger er der mange væsentlige fordele ved metoden drøftet over eksisterende metoder. Mens RIAs, ringprøver og fluorometriske målinger er meget følsomme, kræver de brugen af mærket materiale (enten skabelonen eller detektor), mens biosensor er helt etiket-fri. Disse metoder er også dyrere og mere tidskrævende. En biosensor tilgang giver mulighed for hurtig, parallel syntese af mindsteimportpriserne i forskellige kompositioner på samme tid16. Da kun et par microliters af monomere løsning er påkrævet til forberedelse, er metoden praktisk, når du bruger dyre eller på anden måde begrænset monomerer. Yderligere, enkelt MIP elektroder kan bruges til ca 80 analyser uden en betydelig nedgang i ydelse, hvilket er betydeligt højere end andre eksisterende metoder30. Eksisterende metoder også lider, i varierende grader af lav følsomhed og selektivitet, mens den beskrevne metode giver mulighed for påvisning og kvantificering af molekyler i rækken pM med høj selektivitet.
På grund af omkostningseffektivitet, lethed af instrumentet, og real-time følsomme opdagelse i kort tid i forhold til eksisterende metoder, biosensorer er meget lovende punkt af pleje detektionssystemer under markforhold; f.eks.for miljøovervågning og programmer i udviklingslandene. I mange programmer inden for diagnosticering af sygdommen er real-time, følsom, selektiv og hurtig påvisning af en biomarkør i en kompleks blanding som serum påkrævet15,25. Her, er biosensorer overlegen i forhold til eksisterende metoder, navnlig på grund af deres robusthed og følsomhed. Specielt til påvisning af smitstoffer anses Bakteriofager for nylig som alternativ biorecognition element for biosensorer på grund af deres vært bakterier specificitet33,34,35. Udskiftning af antistoffer med Bakteriofager er meget lovende for at reducere omkostningerne og øge stabiliteten yderligere36. Et sådant system vil også give mulighed for påvisning og kvantificering af specifikke phages i miljøet og fra kliniske prøver. På grund af forekomsten af Bakteriofager, og deres evne til at transduce bakterier med antibiotisk resistens gener37,38, kan sådan en metode være værdifuldt at studere spredningen af resistent bakteriel.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Maria Baumgarten (IQ bioteknologi Platform, infektion medicin, Lunds Universitet) er anerkendt for udfører og leverer scanning elektron micrographs. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske forskning Rådet form (2017-00100) som en del af tredje fælles programmering initiativet antimikrobiel resistens (JPIAMR) kald "Transmission Dynamics." Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, tolkning, skrivning, forberedelse af manuskriptet, som beslutningen om at sende, eller afgørelse til at offentliggøre arbejdet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
| 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
| acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
| tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
| CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
| Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
| Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
| acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
| triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
| toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
| N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
| poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
| UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
| forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
| acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
| N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
| N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
| methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
| N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
| ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
| Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
| Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
| Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
| NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
| DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
| Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
| 2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
| CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |
References
- Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
- Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
- Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
- Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
- Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
- Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
- Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
- Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
- Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
- Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
- Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
- Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
- Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
- Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
- Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
- Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
- Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
- Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
- Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
- Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
- Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
- Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
- Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
- Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
- Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
- Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
- Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
- Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
- El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
- Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
- Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
- Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
- Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
- Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
- Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).
