Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للكشف والتحديد الكمي لجزيئات منخفضة وفيرة في حلول معقدة باستخدام الجزيئية ولﻷخذ بالاقتران مع بيوسينسور سعة.
Abstract
القدرة على الكشف عن وقوانتيتاتي الجزيئات الحيوية في الحلول المعقدة على الدوام رواجا عاليا في العلوم الطبيعية؛ وتستخدم للكشف عن المؤشرات الحيوية، والملوثات، والجزيئات الأخرى ذات الاهتمام. تقنية تستخدم عادة لهذا الغرض هو المرتبط بالانزيم الممتز الإنزيم (ELISA)، جسم واحد غالباً ما تتجه نحو جزيء مستهدفة محددة، حيث جسم مسمى ثاني يستخدم للكشف عن الأجسام المضادة الأولية، مما يسمح تقدير حجم المطلقة بيوموليكولي قيد الدراسة. ومع ذلك، يحد من استخدام الأجسام المضادة كعناصر الاعتراف بمتانة الأسلوب؛ لا الحاجة لاستخدام المسمى الجزيئات. للتغلب على هذه القيود، نفذت الطباعة الجزيئية، إنشاء مواقع الاعتراف اصطناعية مكملة لجزيء القالب ومن خلالها بضرورة استخدام الأجسام المضادة للربط الأولى. علاوة على ذلك، لحساسية أكبر، جسم المسمى ثانوية يمكن الاستعاضة عن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تعتمد على السعة للتحديد الكمي للجزيء المستهدف. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة سريعة وخالية من تسمية كشف وقوانتيتاتي الجزيئات الحيوية المنخفضة وفيرة (البروتينات والفيروسات) في العينات المعقدة، مع حساسية التي أفضل بكثير من أنظمة الكشف عن شائعة الاستخدام مثل ELISA. هذا هو كل ما بوساطة الطباعة الجزيئية في تركيبة مع بيوسينسور سعة.
Introduction
ويستخدم التقدير الكمي للجزيئات الحيوية في العديد من المجالات البحثية المختلفة في العلوم، واستخدام أساليب مثل radioimmunoassay (RIA) أو أليسا1. وتتطلب بعض هذه الأساليب المسمى كاشف مثل النظائر المشعة أو الإنزيم المسمى جسم/مستضد، مما يجعلها ذات العمالة الكثيفة وتستغرق وقتاً طويلاً مع الإجراءات المعقدة2. علاوة على ذلك، متانة، والانتقائية، والحساسية من هذه الأساليب لا تكفي لجميع التحليلات؛ لا سيما أنها ليست كافية عند كميات أتوجرام بحاجة إلى تحليل، بدلاً من الرسم التخطيطي كميات3. لهذا الغرض، اكتسبت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية اهتماما كبيرا4،5، وبخاصة في تركيبة مع طابعة الجزيئية لزيادة متانة.
الطباعة الجزيئية تعتمد على خلق تجاويف مبلمرة مونومرات الفنية حول قالب6، إنشاء مواقع الاعتراف الاصطناعية التي تشبه تماما في قالب7. وقد استخدم هذا الأسلوب للعديد من التطبيقات، بما في ذلك نظم إيصال المخدرات والفصل التحليلي، ولكن أيضا كعناصر بيوريكوجنيشن في أجهزة استشعار العوامل البيولوجية8،،من910. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض الصعوبات في تصميم مطبوع جزيئيا البوليمرات (MIPs) لقوالب الجزيئات مثل البروتينات والخلايا11،12. ونتيجة لهذا، ركزت العديد من الباحثين على ولﻷخذ البروتين القالب مباشرة على الركازة، وبالتالي إنشاء سطح سوف يتم التعرف عليه بواسطة البروتين الهدف12. وتسمى هذه التقنية طلاء السطح المستخدمة لتوظيف تجاويف الاعتراف للجزيئات الكبيرة والجمعيات بما في ذلك البروتينات ميكروكونتاكت ولﻷخذ13،14. الإجراءات العامة للأسلوب يعتمد على البلمرة بين الأسطح اثنين-طابع قالب ودعم بوليمر-التي تمتز على السطح15،واحد16هو القالب، وأحضر في اتصال مع مونومر المعالجة السطحية. بهذه الطريقة، يتم تشكيل فيلم بوليمر رقيقة على الدعم عن طريق الأشعة فوق البنفسجية--البلمرة. وأخيراً، تتم إزالة القالب، تاركين وراءهم تجاويف القالب محددة على سطح القطب مطبوع. هذا الأسلوب له بعض المزايا بما في ذلك خسارة انخفاض نشاط في جزيء مطبوع، عملية، فضلا عن أنها تتطلب كميات صغيرة جداً من جزيئات قالب للطباعة16،17. وهكذا، يمكن أن تنشأ هذه الأسطح الفعالة من حيث التكلفة، ومستقرة وحساسة، وانتقائية على السطوح الاستشعار، استهداف أي قالب من اختيار المستخدم.
