Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/57208
Automatic Translation
1, 1
1Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Lund University

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.

Abstract

De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van biomoleculen in complexe oplossingen van oudsher zeer gewilde binnen de natuurwetenschappen; wordt gebruikt voor het opsporen van biomarkers, verontreinigingen en andere moleculen van belang. Een veelgebruikte techniek hiervoor is de Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), waar vaak een antilichaam is gericht op een specifieke doelmolecule, en een tweede gelabeld antilichaam wordt gebruikt voor het opsporen van het primaire antilichaam, rekening houdend met de absolute kwantificering van de Biomolecuul bestudeerde. Echter, het gebruik van antilichamen als erkenning elementen beperkt de robuustheid van de methode; net als de noodzaak van het gebruik van gelabelde moleculen. Deze beperkingen wilt opheffen, is moleculaire inprenting geïmplementeerd, maken van kunstmatige erkenning sites ter aanvulling van het sjabloon molecuul en obsoleting de noodzaak van het gebruik van antilichamen voor de eerste binding. Verder, voor nog hogere gevoeligheid, de secundaire gelabeld antilichaam kan worden vervangen door biosensoren afhankelijk van de capaciteit voor de kwantificering van de doelmolecule. In dit protocol beschrijven we een methode om snel en label-gratis detecteren en kwantificeren van lage-overvloedig biomoleculen (eiwitten en virussen) in complexe monsters, met een gevoeligheid die aanzienlijk beter is dan gebruikte detectiesystemen zoals de ELISA. Dit is allemaal gemedieerd door moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.

Introduction

De kwantificering van biomoleculen wordt gebruikt in veel verschillende onderzoeksgebieden binnen de wetenschap, methodes als de radioimmunoanalyse (RIA) of ELISA1dienst. Sommige van deze methoden vereisen een gelabelde reagens zoals een isotoop of enzyme gelabeld antilichaam/antigeen, waardoor ze arbeidsintensief en tijdrovende met ingewikkelde procedures2. Verder, de robuustheid, de selectiviteit en de gevoeligheid van deze methoden volstaan niet voor alle analyses; in het bijzonder zijn zij niet voldoende als attogram hoeveelheden worden geanalyseerd moeten, in plaats van pictogram hoeveelheden3. Voor dit doel, hebben biosensoren opgedaan belangstelling4,5, in het bijzonder in combinatie met moleculaire inprenting voor een verhoogde robuustheid.

Molecular imprinting, is afhankelijk van de holten maken door functionele monomeren rond de sjabloon6, het creëren van kunstmatige erkenning sites die perfect lijken op de sjabloon7actinemonomeren. Deze techniek is gebruikt voor verschillende toepassingen, met inbegrip van de drug delivery systems en analytische scheiding, maar ook als biorecognition elementen in biosensoren8,9,10. Er zijn echter nog steeds enkele problemen in het ontwerp van moleculair ingeprinte polymeren (MIPs) voor macromoleculaire sjablonen zoals eiwitten en cellen11,12. Wegens dit, hebben vele onderzoekers gericht op Inprenting van het eiwit van de sjabloon rechtstreeks op een substraat, dus het creëren van een oppervlak dat zal worden herkend door de doelgroep eiwit12. Deze oppervlaktecoating techniek die gebruikt wordt voor de toepassing van erkenning Holten voor grote moleculen en verzamelingen met inbegrip van eiwitten heet microcontact inprenting13,14. De algemene procedure voor de methode hangt af van de polymerisatie tussen twee oppervlakken - een stempel van de sjabloon en de ondersteuning van een polymeer - op grond waarvan de sjabloon is geadsorbeerd op één oppervlak15,16, en bracht in contact met de monomeer-behandelde oppervlak. Door op deze manier wordt een dunne polymeerfolie gevormd op de steun via UV-polymerisatie. Tot slot, de sjabloon wordt verwijderd, de specifieke Holten sjabloon aan het oppervlak van de ingeprinte elektrode achterlaat. Deze methode heeft een aantal voordelen, waaronder het verlies van een verminderde activiteit van de ingeprinte molecule, ook als die zeer kleine hoeveelheden van moleculen van de sjabloon voor de inprenting verwerken16,17. Dus, deze kosteneffectieve, stabiel, gevoelige en selectieve oppervlakken kunnen worden gemaakt op de oppervlakken van de sensor, gericht op een sjabloon voor de keuze van de gebruiker.