يمكن استخدامها في بيوسينسور للكشف عن البروتينات وحيدة وبيوماكروموليكوليس أكبر بكثير، بما في ذلك الفيروسات. مجموعة محددة من الفيروسات اكتساب الفائدة الأخيرة هو عاثية، وهو فيروس الذي يصيب البكتيريا. المهم الكشف السريع وحساسة من باكتيريوفاجيس خلال البيوتكنولوجية والعمليات الصيدلانية البيولوجية من أجل تحديد حالات العدوى البكتيرية الثقافات مع باكتيريوفاجيس18. المقايسة البيولوجية الأكثر استخداماً للكشف عن عاثية هو أسلوب طبقة مزدوجة أجار19، شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. بذلت عدة محاولات لتطوير أدوات تشخيص الرواية للفيروسات (بما في ذلك باكتيريوفاجيس) مثل القوة الذرية مجهرية (فؤاد)20وقياس التداخل21، كهربية22واستشعار النظام23، 24-وركزت الكثير من العمل على أجهزة استشعار العوامل البيولوجية نظراً لمزاياها أنها سهلة التشغيل وحساسة للغاية، وقادرة على قياس الوقت الحقيقي15،25. يستند نوع معين من بيوسينسور إلى التغيرات في السعة. هذه السعة من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية بقياس التغيرات في خصائص العزل الكهربائي عند أكثر يتفاعل مع عنصر بيوريكوجنيشن على سطح جهاز الاستشعار، مما تسبب في حدوث انخفاض في السعة2،4 . وقد استخدمت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية بالسعة للكشف عن مختلف التحاليل مثل المستضدات والأجسام المضادة، والبروتينات والمعادن الثقيلة أيونات6،26،،من2728. هذه الأنواع من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية لها العديد من المزايا مثل السرعة المتأصلة وحساسية عالية، والبساطة، والتلاعب منخفضة التكلفة وسهلة والقياس في الوقت الحقيقي دون وسم29.
الأسلوب الموصوفة في هذه الوثيقة تهدف إلى تمكين الكشف والتحديد الكمي للجزيئات الحيوية المنخفضة وفيرة في عينات معقدة للغاية، دون الحاجة إلى استخدام أي تسمية. على وجه الخصوص، الأسلوب الأكثر فائدة في مجموعة حلول أتو من الجزيئات الحيوية، حيث فشل غيرها من الصكوك القائمة تجارياً لدقة كوانتيتاتي هدفهم.
Protocol
1-تعديل غطاء من الزجاج ينزلق (أختام القالب)
- لتنظيف كشوف غطاء الزجاج، تزج لهم التتابع في 10 مل من HCl والمياه 1.0 متر من هيدروكسيد الصوديوم، 1.0 متر على التوالي، لمدة 10 دقائق في كل خطوة في منظف الموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة.
- الجاف لكشوف غطاء الزجاج مع غاز النيتروجين.
ملاحظة: يتم المجففة كشوف الغطاء بالتبخر تحت تيار من غاز النيتروجين.
- الجاف لكشوف غطاء الزجاج مع غاز النيتروجين.
- تزج كشوف غطاء تنظيفها والمجفف في 10% (v/v)، حل 10 مل من 3-أمينو-بروبيل-تريثوكسيسيلاني (أبتيس) في الإيثانول ح 1 لعرض المجموعات الأمينية على سطح الزجاج غطاء، في درجة حرارة الغرفة.
- شطف كشوف الغطاء مع المياه.
- الجاف لكشوف الغلاف مع غاز النيتروجين.
- تزج كشوف غطاء تعديل أبتيس في 5% (v/v)، حل 10 مل من جلوتارالديهيدي في 10 ملم الفوسفات المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) لح 2 بغية تنشيط المجموعات الأمينية الموجودة على السطح، وفي درجة حرارة الغرفة6،15.
- شطف كشوف الغطاء مع المخزن المؤقت للفوسفات 10 مم (درجة الحموضة 7.4) من أجل إزالة glutaraldehyde الزائدة من على سطح الأرض.
- الجاف لكشوف الغلاف مع غاز النيتروجين.
- إعداد 1.0 مل من محلول قالب (بروتين/عاثية) في المخزن المؤقت الفوسفات 10 مم (درجة الحموضة 7.4) في تركيز 0.1 مغ/مل.
ملاحظة: حل 0.1 ملغ بروتين في 1.0 مل من المخزن المؤقت للفوسفات (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4). إذا لزم الأمر، جهاز المطياف الضوئي (280 nm) يمكن أن تستخدم لتحديد تركيز البروتين.- قطره 200 ميليلتر هذا الحل قالب على كشوف غطاء معدلة واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن استخدام الحل قالب الزائدة لإعداد طوابع قالب أكثر 1-2 لاستخدامها في دراسات التوصيف. - شطف كشوف الغطاء مع المخزن المؤقت للفوسفات 10 مم (درجة الحموضة 7.4) من أجل إزالة القالب غير منضم من على سطح الأرض.
ملاحظة: شطف الأقطاب، يغسل لهم مع العازلة الفوسفات (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 30 ثانية. - الجاف لكشوف الغلاف مع غاز النيتروجين.
ملاحظة: يجب تخزين كشوف الغطاء عند 4 درجة مئوية حتى يتم استخدامها في الخطوة البلمرة.
- قطره 200 ميليلتر هذا الحل قالب على كشوف غطاء معدلة واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
2-تعديل سعوي أقطاب الذهب
- لتنظيف أقطاب كهربائية، وتزج الأقطاب في كوب صغير، التتابع، التي تحتوي على 5 مل إيثانول (70 في المائة)، منزوع الماء، الأسيتون، المياه، حل البيرانا الحمضية (3:1، ح2هكذا4: ح2س2، v/v)، ومنزوع المياه، على التوالي لمدة 10 دقيقة في كل خطوة، الموجات فوق الصوتية أنظف في درجة حرارة الغرفة.
- الجاف للأقطاب مع غاز النيتروجين.
- من أجل إجراء اليكتروبوليميريزيشن الثيامين، إعداد 8 مل من 10 ملم الثيامين الحل في 10 ملم الفوسفات المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) الإيثانول (2 مل) تحتوي على15.
ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي للحل الثيامين مل 8 في المجموع بما في ذلك 2 مل إيثانول.- أداء دوري بالأشعة المهبطي (15 دورة) في هذا الحل باستخدام بوتينتيوستات تغطي محتملة تتراوح ما بين 0-1.5 V (Ag/AgCl) والمسح الضوئي بمعدل 50 mV/s30.
- شطف الأقطاب مع المياه.
- الجاف للأقطاب مع غاز النيتروجين.
- تزج أقطاب كهربائية في محلول يحتوي على كلوريد أكريلويل 30 ملم و trimethylamine 30 ملم في التولوين (الخامسالمجموع = 5 مل) في درجة حرارة الغرفة6،،من1530بين عشية وضحاها.
- شطف الأقطاب مع المياه.
ملاحظة: لضمان إزالة أفضل من أكريلويل الممتص بقايا كلوريد و trimethylamine، من الممكن أيضا أن يغسل السطح مع هيدروكسيد الصوديوم بعد المياه. - الجاف للأقطاب مع غاز النيتروجين.
- شطف الأقطاب مع المياه.
3-إعداد قالب مطبوع أقطاب الذهب بالسعة
-
إعداد عاثية مطبوع أقطاب الذهب بالسعة
- قبل البلمرة، إعداد محلول مونومر يحتوي على مركب (N-هيدروكسيميثيل اكريلاميد) وكروسلينكير (البولي إيثيلين جليكول-400-ديميثاكريلاتي) بنسبة 1:5 (مول/مول) في 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات 10 مم (درجة الحموضة 7.4).