De biosensor kan worden gebruikt voor de detectie van enkele eiwitten en veel grotere biomacromoleculen, met inbegrip van virussen. Een specifieke groep van virussen die recente belangstelling is de bacteriofaag, die is een virus dat bacteriën infecteert. Snelle en gevoelige detectie van bacteriofagen is belangrijk tijdens de biotechnologische en biofarmaceutische processen om te bepalen van de infecties van bacteriële culturen met bacteriofagen18. De meest gebruikte biologische bepaling voor de detectie van de bacteriofaag is de dubbellaags agar methode19, dat is moeizaam en tijdrovend. Verschillende pogingen zijn gedaan om de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten voor virussen (bacteriofagen inclusief) zoals atomaire kracht microscopie (AFM)20, interferometrie21, elektrochemie22en sensor systeem23, 24. een heleboel werk is gericht geweest op biosensoren vanwege hun voordelen als zijnde geschikt voor real-time meting15,25, eenvoudig te bedienen en zeer gevoelig. Een bepaald soort biosensor is gebaseerd op veranderingen in capaciteit. Deze capacitieve biosensoren zijn de elektrochemische sensoren die meten van veranderingen in de diëlektrische eigenschappen wanneer een analyt met een biorecognition-element op het sensoroppervlak communiceert, waardoor een vermindering van de capaciteit2,4 . Capacitieve biosensoren zijn gebruikt voor de detectie van verschillende analyten zoals antigenen, antilichamen, proteïnen en zware metaal ionen6,26,27,28. Deze types van biosensoren hebben veel voordelen zoals inherente snelheid, hoge gevoeligheid, eenvoud, lage kosten, gemakkelijke manipulatie en real-time meting zonder etikettering van29.

De hier beschreven methode is gericht op het inschakelen van de opsporing en kwantificering van lage-overvloedig biomoleculen in zeer complexe monsters, zonder de noodzaak van het gebruik van elke labeling. In het bijzonder, is de techniek vooral handig in het bereik van atto-picogram van biomoleculen, waar andere commercieel bestaande instrumenten niet hun doel nauwkeurig te kwantificeren.

Protocol

1. wijziging van glasdeel glijdt (sjabloon Stamps)

  1. Voor de reiniging van het glas cover slips, dompel onder hen opeenvolgend in 10 mL van 1,0 M HCl, gedeïoniseerd water en 1,0 M van NaOH, respectievelijk, gedurende 10 minuten in elke stap in een ultrasone reiniger bij kamertemperatuur.
    1. Droog de glazen cover slips met stikstofgas.
      Opmerking: De cover-slips zijn gedroogd door verdamping onder een stroom van gasvormige stikstof.
  2. Dompel de gereinigde en gedroogde cover slips in 10% (v/v), 10 mL oplossing van 3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) in ethanol voor 1 h om amino groepen op de cover glasoppervlak, bij kamertemperatuur.
    1. Spoel de cover slips met gedeïoniseerd water.
    2. Droog de cover slips met stikstofgas.
  3. Dompel de APTES gemodificeerde cover slips in 5% (v/v), 10 mL oplossing van Glutaaraldehyde in 10 mM fosfaatbuffer (pH 7.4) gedurende 2 uur om te activeren de amino groepen op het oppervlak, op kamertemperatuur6,15.
    1. Spoel de cover slips met 10 mM fosfaatbuffer (pH 7.4) om het verwijderen van overtollige Glutaaraldehyde van het oppervlak.
    2. Droog de cover slips met stikstofgas.
  4. Bereiden van 1,0 mL oplossing van de sjabloon (eiwit/bacteriofaag) in 10 mM fosfaatbuffer (pH 7.4) in een concentratie van 0,1 mg/mL.
    Opmerking: Los 0,1 mg eiwit in 1,0 mL fosfaatbuffer (10 mM, pH 7.4). Indien nodig, een spectrofotometer (280 nm) kan worden gebruikt om te bepalen van de eiwitconcentratie.
    1. Drop 200 µL van deze sjabloon oplossing op de gewijzigde cover slips en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
      Opmerking: De oplossing van de overtollige sjabloon kan worden gebruikt om te bereiden 1-2 meer sjabloon stempels worden gebruikt in de studie van karakterisering.
    2. Spoel de cover slips met 10 mM fosfaatbuffer (pH 7.4) om het verwijderen van de niet-afhankelijke sjabloon van het oppervlak.
      Opmerking: Om te spoelen de elektroden, wassen ze met fosfaatbuffer (10 mM, pH 7.4) voor 30 s.
    3. Droog de cover slips met stikstofgas.
      Opmerking: De cover glijdt moeten worden bewaard bij 4 ° C totdat ze worden gebruikt in de polymerisatie stap.