ملاحظة: يمكن استخدام الحل مونومر يحتوي على مونومر وكروسلينكير في نسب مختلفة، أو يمكن تغيير أنواع مونومر وكروسلينكير وفقا للقالب للاستغلال الأمثل لتفاعل معين. - أضف 1 مغ من صور-البادئ في هذا الحل.
ملاحظة: إذا كان يتم إجراء البلمرة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ثم الصور-البادئ يجب استخدام الشروع في البلمرة. إذا كان يتم إجراء البلمرة واسطة البلمرة الراديكالية الحرة، يجب تغيير نوع البادئ. - "الماصة؛" 1.5 ميليلتر لهذا الحل على سطح الذهب القطب الذهب المعدلة.
ملاحظة: سيظهر على سطح الذهب القطب تخطيطياً في الشكل 1. - إحضار ختم قالب على اتصال مع الحل مونومر على رأس السطح القطب الذهب.
- بدء البلمرة الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 400 W) وتستمر لمدة 15 دقيقة31.
ملاحظة: يتم تنفيذ عملية البلمرة الأشعة فوق البنفسجية داخل خزانة تبريد التي يتم تعيين إلى-25 درجة مئوية قبل بدء البلمرة. ثم، يتم تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية علاج النظام والبلمره هو استمر لمدة 15 دقيقة قبل إيقاف تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية في علاج النظام. - إزالة الطابع القالب من على سطح الأرض باستخدام الملقط.
ملاحظة: أثناء إزالة الطابع القالب من على سطح الأرض، الفيلم البوليمرية على السطح قد يكون معطوباً. ولذلك، الختم يجب إزالة من على سطح الأرض بعناية فائقة وبطء دون استخدام القوة. - شطف سطح القطب مع المياه والجافة مع غاز النيتروجين.
- تزج الأقطاب في 1 مل من 10 ملم 1-دوديكانيثيول التي أعدت في الإيثانول لمدة 20 دقيقة من أجل تغطية الثقوب على سطح القطب.
- شطف الأقطاب مع المياه وتجفيف الأقطاب مع غاز النيتروجين.
- قبل البلمرة، إعداد محلول مونومر يحتوي على مركب (N-هيدروكسيميثيل اكريلاميد) وكروسلينكير (البولي إيثيلين جليكول-400-ديميثاكريلاتي) بنسبة 1:5 (مول/مول) في 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات 10 مم (درجة الحموضة 7.4).
-
إعداد البروتين مطبوع أقطاب الذهب بالسعة
- قبل البلمرة، إعداد محلول مونومر يحتوي على مونومرات (الاكريلاميد: 54 ملغ؛ ن-هيدروكسيميثيلاكريلاميدي: 140 ميليلتر؛ نيسوبروبيلاكريلاميدي: 85.6 مغ) وكروسلينكير (ميثيلينيبيساكريلاميدي: 9.5 ملغ) في 820 ميليلتر من الماء النقي فائقة30،32.
- إعداد 5% (v/v) N، N، N '، ن'--تيتراميثيليثيلدياميني (تيميد) في المياه النقية فائقة.
- إضافة 20 ميليلتر تيميد الحل إلى الحل مونومر وتطهير مع غاز النيتروجين لمدة 5 دقائق.
- إعداد بيرسولفاتي الأمونيوم 10% (w/v) (الجزائرية) في المياه النقية فائقة.
- إضافة 20 ميليلتر من وكالة الأنباء الجزائرية الحل إلى الحل مونومر.
- "الماصة؛" 1.5 ميليلتر من حل مركب على سطح القطب الذهب المعدلة.
- إحضار ختم القالب مع السطح يعامل مونومر.
- بدء البلمرة عند درجة حرارة الغرفة وتستمر ح 5.
ملاحظة: لإعداد مطبوع البروتين أقطاب الذهب، بدلاً من الأشعة فوق البنفسجية-البلمرة، يتم إجراء البلمرة الجذور الحرة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) باستخدام تيميد APS البادئ حفازاً. - إزالة الطابع القالب من على سطح الأرض بدقة باستخدام الملقط.