2. wijziging van capacitieve gouden elektroden

  1. Reinigen van de elektroden, dompel de elektroden in een bekerglas van kleine opeenvolgend, met 5 mL ethanol (70%), gedeïoniseerd water, aceton, gedeïoniseerd water, zure piranha-oplossing (3:1, H2SO4: H2O2, v/v), en gedeïoniseerd water, respectievelijk voor 10 min in elke stap, in een ultrasone reiniger bij kamertemperatuur.
    1. Droog de elektroden met stikstofgas.
  2. Om de electropolymerization van tyramine, 8 mL 10 mM tryptamines oplossing in 10 mM fosfaat buffer (pH 7.4) met ethanol (2 mL)15te bereiden.
    Opmerking: Het totale volume van de oplossing van tyramine moet 8 mL in totaal inclusief 2 mL ethanol.
    1. Cyclische voltammetric scans (15 cycli) uitvoeren in deze oplossing met behulp van een potentiostaat die betrekking hebben op een potentieel bereik van 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) en een scanfrequentie van 50 mV/s30.
    2. Spoel de elektroden met gedeïoniseerd water.
    3. Droog de elektroden met stikstofgas.
  3. Dompel de elektroden in een oplossing met 30 mM acryloyl chloride en 30 mM trimethylamine in tolueen (totale V = 5 mL) bij kamertemperatuur 's nachts6,15,30.
    1. Spoel de elektroden met gedeïoniseerd water.
      Opmerking: Om ervoor te zorgen een betere verwijdering van spoorverontreiniging acryloyl chloride en trimethylamine residuen, is het ook mogelijk om het oppervlak met NaOH wassen na gedeïoniseerd water.
    2. Droog de elektroden met stikstofgas.

3. voorbereiding van de sjabloon bedrukt capacitieve gouden elektroden

  1. Voorbereiding van de bacteriofaag bedrukt capacitieve gouden elektroden
    1. Voorafgaand aan de polymerisatie, bereid een oplossing van de monomeer met monomeer (N-hydroxymethyl acrylamide) en cross-linker (polyethyleenglycol-400-dimethacrylaat) in een verhouding van 1:5 (mol/mol) in 1 mL 10 mM fosfaatbuffer (pH 7.4).
      Opmerking: De monomeer-oplossing met monomeer- en cross-linker kan worden gebruikt in verschillende verhoudingen of de soorten het monomeer en cross-linker kunnen worden gewijzigd volgens de sjabloon voor de optimalisatie van de specifieke interactie.
    2. 1 mg van foto-initiator toevoegen aan deze oplossing.
      Opmerking: Als de polymerisatie onder UV-licht gebeurt, vervolgens de foto-initiator moet worden gebruikt voor de polymerisatie initiëren. Als de polymerisatie door vrije radicaal polymerisatie gebeurt, moet het type van de initiatiefnemer worden gewijzigd.
    3. Pipetteer 1.5 µL van deze oplossing op het gouden oppervlak van de gemodificeerde gouden elektrode.
      Opmerking: Het gouden oppervlak van de elektrode wordt schematisch weergegeven in Figuur 1.
    4. Breng de stempel van de sjabloon in contact met de monomeer-oplossing op de top van de gouden elektrode oppervlakte.
    5. De UV polymerisatie initiëren (365 nm, 400 W) en blijven voor 15 min31.
      Opmerking: UV polymerisatie is uitgevoerd in een koeling kast die is ingesteld op-25 ° C voordat de polymerisatie. Vervolgens het UV-licht uithardende systeem is ingeschakeld en de polymerisatie is voortgezet gedurende 15 minuten voordat het UV-licht uithardende systeem uitschakelen.
    6. De stempel van de sjabloon van het oppervlak verwijderen met pincet.
      Opmerking: Tijdens het verwijderen van de stempel van de sjabloon van het oppervlak, de polymere film op het oppervlak mogelijk beschadigd. Daarom moet het stempel worden verwijderd van het oppervlak zorgvuldig en langzaam zonder gebruik van geweld.
    7. Spoel het oppervlak van de elektrode met gedeïoniseerd water en droog het met stikstofgas.
    8. Dompel de elektroden in 1 mL 10 mM 1-dodecaanthiol in ethanol voorbereid 20 min ter dekking van de gaatjes op het oppervlak van de elektrode.
    9. De elektroden met gedeïoniseerd water spoelen en drogen van de elektroden met stikstofgas.
  2. Voorbereiding van eiwit bedrukt capacitieve gouden elektroden
    1. Voorafgaand aan de polymerisatie, bereid een monomeer-oplossing met monomeren (acrylamide: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µL; N-isopropylacrylamide: 85.6 mg) en cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) in 820 µL van ultra pure water30,32.
    2. Bereiden van 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) in ultra zuiver water.
    3. Voeg 20 µL van de TEMED-oplossing in de oplossing van het monomeer en purge met stikstofgas gedurende 5 minuten.
    4. 10% (m/v) ammonium persulfaat (APS) in ultra zuiver water voor te bereiden.
    5. Voeg 20 µL van de APS-oplossing in de monomeer-oplossing.
    6. Pipetteer 1.5 µL van het monomeer oplossing op het oppervlak van de gemodificeerde gouden elektrode.
    7. Breng de stempel van de sjabloon in contact met het monomeer-behandelde oppervlak.
    8. Start van de polymerisatie op kamertemperatuur en blijven gedurende 5 uur.
      Opmerking: Voor de bereiding van eiwit-bedrukt gouden elektroden, in plaats van UV-polymerisatie, vrije radicalen polymerisatie bij kamertemperatuur (25 ° C) wordt uitgevoerd met behulp van APS-TEMED als de initiatiefnemer-katalysator.
    9. De stempel van de sjabloon van het oppervlak zorgvuldig verwijderen met behulp van de verlostang.
    10. De elektrode met gedeïoniseerd water afspoelen en droog met stikstofgas.
    11. Dompel de elektroden in 1 mL 10 mM 1-dodecaanthiol in ethanol voorbereid 20 min ter dekking van de gaatjes op het oppervlak van de elektrode.
    12. De elektroden met gedeïoniseerd water spoelen en drogen van de elektroden met stikstofgas.

4. karakterisering van het oppervlak van de elektrode met Scanning elektronen microscopie (SEM)

  1. Monteer de specimens op aluminium houders met Zelfklevende carbon tape.
  2. Coat de elektroden met 10 nm palladium/goud.
  3. Onderzoeken van de elektroden met SEM.

5. real-time capacitieve metingen met sjabloon bedrukt capacitieve gouden elektroden