- شطف مسرى مع المياه وجاف مع غاز النيتروجين.
- تزج الأقطاب في 1 مل من 10 ملم 1-دوديكانيثيول التي أعدت في الإيثانول لمدة 20 دقيقة من أجل تغطية الثقوب على سطح القطب.
- شطف الأقطاب مع المياه وتجفيف الأقطاب مع غاز النيتروجين.
4-توصيف سطح القطب بالمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)
- تحميل العينات على أصحاب الألومنيوم بشريط لاصق الكربون.
- معطف الأقطاب مع 10 نانومتر البلاديوم/الذهب.
- بحث الأقطاب مع وزارة شؤون المرأة.
5. القياسات بالسعة في الوقت الحقيقي مع قالب مطبوع أقطاب الذهب بالسعة
- إدراج أقطاب الذهب بالسعة مطبوع في الخلية الكهروكيميائية تدفق متكامل بيوسينسور بالسعة.
- تحضير 100 مل من التجدد العازلة (25 مم جليكاين-HCl، الأس الهيدروجيني 2.5، بما في ذلك 50 مم توين-20) و 1 ل تشغيل المخزن المؤقت (عاثية مطبوع النظام: الفوسفات 10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4؛ لنظام مطبوع البروتين: 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4).
- بدء تشغيل التحليل مع حقن المخزن المؤقت للتجديد إعادة تكوين النظام وتشغيل المخزن المؤقت إعادة توازن النظام لمدة 25 دقيقة.
- إعداد قالب قياسي الحلول في نطاق التركيز المطلوب في تشغيل المخزن المؤقت.
ملاحظة: أولاً إعداد مخزون من حل القالب بتذويب البروتين 0.1 مغ، أو ما يقارب 108 بفو bacteriophages، في المخزن المؤقت للفوسفات مل 1.0 (الفوسفات 10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4). ثم، إعداد الحلول القياسية لمنحنى المعايرة بجعل عشرة تخفيف إذ متسلسلة من الحل الأسهم. وسيتم تحليل هذه الحلول مع بيوسينسور بالسعة في الخطوة 5، 5. يمكن قياس تركيز البروتين باستخدام جهاز المطياف الضوئي (280 nm). ولقياس تركيز عاثية، أسلوب أجار طبقة مزدوجة يمكن استخدامها، الذي يرد في تفاصيل سبق19. - ضخ 250 ميليلتر من هذه الحلول القياسية تسلسلياً إلى النظام في الظروف المثلى (معدل التدفق: 100 ميليلتر في الدقيقة، درجة الحرارة: 25 درجة مئوية).
ملاحظة: في هذا التطبيق، تم إعداد الحلول القياسية البروتين في تركيز يتراوح بين 1.0 × 10-4 -1، 0 × 10-14، بينما كانت التركيزات عاثية في نطاق 1.0 × 101 -1.0 × 105 بفو/مل. الحلول التي وضعت في صمام حقن وحقن التتابع في النظام، والحقن العينات في تريبليكاتيس من خلال ضخ حقنه واحدة وصمام متعدد المنافذ. رصد الانخفاض في السعة بعد الحقن الحلول القياسية الناجمة عن ربط القالب إلى تجاويف مطبوع تلقائياً البرمجيات الصك.
Representative Results
باتباع البروتوكول، طبقاً التخطيطي في الشكل 1، سوف مطبوع قطب الذهب عارية مع قالب، تمثل بنية بيوماكروموليكولي. يمكن تطبيق هذا القطب في بيوسينسور بالسعة (الشكل 2)، مما يتيح تطبيق قالب على مسرى مستقرة، وقياس التغيرات في السعة عند ربط القالب.
ويرد تمثيل تخطيطي بيوسينسور بالسعة في الشكل 2. ويمكن رؤية المضخة centris، والمسؤولة عن الحقن المستمر من المخزن المؤقت قيد التشغيل (الفوسفات 10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4)، وتجديد المخزن المؤقت (25 مم جليكاين-HCl، الأس الهيدروجيني 2.5) أثناء التجديد في الخلية تدفق، بوضوح في الشكل. تدفق الخلية يتكون من العامل، ومرجع، وعداد كهربائي. يتكون صمام حقن الحلول القياسية البروتين/عاثية، الذي يمر ديجاسير أولاً وثم حقن التتابع في النظام. أقرب الحلول التي تصل إلى مسرى العامل إدراجها في الخلية التدفق، ويتم رصد النتيجة في الوقت الحقيقي. ويمكن تسجيل قيم السعة باتباع سينسورجرامس على شاشة الكمبيوتر.
رقم 3 و رقم 4 تصور الاختلافات بين سطح أقطاب الذهب العارية ومطبوع. تعد هذه الخطوة توصيف مهمة لضمان أن هناك تجاويف البوليمرية، ينظر إليه خشونة على سطح القطب بعد الطباعة. وبصرف النظر عن وزارة شؤون المرأة، وهناك أيضا أساليب توصيف الأخرى بما في ذلك فؤاد، قياسات زاوية الاتصال، ellipsometry إلخ، التي يمكن استخدامها لتحديد خصائص السطح بعد الطباعة. بهذه الطريقة، فإنه يمكن ضمان أن عملية الطباعة ناجحة، وأن يتم تشكيل تجاويف القالب على السطح. داخل هذه التجاويف، يمكن ربط القالب مع خصوصية عالية وتقارب.
بعد حقن الحلول القياسية في النظام بالسعة، تم حساب متوسط القراءات الخمس الأخيرة تلقائياً بالبرنامج، وتم الحصول على الرسوم البيانية المعايرة برسم التغيير في السعة مقابل التركز أكثر. نشأ الانخفاض في السعة المسجلة من ربط القالب. الجزيئات أكثر أن الربط الكهربائي الذهب السطحي، ارتفاع الحد من السعة الإجمالية، وفقا للمبدأ العام للقياسات بالسعة. الرقم 5 و الرقم 6 تبين أن ΔC يزيد مع زيادة التركيز أكثر، كما هو متوقع. ويمكن تقييم النطاق الديناميكي (بين الذي هو نطاق التركيز فيها النظام مفيد للكشف عن هدف معين) والحد من الكشف عن (اللد) من خلال تحليل هذه الرسوم البيانية. وفقا الرقم 6، بيوسينسور بالسعة عاثية مطبوع يمكن اكتشاف bacteriophages بتركيز يتراوح بين 101 -بفو5 10/مل، مع قيمة اللد بفو 10/مل في هذه الدراسة. الرقم 5 و 6 الشكل أيضا تسليط الضوء على ضرورة قياس منحنى المعايرة في نفس الفترة الزمنية اللازمة لتركيز قالب من المفترض، حيث قد تختلف الخطي للانحدار على التركيزات ( 5 الرقم)، أو منحدرات مختلفة (الشكل 6). تجدر الإشارة أيضا إلى أنه نظراً لتركيزات منخفضة المستخدمة، النظام حساس جداً للتقلبات (التعكر في عينة، مشروع الهواء، إلخ)، وذلك، فمن المستحسن لتشغيل على الأقل تريبليكاتيس للحد من إمكانيات بما في ذلك القيم المتطرفة . لنفس السبب، الانحراف المعياري يمكن أن تكون كبيرة جداً للعينات مخففة جداً، كما هو موضح في الشكل 6.