  1. De ingeprinte capacitieve gouden elektroden invoegen in de cel van de elektrochemische stroom aan een capacitieve biosensor geïntegreerd.
  2. Bereiden van 100 mL van regeneratie buffer (25 mM glycine-HCl, pH 2.5, met inbegrip van 50 mM Tween-20) en 1 L lopende buffer (voor bacteriofaag bedrukt systeem: 10 mM fosfaat, pH 7.4; voor eiwit-bedrukt systeem: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4).
  3. Begin de analyse met de injectie van regeneratie buffer voor de regeneratie van het systeem en de lopende buffer opnieuw equilibreer het systeem gedurende 25 minuten.
  4. Standaard template oplossingen in het bereik van de gewenste concentratie in het runnen van de buffer voor te bereiden.
    Opmerking: Eerst een voorraad van de oplossing van de sjabloon voorbereiden door ontbinding van 0,1 mg eiwit, of ongeveer 108 pfu bacteriofagen, in 1,0 mL fosfaatbuffer (10 mM fosfaat, pH 7.4). Vervolgens bereid de standaardoplossingen voor de ijkcurve door tien opeenvolgende 10-fold verdunningen van de stamoplossing te maken. Deze oplossingen worden geanalyseerd met de capacitieve biosensor in stap 5.5. Eiwitconcentratie kan worden gemeten met behulp van een spectrofotometer (280 nm). Om te meten de bacteriofaag concentratie, een dubbele laag agar methode kan worden gebruikt, die wordt beschreven in gegevens eerder19.
  5. Injecteren van 250 µL van deze standaardoplossingen opeenvolgend aan het systeem in optimale omstandigheden (debiet: 100 µL/min, temperatuur: 25 ° C).
    Opmerking: In deze aanvraag, de standaard eiwit oplossingen werden voorbereid in het concentratiebereik van 1,0 x 10-4 - 1.0 x 10-14, terwijl de bacteriofaag-concentraties in de reeks 1.0 x 101 - 1.0 x 105 pfu/mL waren. De oplossingen werden geplaatst in de injectie-klep en opeenvolgend geïnjecteerd in het systeem de monsters in triplicates te injecteren via de interne-spuitpomp en de multipoort ventiel. De afname van de capaciteit na het injecteren van de standaardoplossingen die voortvloeien uit de afhankelijkheid van de sjabloon naar de ingeprinte Holten wordt automatisch gecontroleerd door de software van het instrument.

Representative Results

Door het volgen van het protocol, volgens het schema in Figuur 1, zal een kale gouden elektrode worden bedrukt met een sjabloon, vertegenwoordigen de structuur van een biomacromolecule. Deze elektrode kan worden toegepast in een capacitieve biosensor (Figuur 2), waardoor de stabiele toepassing van een sjabloon op de elektrode en de meting van veranderingen in capaciteit op de binding van de sjabloon.

Een schematische weergave van de capacitieve biosensor is afgebeeld in Figuur 2. De centris-pomp, die verantwoordelijk voor de voortdurende injectie van de lopende buffer (10 mM fosfaat, pH 7.4), en de regeneratie-buffer (25 mM glycine-HCl, pH 2.5) tijdens regeneratie in de cel van de stroom is, kan duidelijk worden gezien in de afbeelding. De stroom cel bestaat uit werken, verwijzing en teller elektroden. De injectie ventiel is samengesteld uit standaard eiwit/bacteriofaag oplossingen, die zijn langs de degasser eerst en vervolgens geïnjecteerd opeenvolgend in het systeem. Zodra de oplossingen de elektrode van de werken in de stroom cel ingevoegd bereiken, wordt het resultaat gecontroleerd in real-time. De waarden van de capaciteit kunnen worden geregistreerd door het volgen van de sensorgrams op het computerscherm.

Figuur 3 en Figuur 4 verbeelden de verschillen tussen het oppervlak van de kale en ingeprinte gouden elektrodes. Deze karakterisering stap is belangrijk om ervoor te zorgen dat er polymere Holten, gezien als ruwheid op het oppervlak van de elektrode na inprenting. Naast SEM, zijn er ook andere karakteriseringsmethoden met inbegrip van de AFM, contacthoek metingen, enz., die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van het oppervlak na inprenting ellipsometrie. Door op deze manier kan worden gewaarborgd dat het proces imprinting succesvol is en dat de sjabloon holtes worden gevormd op het oppervlak. Binnen deze holten, kan de sjabloon binden met hoge specificiteit en affiniteit.