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي من ميكروكونتاكت ولﻷخذ الأسلوب. (أ) إعداد كشوف غطاء الزجاج (قالب الطوابع)، (ب) إعداد أقطاب الذهب بالسعة، (ج) ميكروكونتاكت الطباعة من القالب على سطح القطب الذهب عن طريق الأشعة فوق البنفسجية--البلمرة، و (د) إزالة قالب من سطح القطب (مستنسخة من إرتورك et al.، التكنولوجيا الحيوية تقارير 2014 (3): 65-72 مع إذن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. التمثيل التخطيطي ل biosensor سعوي. التخطيط العام بيوسينسور بالسعة المستخدمة في هذه الدراسة (مستنسخة من إرتورك et al.، التكنولوجيا الحيوية تقارير 2014 (3): 65-72 مع إذن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. "فحص المجهر الإلكتروني" للبروتين مطبوع أقطاب. صور SEM من (أ) قطب الذهب عارية (شريط مقياس = 20 ميكرومتر)، و (ب) بروتين مطبوع القطب الذهب بالسعة (شريط مقياس = 10 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. "المسح الضوئي المجهر الإلكتروني" من عاثية مطبوع أقطاب. صور SEM القطب الذهب العارية (شريط مقياس = 20 ميكرومتر) (A)، ومطبوع عاثية القطب الذهب بالسعة في تكبير مختلفة (6600 x، مقياس بار = 10 ميكرون) (ب)، و 11، 500 X، مقياس بار = 5 ميكرومتر) (ج)؛ سهام الدلالة bacteriophages التقيد بها). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. تأثير تكوين المخزن المؤقت للرسوم البيانية المعايرة. معايرة رسم بياني يبين التغيير في السعة مقابل تركيز بروتين في الظروف المثلى (تشغيل المخزن المؤقت: 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ المخزن المؤقت للتجديد: 25 مم جليكاين-HCl، الأس الهيدروجيني 2.5 بما في ذلك 50 مم توين-20؛ معدل التدفق: 100 ميليلتر في الدقيقة، وحجم العينة: 250 ميليلتر؛ T: 25 درجة مئوية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. منحنى المعايرة الممثل لكبير بيوماكروموليكوليس- الرسم البياني المعايرة التي يظهر التغيير في السعة مقابل تركيز عاثية في الظروف المثلى (تشغيل المخزن المؤقت: الفوسفات 10 ملم، ودرجة الحموضة 7.4؛ المخزن المؤقت للتجديد: 25 مم جليكاين-HCl، الأس الهيدروجيني 2.5 بما في ذلك 50 مم توين-20؛ معدل التدفق: 100 ميليلتر في الدقيقة، وحجم العينة: 250 ميليلتر؛ T: 25 درجة مئوية) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
عندما ينفذ هذا الأسلوب، وهناك بعض الخطوات الهامة التي يجب مراعاتها في حين يتبع البروتوكول. خطوة حاسمة واحدة هو خطوة التنظيف مع الحل البيرانا الحمضية. لا يجب أن تكون الخطوة 2، 1 أكثر من 10 دقيقة. يجب إلا يتجاوز الحل قالب الخطوة 1.4 0.1 مغ/مل، حيث يكون قد تم تحسين هذه القيم مسبقاً. فحص دوري فولتاميتريك يجب إلا يتجاوز 15 دورات من أجل الحصول على سمك الأمثل. لخطوة 3.1.3، ميليلتر 1.5 القيمة أمثل. يجب أن لا تكون هذه القيمة أعلى بالنسبة لهذا النوع المحدد من القطب. إذا كان علاج نظام الأشعة فوق البنفسجية قوة 400 واط، فلابد البلمرة بحد أقصى 10-15 دقيقة. حالما يتم إضافة وكالة الأنباء الجزائرية (البادئ) إلى الحل بعد تيميد، الخطوة التالية يجب أن يتم بسرعة كبيرة لتجنب البلمرة الفوري (الخطوة 3.2.5).
إحدى الخطوات الأكثر أهمية هو إزالة الطابع القالب من على سطح الأرض بعد البلمرة الأشعة فوق البنفسجية. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح، هناك خطر أن الفيلم البوليمرية على سطح القطب قد تكون إزالتها بالختم. لذلك، من المستحسن أن تزج مسرى وختم البروتين على القمة في التوصل إلى حل للمياه بعد البلمرة، ثم إزالة الطابع ببطء شديد وعناية من على سطح الأرض (الخطوة 3.1.6).
استناداً إلى القالب المستخدم، يمكن تقييم التعديلات في نوع ونسبة المركبات الكيماوية المستخدمة (مونومر الوظيفية وكروسلينكير) من حيث توليد حساسية أعلى. وهذا يجب أن يحدد تجريبيا. علاوة على ذلك، ملزمة تقارب جزيء القالب عادة ما ينطوي على العديد من التفاعلات المختلفة في نفس الوقت. لذلك، قد يؤدي هذا إلى مشاكل أثناء خطوات التجديد. إذا لم يتم تحرير القالب منضم من على سطح الأرض بشكل صحيح، قد يؤثر هذا إعادة استخدام القطب لمزيد من التحليل. قد يؤدي أيضا إلى هذه الانتماءات متعددة من الربط عن طريق التفاعلات الضعيفة. في مثل هذه النظم، قد يستغرق الربط غير محددة المكان، التي يمكن أن تؤثر سلبا على القدرة الانتقائية ل النظام16. وهذه هي القيود المشتركة والعامة، للأسلوب.