Na het injecteren van de standaardoplossingen in het capacitieve systeem, een gemiddelde van de laatste vijf metingen automatisch berekend door de software en de kalibratie-grafieken werden verkregen door het uitzetten van de verandering in capaciteit vs. de concentratie van de analyt. De afname van de geregistreerde capaciteit is ontstaan uit de binding van de sjabloon. De meer moleculen die zich binden aan de gouden elektrode oppervlakte, hoe hoger de afname van de totale capaciteit, volgens het algemene beginsel van capacitieve metingen. Figuur 5 en Figuur 6 laten zien dat met de toenemende concentratie van de analyt, de ΔC verhoogt zoals verwacht. Het dynamisch bereik (waartussen is het concentratiebereik waar het systeem handig voor het opsporen van een specifiek streefcijfer is) en de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) kunnen worden geëvalueerd door het analyseren van deze grafieken. Volgens Figuur 6, kan de bacteriofaag bedrukt capacitieve biosensor bacteriofagen detecteren in het concentratiebereik 101 - 105 pfu/mL, met een LOD-waarde voor 10 pfu/mL in deze studie. Zowel Figuur 5 en Figuur 6 ook hoogtepunt de noodzaak voor het meten van de kalibratiekromme in hetzelfde interval nodig zijn voor de concentratie van de sjabloon wordt verondersteld, want de lineariteit van de regressie kan variëren over de concentraties ( Figuur 5), of hebben verschillende hellingen (Figuur 6). Ook opgemerkt moet worden dat vanwege de lage concentraties gebruikt, het systeem is heel gevoelig voor schommelingen (troebelheid in monster, kruiphoogte, etc.) en het is daarom raadzaam om uit te voeren ten minste triplicates om het potentieel van met inbegrip van uitschieters . Om dezelfde reden kunnen de standaarddeviatie zeer belangrijk voor sterk verdunde monsters, zoals te zien in Figuur 6.

Figure 1
Figuur 1 . Schematische weergave van de microcontact methode inprenting. (A) voorbereiding van de glazen cover slips (sjabloon stempels), (B) opstellen van de capacitieve gouden elektroden, (C) microcontact Inprenting van de sjabloon op het oppervlak van de gouden elektrode via UV-polymerisatie, en (D) verwijdering van de sjabloon van het elektrode-oppervlak (gereproduceerd van Ertürk et al., biotechnologie verslagen 2014 (3): 65-72 met toestemming). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Schematische weergave van de capacitieve biosensor. De algemene lay-out van de capacitieve biosensor gebruikt in deze studie (gereproduceerd van Ertürk et al., biotechnologie verslagen 2014 (3): 65-72 met toestemming). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Scanning elektronenmicroscopie van eiwit bedrukt elektroden. SEM beelden van (A) een kale gouden elektrode (schaal bar = 20 µm), en (B) een eiwit bedrukt capacitieve gouden elektrode (schaal bar = 10 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Scanning elektronenmicroscopie van bacteriofaag bedrukt elektroden. SEM beelden van een kale gouden elektrode (schaal bar = 20 µm) (A), en een bacteriofaag bedrukt capacitieve gouden elektrode in verschillende vergrotingen (6600 x, schaal bar = 10 µm) (B), en 11, 500 X, schaal bar = 5 µm) (C); pijlen duiden zelfklevend bacteriofagen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Effect van buffer compositie voor kalibratie grafieken. Ijklijn de verandering in capaciteit vs. een eiwitconcentratie in optimale omstandigheden te tonen (Running Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; Regeneratie Buffer: 25 mM glycine-HCl, pH 2.5 met inbegrip van 50 mM Tween-20; Debiet: 100 µL/min, monstervolume: 250 µL; T: 25 ° C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. Vertegenwoordiger kalibratiekromme voor grote biomacromoleculen. Ijklijn waarin de verandering in capaciteit vs. bacteriofaag concentratie in optimale omstandigheden (Running Buffer: 10 mM fosfaat, pH 7.4; Regeneratie Buffer: 25 mM glycine-HCl, pH 2.5 met inbegrip van 50 mM Tween-20; Debiet: 100 µL/min, monstervolume: 250 µL; T: 25 ° C) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Wanneer deze methode wordt uitgevoerd, zijn er enkele essentiële stappen die moeten worden beschouwd, terwijl het volgens het protocol. Een kritieke stap is de schoonmaak stap met zure piranha-oplossing. Stap 2.1 mag niet meer dan 10 min. De oplossing van de sjabloon voor stap 1.4 mag niet meer dan 0,1 mg/mL, aangezien deze waarden eerder zijn geoptimaliseerd. Cyclische voltametric scans mag niet hoger zijn dan 15 cycli met het oog op de optimale dikte. Voor stap 3.1.3 is 1.5 µL een geoptimaliseerde waarde. Deze waarde mag niet hoger voor dit specifieke type van elektrode. Als de UV uitharden systeem een vermogen van 400 W heeft, dan is de polymerisatie moet worden uitgevoerd voor een maximum van 10-15 min. Zodra de APS (initiatiefnemer) wordt toegevoegd aan de oplossing na TEMED, moet de volgende stap zeer snel worden uitgevoerd om te voorkomen dat onmiddellijke polymerisatie (stap 3.2.5).