وبصرف النظر عن هذه القيود المحددة، هناك العديد من المزايا الهامة طريقة بحث أكثر الأساليب القائمة. حين اتفاقات التكامل الإقليمي، والساس، والقياسات فلوروميتريك حساسة للغاية، فإنها تتطلب استخدام المواد المسمى (قالب أو كاشف)، في حين بيوسينسور تماما تسمية خالية. هذه الأساليب أيضا أكثر تكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. يسمح نهج بيوسينسور للتوليف السريع، موازية لخطط تنفيذ البعثات في التراكيب المختلفة في الوقت نفسه16. منذ فقط بضعة ميكروليتيرس من مونومر الحل مطلوب لإعداد، الأسلوب مناسب عند استخدام مونومرات محدودة باهظة الثمن أو غير ذلك. علاوة على ذلك، واحد أقطاب MIP يمكن استخدامها لحوالي 80 تحليلات دون حدوث انخفاض كبير في الأداء، وأعلى بكثير من غيرها الأساليب القائمة30. الأساليب القائمة تعاني أيضا، بدرجات متفاوتة، من حساسية منخفضة والانتقائية، بينما وصف الأسلوب يسمح للكشف والتحديد الكمي للجزيئات في حدود الساعة بانتقائية عالية.
بسبب الفعالية من حيث التكلفة، سهولة التشغيل في الصك، والكشف عن حساسية في الوقت الحقيقي في وقت قصير مقارنة بالأساليب القائمة، أجهزة استشعار العوامل البيولوجية جداً واعدة نقطة من رعاية نظم الكشف عن الظروف الميدانية؛ مثلاً، لرصد البيئة والتطبيقات في البلدان النامية. في العديد من التطبيقات في تشخيص المرض، هو الكشف في الوقت الحقيقي، والحساسية وانتقائية، والسريع من العلامات البيولوجية في خليط معقد مثل المصل المطلوبة15،25. هنا، متفوقة على الأساليب القائمة، على وجه الخصوص، نظراً لمتانة وحساسية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية. خصيصا للكشف عن العوامل المعدية، تعتبر bacteriophages مؤخرا كعنصر بيوريكوجنيتيون بديلة لأجهزة استشعار العوامل البيولوجية بسبب ما المضيف خصوصية البكتيريا33،،من3435. استبدال الأجسام المضادة مع bacteriophages واعدة جداً من أجل الحد من التكاليف وزيادة الاستقرار المزيد حتى36. كما سيسمح هذا نظام للكشف والتحديد الكمي فاجيس محددة في البيئة ومن العينات السريرية. نظراً لانتشار باكتيريوفاجيس، وقدرتها على ترانسدوسي البكتيريا مع جينات مقاومة المضادات الحيوية37،38، قد يكون من المفيد دراسة انتشار البكتيريا المقاومة مثل هذا أسلوب.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ماريا بومغارتن (منصة التكنولوجيا الأحيائية الذكاء، والعدوى الطب، جامعة لوند) المسلم لأداء وتوفير المسح الإلكترون ميكروجرافس. وكان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من Formas مجلس الأبحاث السويدية (2017-00100) كجزء من "الأوروبية الثالثة برمجة المبادرة المشتركة" المتعلقة بمقاومة مضادات الميكروبات (جبيامر) مكالمة "ديناميات انتقال". وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة، وتفسير، والكتابة، إعداد المخطوط، قرار بتقديم، أو قرار لنشر الأعمال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
| 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
| acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
| tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
| CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
| Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
| Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
| acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
| triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
| toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
| N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
| poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
| UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
| forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
| acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
| N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
| N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
| methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
| N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
| ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
| Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
| Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
| Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
| NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
| DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
| Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
| 2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
| CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |
References
- Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
- Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
- Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
- Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
- Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
- Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
- Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
- Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
- Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
- Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
- Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
- Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
- Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
- Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
- Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
- Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
- Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
- Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
- Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
- Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
- Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
- Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
- Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
- Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
- Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
- Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
- Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
- Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
- El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
- Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
- Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
- Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
- Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
- Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
- Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).