Een van de belangrijkste stappen is de opruiming van de stempel van de sjabloon van het oppervlak na UV polymerisatie. Als deze stap is niet goed uitgevoerd, bestaat het risico dat de polymere film op het oppervlak van de elektrode kan worden verwijderd met de stempel. Daarom is het aanbevolen om de elektrode en de eiwit-stempel op de top in een oplossing van water onderdompelen na de polymerisatie en deze vervolgens verwijdert de stempel zeer langzaam en zorgvuldig van het oppervlak (stap 3.1.6).

Gebaseerd op de sjabloon gebruikt, kunnen wijzigingen in het type en de verhouding van monomeren gebruikt (functionele monomeer en cross-linker) worden beoordeeld in termen van het genereren van hogere gevoeligheid. Dit moet empirisch worden bepaald. Verder, de affiniteit binding van het sjabloon molecuul meestal gaat om verscheidene verschillende interacties gelijktijdig. Daarom kan dit tot problemen leiden tijdens de regeneratie stappen. Als de afhankelijke sjabloon niet wordt vrijgegeven van het oppervlak goed, kan dit invloed hebben op de herbruikbaarheid van de elektrode voor verdere analyse. Deze multipoint affiniteiten kunnen ook voortvloeien uit bindende via zwakkere interacties. In dergelijke systemen, kan niet-specifieke binding plaatsvinden, die de selectiviteit van het systeem16nadelig kan beïnvloeden. Dit zijn de algemene en algemeen, beperkingen van de methode.

Naast deze specifieke beperkingen zijn er vele aanzienlijke voordelen van de besproken methode ten opzichte van bestaande methoden. Terwijl RIAs, ELISAs en fluorimetrische metingen zeer gevoelig zijn, vereisen ze het gebruik van gelabelde materiaal (sjabloon of detector), terwijl de biosensor is volledig etiket-gratis. Deze methoden zijn ook duurder en tijdrovender. Een biosensor aanpak zorgt voor snelle, parallelle synthese van MIPs in verschillende composities op de dezelfde tijd-16. Aangezien slechts een paar microliters van monomeer oplossing is vereist voor de voorbereiding, is de methode handig bij het gebruik van dure of anderszins beperkt monomeren. Verdere, één MIP elektroden kunnen worden gebruikt voor ongeveer 80 analyses zonder een significante afname in de prestaties, die aanzienlijk hoger is dan andere bestaande methoden30. Bestaande methoden ook lijden, in verschillende gradaties, van lage gevoeligheid en selectiviteit, terwijl de beschreven methode voor de detectie en kwantificering van moleculen in het pM-bereik met hoge selectiviteit zorgt.

Als gevolg van de kosten-batenverhouding, het gemak van de exploitatie van het instrument, en de real-time gevoelige detectie in een korte tijd in vergelijking met bestaande methoden, de biosensoren zijn zeer veelbelovende punt-van zorg detectiesystemen onder veldomstandigheden; bijvoorbeeldvoor milieumonitoring en toepassingen in ontwikkelingslanden. In vele toepassingen in de diagnose van de ziekte is real-time, gevoelige, selectieve en snelle detectie van een biomarker in een complex mengsel zoals serum vereist15,25. Hier, zijn biosensoren superieur aan bestaande methoden, met name als gevolg van hun degelijkheid en gevoeligheid. Specifiek voor de opsporing van infectieuze agentia, zijn bacteriofagen onlangs beschouwd als alternatieve biorecognition element voor biosensoren als gevolg van hun gastheer bacteriën specificiteit33,34,35. Vervanging van antilichamen met bacteriofagen is veelbelovend om te verminderen de kosten en verhogen de stabiliteit nog36. Een dergelijk systeem zal ook toestaan voor de detectie en kwantificering van specifieke bacteriofagen in het milieu en van klinische monsters. Vanwege de prevalentie van bacteriofagen, en hun vermogen om de transduce van bacteriën met resistentie tegen antibiotica genen37,38, kan een dergelijke methode er waardevolle bestuderen van de verspreiding van resistente bacteriële.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Maria Baumgarten (IQ Biotechnologie Platform, infectie geneeskunde, Lund University) is erkend voor het uitvoeren en scanning electron microfoto. Dit werk werd gesteund door subsidies van het Zweedse onderzoek Raad Formas (2017-00100) als onderdeel van het Europese derde gezamenlijke programmering initiatief inzake antimicrobiële resistentie (JPIAMR) oproep "Transmissie Dynamics." De financiers had geen rol in de studie ontwerp, interpretatie, schrijven, voorbereiding van het manuscript, besluit indienen, of besluit te publiceren van het werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Cover slips ThermoFisher 102222 protein stamp
HCl Sigma-Aldrich H1758-500ML cleaning
NaOH Sigma-Aldrich 72068-100ML cleaning
Ultrasonic cleaner Branson Ultrasonic BRANSONIC M1800- E cleaning
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648-100ML modification
EtOH Sigma-Aldrich 1009836010 rinsing/cleaning
glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882-100ML cross-linker
acetone Sigma-Aldrich 34850-1L-M cleaning
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741-100ML piranha solution
H2O2 Sigma-Aldrich H1009-500ML piranha solution
tyramine Sigma-Aldrich T90344-5G modification
CompactStat Ivium Technologies CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz potentiostat
Platinum Counter Electrode Kit Equilabrium AFCTR5 potentiostat
Reference Electrode Equilabrium RREF0021 potentiostat
acryloyl chloride EMD Millipore 8.00826.0100 modification
triethylamine EMD Millipore 8.08352.0100 modification
toluene Sigma-Aldrich 244511-100ML modification
N-hydroxymethyl acrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate Sigma-Aldrich 409510-250ML cross-linker
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma-Aldrich 410896-50G functional monomer
UV polymerizator Dymax Dymax 5000ECE UV-polymerization
forceps Sigma-Aldrich Z168777-1EA consumable
1-dodecanethiol Sigma-Aldrich 471364-100ML blocking agent
acrylamide Sigma-Aldrich A3553-100G functional monomer
N-hydroxymethylacrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
N-isopropylacrylamide Sigma-Aldrich 415324-50G functional monomer
methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich 146072-500G cross-linking monomer
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-25ML catalyst
ammonium persulphate Sigma-Aldrich A3678-25G initiator
Capacitive biosensor CapSenze Equipment
Glycine Merck 1042011000 regeneration buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML regeneration buffer
Trizma base Sigma-Aldrich 93352-1KG running buffer
Na2HPO4 • 2H2O Calbiochem 567547-1KG running buffer
NaH2PO4 • 2H2O Calbiochem 567549-1KG running buffer
DELPHI correlative light and electron microscope Phenom-World equipment
Capacitive gold electrodes CapSenze Biosystems consumables
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) Sigma-Aldrich 441090-25G photo-initiator
CapSenze Smart Software CapSenze Biosystems software program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
  2. Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
  3. Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
  4. Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
  5. Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
  6. Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
  7. Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
  8. Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
  9. Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
  10. Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
  11. Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
  12. Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
  13. Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
  14. Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
  15. Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
  16. Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
  17. Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
  18. Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
  19. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
  20. Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
  21. Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
  22. Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
  23. Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
  24. Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
  25. Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
  26. Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
  27. Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
  28. Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
  29. Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
  30. Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
  31. Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
  32. El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
  33. Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
  34. Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
  35. Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
  36. Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
  37. Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
  38. Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).

Tags

Immunologie kwestie 132 Molecular imprinting microcontact inprenting capacitieve biosensor bacteriofaag polymeer biomacromolecule
Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ertürk, G., Lood, R.… More

Ertürk, G., Lood, R. Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e57208, doi:10.3791/57208 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter