Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vericiyi biyolojik moleküler sürecinden kullanarak tespiti kapasitif Biyoalgılayıcı dayalı

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/57208
Automatic Translation
1, 1
1Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Lund University

Summary

Burada, algılama ve düşük bol moleküllerin miktar için bir protokol kapasitans Biyoalgılayıcı ile birlikte basma moleküler kullanarak karmaşık çözümlerinde mevcut.

Abstract

Algılamak ve biomolecules karmaşık çözümleri quantitate yeteneği her zaman Doğa Bilimleri içinde çok aranan olmuştur; biyolojik, kirleticiler ve diğer moleküller ilgi tespiti için kullanılıyor. Enzim bağlı Immunosorbent Assay (burada sık sık bir antikor belirli hedef molekül doğru yönlendirilir ve ikinci bir etiketli antikor birincil antikor algılama için kullanılır, bırakmak için ELISA), bu amaç için yaygın olarak kullanılan bir teknik olduğunu Mutlak miktar altında eğitim biomolecule. Ancak, kullanım tanımayı öğeler olarak antikorların yöntemi sağlamlık sınırlar; etiketli molekülleri kullanarak ihtiyacı olduğu gibi. Bu sınırlamalarını aşmak için moleküler sürecinden, yapay tanıma site şablonu molekül için tamamlayıcı oluşturma ve antikorlar için ilk bağlama kullanma gerekliliği obsoleting uygulamaya konmuştur. Ayrıca, hatta daha yüksek hassasiyet için ikincil etiketli antikor kapasitans hedef molekül miktar için güvenerek biyosensörler tarafından değiştirilebilir. Bu protokol için hızla ve etiket içermeyen algılamak ve karmaşık örneklerinde, düşük bol biomolecules (protein ve virüsler) önemli ölçüde ELISA gibi yaygın olarak kullanılan algılama sistemleri daha iyi bir hassasiyetle quantitate için bir yöntemi açıklanmaktadır. Tüm bu kapasite Biyoalgılayıcı ile birlikte moleküler sürecinden tarafından aracılık ettiği.

Introduction

Biomolecules miktar bilim, radioimmunoassay (RIA) veya ELISA1gibi yöntemler istihdam içinde birçok farklı araştırma alanlarında kullanılır. Bu yöntemlerden bazıları bir etiketli gerektiren bir Radyoizotop veya enzim gibi reaktif etiketli antikor/antijen, emek yoğun ve karmaşık prosedürleri2zaman alıcı kılan. Ayrıca, sağlamlık, seçicilik ve duyarlılık bu yöntemlerin tüm analizler için yeterli değildir; attogram miktarları piktogram miktarları3yerine çözümlenmesi gerektiğinde özellikle onlar yeterli değildir. Bu amaçla, biyosensörler büyük ilgi4,5, özellikle artan bir sağlamlık için moleküler sürecinden ile birlikte kazandı.

Moleküler sürecinden boşluklar çevresinde mükemmel şablonu7benzer yapay tanıma site oluşturma şablonu6, fonksiyonel monomer polymerizing tarafından oluşturulması ile ilgili dayanır. Bu teknik, ilaç dağıtım sistemleri ve analitik ayırma, dahil olmak üzere çeşitli uygulamaların aynı zamanda biyosensörler8,9,10biorecognition unsurları olarak kullanılmıştır. Ancak, hala bazı sorunlar tatlı baskılı Polimerler (MIPS) protein ve hücreleri11,12gibi makromoleküllerin şablonları için tasarım vardır. Bu nedenle, pek çok araştırmacı şablon protein doğrudan bir substrat üzerine basma böylece hedef protein12tarafından tanınan bir yüzey oluşturmadan odaklanmıştır. Tanıma boşlukları büyük moleküller ve protein içeren derlemeler için istihdam için kullanılan bu yüzey kaplama teknik13,14basma microcontact denir. -Bir şablon damga ve polimer destek - bunun üzerine şablonu bir yüzey15,16adsorbe ve temas getirdim iki yüzeyler arasında polimerizasyon yöntemi genel yordamı bağlıdır monomer tedavi yüzey. Bu arada, bir ince polimer film çekmek yolu ile UV-polimerizasyon üzerinde oluşturulur. Son olarak, şablon, şablon belirli boşluklar baskılı elektrot yüzeyi geride bırakarak kaldırılır. Bu yöntem bazı avantajları baskılı molekül düşük aktivite kaybı da dahil olmak üzere,16,17sürecinden için şablon moleküllerin de gerektiren çok küçük miktarlarda işlem vardır. Böylece, bu düşük maliyetli, istikrarlı, hassas ve seçici yüzeyler herhangi bir şablon kullanıcının tercihine / hedefleme sensör yüzeylerde oluşturulabilir.

Biyoalgılayıcı tek protein ve virüsler de dahil olmak üzere çok daha büyük biomacromolecules tespiti için kullanılabilir. Belirli virüs son faiz kazanıyor bakteri bulaşan bir virüstür bakteriyofaj grubudur. Bacteriophages hızlı ve hassas tespiti önemli sırasında Biyoteknolojik ve bakteri kültürleri ile bacteriophages18adet enfeksiyondan belirlemede biyofarmasotik işlemleri. En sık kullanılan biyolojik tahlil bakteriyofaj tespiti için çift katmanlı agar yöntemi19, zahmetli ve zaman alıcı olan olduğunu. Birkaç denemeden virüs (bacteriophages dahil) için yeni tanı araçları geliştirmek için Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)20, Interferometry21, elektrokimya22ve sensör sistemi23, gibi yapılmıştır 24. bir sürü iş biyosensörler kullanımı kolay, son derece hassas ve gerçek zamanlı ölçüm15,25kabil varlık olarak kendi avantajları sayesinde üzerinde duruldu. Biyoalgılayıcı belirli bir tip kapasitans değişiklikler temel alır. Bu kapasitif biyosensörler değişiklikleri ölçmek elektrokimyasal algılayıcılar sensör yüzeyinde biorecognition öğesi içeren bir analit etkileşim kurduğunda, Dielektrik özelliklerinde kapasite2,4 azalmasına neden olan . Kapasitif biyosensörler antijenleri, antikor, proteinler ve ağır metal iyonlarının6,26,27,28gibi çeşitli analitlerin tespiti için kullanılmaktadır. Bu tür biyosensörler29etiketleme olmadan doğasında hız, yüksek hassasiyet, basitlik, düşük maliyetli, kolay manipülasyon ve gerçek zamanlı ölçüm gibi pek çok avantajı var.

Burada açıklanan yöntemi algılama ve herhangi bir etiketleme kullanarak gerek kalmadan son derece karmaşık örneklerinde düşük bol biomolecules miktar etkinleştirme hedefleniyor. Özellikle, teknik nereye doğru hedef quantitate için ticari olarak mevcut diğer enstrümanlar başarısız biomolecules, sınav-picogram aralığında en yararlı olur.

Protocol

1. cam kapak modifikasyonu (şablon pullar) notları

  1. Cam kapak makbuzları temizlemek için onları sırayla 10 mL 1,0 M HCl, deiyonize su ve 1,0 M NaOH, sırasıyla, her adımda bir ultrasonik temizleyici oda sıcaklığında 10 dakika bırakın.
    1. Azot gazı cam kapak torbalarla kuru.
      Not: Kapak paket fişi buharlaşma gaz azot akışı altında tarafından kurutulur.
  2. % 10 (v/v), 3-amino-propil-triethoxysilane (APTES) 1s cam yüzeyinde, oda sıcaklığında amino grupları tanıtmak için etanol içinde 10 mL solüsyon temizlenmiş ve kurutulmuş kapak makbuzları bırakın.
    1. Kapak makbuzları deiyonize suyla durulayın.
    2. Azot gazı kapak torbalarla kuru.
  3. APTES değiştiren kapak makbuzları % 5 (v/v), 10 mL solüsyon 10 mM fosfat tampon (pH 7,4) oda sıcaklığında6,15yüzeyi amino grupları etkinleştirmek için 2 h için oxazolidin, bırakın.
    1. Aşırı oxazolidin yüzeyden kaldırmak için 10 mM fosfat tampon (pH 7,4) kapak torbalarla durulayın.
    2. Azot gazı kapak torbalarla kuru.
  4. 1.0 mL 0.1 mg/mL konsantrasyonu 10 mM fosfat tampon (pH 7,4) şablonu (protein/bakteriyofaj) çözeltisi hazırlamak.
    Not: protein fosfat tampon (10 mM, pH 7,4) 1.0 ml 0.1 mg geçiyoruz. Gerekirse, bir Spektrofotometre (280 nm) protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir.
    1. Bu şablon çözüm değiştirilmiş kapak paket fişi üzerine 200 µL bırakın ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Aşırı şablon çözüm 1-2 daha fazla şablon pullar karakterizasyonu çalışmalarda kullanılmak üzere hazırlamak için kullanılabilir.
    2. Yüzeyden ilişkisiz şablonunu kaldırmak için 10 mM fosfat tampon (pH 7,4) kapak torbalarla durulayın.
      Not: elektrotlar durulama için 30 için fosfat tampon (10 mM, pH 7,4) ile yıkama onları s.
    3. Azot gazı kapak torbalarla kuru.
      Not: Bunlar polimerizasyon adımda kullanılır kadar kapak paket fişi 4 ° C de saklanmalıdır.

2. kapasitif altın elektrotlar modifikasyonu

  1. Elektrotlar temiz küçük bir ölçek, elektrotlar sırayla, 5 mL etanol (% 70), de içeren batırmak deiyonize su, aseton, deiyonize su, asidik piranha çözüm (3:1, H2SO4: H2O2, v/v) ve deiyonize su, sırasıyla her adımda bir ultrasonik temizleyici oda sıcaklığında 10 dakika için.
    1. Elektrotlar azot gazı ile kuru.
  2. İngilizce electropolymerization gerçekleştirmek için 8 mL 10 mM İngilizce çözeltisi 10 mM fosfat tampon (pH 7,4) içeren etanol (2 mL)15dakika içinde hazır olun.
    Not: İngilizce çözüm hacmi 2 mL etanol de dahil olmak üzere toplam 8 mL olmalıdır.
    1. Çevrimsel voltammetric (15 döngüleri) bir potansiyel kapsayan bir potansiyostat kullanarak Bu çözümde taramalar aralığı 0 - 1.5 V (Ag/AgCl) ve 50 mV/s30tarama hızı.
    2. Elektrotlar deiyonize suyla durulayın.
    3. Elektrotlar azot gazı ile kuru.
  3. 30 mM acryloyl klorür ve toluen 30 mM trimethylamine içeren bir çözümde elektrotlar bırakın (VToplam 5 mL =) oda sıcaklığında6,15,30gece.
    1. Elektrotlar deiyonize suyla durulayın.
      Not: klorür ve trimethylamine artıkları unreacted acryloyl daha iyi bir kaldırılmasını sağlamak için NaOH ile yüzey sonra deiyonize suyla yıkamak mümkündür.
    2. Elektrotlar azot gazı ile kuru.

3. şablon hazırlanması kapasitif altın elektrotlar baskılı

  1. Bakteriyofaj hazırlanması kapasitif altın elektrotlar baskılı
    1. Polimerizasyon önce monomer (N-hydroxymethyl Akrilamid) ve cross-linker (polietilen glikol-400-dimethacrylate) bir oranı 1:5 (mol/mol) 10 mM fosfat tampon (pH 7,4) 1 ml içeren bir monomer çözüm hazırlamak.
      Not: farklı oranlarının monomer ve cross-linker içeren monomer çözüm kullanılabilir veya monomer ve cross-linker türleri spesifik etkileşime duruma getirilmesi için şablon göre değiştirilebilir.
    2. Fotoğraf-başlatıcı 1 mg bu çözüm ekleyin.
      Not: polimerizasyon UV ışık altında gerçekleştirilirse, daha sonra fotoğraf başlatıcı polimerizasyon başlatmak için kullanılmalıdır. Polimerizasyon serbest radikal polimerizasyon tarafından gerçekleştirilirse, başlatıcı türü değiştirilmelidir.
    3. Bu çözümün değiştirilmiş altın elektrot altın yüzeyinin 1.5 µL pipet.
      Not: Altın elektrot yüzeyine şematik Resim 1' de gösterilen.
    4. Şablon damga monomer çözüm üst kısmında altın elektrot yüzeyi ile temas halinde getir.
    5. UV polimerizasyon başlatmak (365 nm, 400 W) ve 15 dk31için devam edin.
      Not: UV polimerizasyon-25 ° C-polimerizasyon işlemini başlatmadan önce ayarlanmış soğutma bir kabine içinde gerçekleştirilir. Sonra sistem kür UV ışığı yanar ve polimerizasyon sistemi kür UV ışığı kapatıp açmadan önce 15 dakikadır devam edilir.
    6. Şablon damga yüzeyden forseps kullanarak kaldırın.
      Not: şablon damga yüzeyden kaldırılırken, polimer filmin yüzeyinde bozuk olabilir. Bu nedenle, damga yüzeyden çok dikkatli ve yavaş yavaş güç kullanmadan kaldırılması gerekir.
    7. Elektrot yüzeyi deiyonize suyla durulayın ve azot gazı ile kuru.
    8. 10 mM 1-dodecanethiol etanol için 20 dk iğne elektrot yüzeyinde karşılamak için hazırlanan 1 ml elektrotlar bırakın.
    9. Elektrotlar deiyonize suyla durulayın ve elektrotlar azot gazı ile kuru.
  2. Protein hazırlanması kapasitif altın elektrotlar baskılı
    1. Polimerizasyon önce monomerler içeren bir monomer çözüm hazırlamak (Akrilamid: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µL; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) ve cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) ultra saf su30,32820 µL içinde.
    2. %5 (v/v) N, N, N hazırlamak ', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) ultra saf su.
    3. TEMED çözümün 20 µL monomer çözüm ekleyin ve 5 min için azot gazı ile tasfiye.
    4. % 10 (w/v) amonyum persülfat (APS) ultra saf su hazırlamak.
    5. APS çözüm 20 µL monomer çözüm ekleyin.
    6. Değiştirilmiş altın elektrot yüzeyine monomer çözümün 1,5 µL pipet.
    7. Şablon damga monomer tedavi yüzeyi ile temas getir.
    8. Polimerizasyon oda sıcaklığında başlarlar ve 5 h için.
      Not: UV-polimerizasyon, yerine protein baskılı altın elektrotlar hazırlanması için serbest radikal polimerizasyonu, oda sıcaklığında (25 ° C) APS-TEMED başlatıcı-katalizör kullanarak gerçekleştirilir.
    9. Şablon damga yüzeyden forseps kullanarak dikkatli bir şekilde çıkarın.
    10. Elektrot deiyonize suyla durulayın ve azot gazı ile kuru.
    11. 10 mM 1-dodecanethiol etanol için 20 dk iğne elektrot yüzeyinde karşılamak için hazırlanan 1 ml elektrotlar bırakın.
    12. Elektrotlar deiyonize suyla durulayın ve elektrotlar azot gazı ile kuru.

4. tarama elektron mikroskobu (SEM) olan elektrot yüzeyi karakterizasyonu

  1. Numune alüminyum sahipleri yapışkanlı karbon bant ile bağlama.
  2. Elektrotlar ile 10 nm Paladyum/altın ceket.
  3. Elektrotlar SEM ile incelemek

5. gerçek zamanlı kapasitif ölçümleri şablonu ile Kapasitif altın elektrotlar baskılı

  1. Baskılı kapasitif altın elektrotlar bir kapasitif Biyoalgılayıcı entegre elektrokimyasal akışı hücresine yerleştirin.
  2. Rejenerasyon tampon (25 mM glisin-HCl, pH 2.5, 50 mM ara-20 de dahil olmak üzere) ve 1 L çalışan tampon 100 mL hazırlamak (bakteriyofaj için baskılı sistemi: 10 mM fosfat, pH 7.4; protein baskılı sistemi için: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).
  3. Analiz sistemi ile çalışan arabellek 25 min için sistemi yeniden equilibrate yeniden oluşturmak için yeniden oluşturma işlemi tampon enjeksiyon ile başlayın.
  4. Standart Şablon Çözümleri arabellek çalışan istenen konsantrasyon aralığında hazırlayın.
    Not: İlk 0.1 mg protein veya yaklaşık 108 pfu bacteriophages, 1.0 mL fosfat tampon (10 mM fosfat, pH 7,4) çözülerek bir hazır şablon çözüm hazır olun. O zaman, standart çözümler on ardışık 10 kat dilutions hisse senedi çözümden yaparak kalibrasyon eğrisi için hazır olun. Bu çözümler adım 5.5 kapasitif Biyoalgılayıcı ile incelenecek. Protein konsantrasyonu ölçülür bir Spektrofotometre kullanarak (280 nm). Bakteriyofaj konsantrasyon ölçmek için bir çift katmanlı agar yöntem, hangi anlatılan kullanılabilir daha önce19detayları.
  5. Bu standart çözümlerin en uygun koşullar içinde belgili tanımlık sistem için sırayla 250 µL enjekte (akış hızı: 100 µL/dak, sıcaklık: 25 ° C).
    Not: bakteriyofaj konsantrasyonları aralığı 1.0 x 10 '1 - 105 pfu/mL x 1.0 iken bu uygulamada, standart protein çözümleri 1.0 x 10-4 - 1.0 x 10-14, konsantrasyon aralığında hazırlanmıştır. Çözümler enjeksiyon kapak yerleştirilir ve sırayla triplicates örneklerinde tek şırınga pompa ve birden çok bağlantı noktalı Vana enjekte sistem içine enjekte. Şablon bağlama gelen baskılı boşluklar doğan standart çözümler enjekte sonra kapasitans azalma gerecin yazılım tarafından otomatik olarak izlenir.

Representative Results

Protokole göre şekil 1, şematik takip ederek çıplak altın elektrot bir biomacromolecule yapısını temsil eden bir şablon ile kaydedilecek. Bu elektrot elektrot şablonunu kararlı uygulanması ve değişiklikleri ölçümü bağlama şablonunun üzerine kapasite sağlayan bir kapasitif Biyoalgılayıcı (Resim 2), uygulanabilir.

Kapasitif Biyoalgılayıcı şematik gösterimi Şekil 2' de gösterilmiştir. Çalışan tampon (10 mM fosfat, pH 7,4) ve rejenerasyon tampon (25 mM glisin-HCl, pH 2.5) sürekli enjeksiyon akışı hücre içine yeniden oluşturma sırasında sorumludur, centris pompa şekilde açıkça görülebilir. Akış hücre çalışma, başvuru ve sayaç elektrotlar oluşur. Enjeksiyon Vana degasser ilk geçen standart protein/bakteriyofaj çözümleri, oluşur ve daha sonra sırayla enjekte içine belgili tanımlık sistem. Belgili tanımlık eriyik akış hücreye eklenen çalışma elektrot ulaşır ulaşmaz, sonuç gerçek zamanlı olarak kontrol edilmektedir. Kapasitans değerleri bilgisayar ekranındaki sensorgrams takip ederek kaydedilebilir.

Şekil 3 ve şekil 4 çıplak ve baskılı altın elektrot yüzeyi arasındaki farklar tasvir. Bu karakterizasyonu adım polimer boşluklar, elektrot yüzeyi pürüzlülük sürecinden sonra görülen sağlamak önemlidir. SEM dışında Ayrıca AFM, iletişim açı ölçüleri, dahil olmak üzere diğer karakterizasyon yöntemleri vardır ellipsometry yüzey sürecinden sonra tanımlamak için kullanılan vb. Bu arada, basma işlemi başarılı ve şablon boşluklar yüzeyde oluşan sağlanabilir. Bu boşluklar içinde şablon yüksek özgüllük ve ilgi ile bağlayabilirsiniz.

Standart çözümler kapasitif sisteme enjekte sonra son beş okuma ortalama otomatik olarak yazılım tarafından hesaplanmıştır ve Kalibrasyon grafikler vs konsantrasyonu kapasite değişikliği komplo tarafından elde edildi analit. Kayıtlı kapasitans azalma şablon bağlama üzerinden ortaya çıktı. Altın elektrot bağlamak daha fazla molekül su yüzüne, daha yüksek toplam kapasitans, azalma kapasitif ölçüm genel ilkesine göre. Şekil 5 ve şekil 6 analit konsantrasyonu artan ile ΔC beklendiği gibi artırır gösterir. Kameranın dinamik alanı (sistem belirli bir hedef tespiti için yararlı nerede konsantrasyon aralığı olduğu arasında) ve algılama (lod olarak) sınırı bu grafikleri analiz ederek değerlendirilebilir. Göre şekil 6,-ebilmek bulmak baskılı bakteriyofaj kapasitif Biyoalgılayıcı bacteriophages 10 konsantrasyon aralığı1 - 105 pfu/mL, bu çalışmada 10 pfu/mL LOD değeri olan. Şekil 5 ve şekil 6 da vurgulamak kalibrasyon eğrisi aynı aralıkta ölçüm gerekliliği şablon konsantrasyon için gerekli olması gerektiği, lineer regresyon konsantrasyonları ( üzerinde farklı olabilir beri Şekil 5), veya farklı yamaçlarında (şekil 6). Ayrıca nedeniyle düşük konsantrasyonlarda kullanılan dikkat edilmelidir, sistem dalgalanmalara (bulanıklık örnek, hava taslak, vb) oldukça hassastır ve bu nedenle, bu en azından çalıştırmak için tavsiye edilir outliers dahil olmak üzere potansiyel azaltmak için triplicates . Aynı nedenle, standart sapma şekil 6' da görüldüğü gibi yüksek oranda seyreltilmiş numune için oldukça önemli olabilir.

Figure 1
Resim 1 . Şematik gösterimi yöntemi basma microcontact. Cam kapak kâğıdını (şablon pullar),(a)hazırlık kapasitif altın elektrotlar hazırlanması (B) (C) microcontact sürecinden şablonunun UV-polimerizasyon ve (D) üzerinden altın elektrot yüzeyine elektrot yüzeyi şablondan kaldırılması (çoğaltılamaz Ertürk ve ark., biyoteknoloji raporları 2014 (3): 65-72 izni ile). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Şematik gösterimi kapasitif Biyoalgılayıcı. Bu çalışmada kullanılan kapasitif Biyoalgılayıcı genel düzeni (çoğaltılamaz Ertürk ve ark., biyoteknoloji raporları 2014 (3): 65-72 izni ile). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Tarama elektron mikroskobu protein baskılı elektrotlar. (A) çıplak altın elektrot SEM görüntüleri (ölçek çubuğu = 20 µm), ve (B) bir protein baskılı kapasitif altın elektrot (ölçek çubuğu 10 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Tarama elektron mikroskobu, bakteriyofaj baskılı elektrotlar. SEM görüntüleri çıplak altın elektrot (ölçek çubuğu 20 µm =)(a)ve farklı büyüklüklerde kapasitif altın elektrot bir bakteriyofaj baskılı (= 6600 x, ölçek çubuğu 10 µm) (B) ve 11, 500 X, ölçek çubuk = 5 mikron) (C); oklar yapıştırılan bacteriophages gösterir). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Arabellek oluşturma kalibrasyon grafiklerde etkisi. Kapasitans optimum koşullarda bir protein konsantrasyonu vs içinde değişiklik gösteren kalibrasyon grafik (tampon çalıştıran: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; Rejenerasyon arabellek: 25 mM glisin-HCl, pH 2.5 50 mM ara-20 de dahil olmak üzere; Akış hızı: 100 µL/dak, numune hacmi: 250 µL; T: 25 ° C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Temsilcisi kalibrasyon eğrisi için büyük biomacromolecules. Kapasitans bakteriyofaj konsantrasyon optimum koşullarda vs içinde değişiklik gösteren kalibrasyon grafiği (tampon çalıştıran: 10 mM fosfat, pH 7.4; Rejenerasyon arabellek: 25 mM glisin-HCl, pH 2.5 50 mM ara-20 de dahil olmak üzere; Akış hızı: 100 µL/dak, numune hacmi: 250 µL; T: 25 ° C) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu yöntemi işlenirken, protokol sonrası sırasında dikkate alınması gereken bazı önemli adımlar vardır. Bir kritik adım asidik piranha çözüm ile temizlik adımdır. Adım 2.1 daha--dan 10 min olmaması gerekir. Bu değerler daha önce optimize edilmiş bu yana adım 1.4 için şablon çözüm 0.1 mg/mL, aşmamalıdır. Çevrimsel voltametric taramaları optimum kalınlık elde etmek için 15 döngüleri aşmamalıdır. Adım 3.1.3 için 1,5 µL en iyi duruma getirilmiş bir değerdir. Bu değer elektrot belirli bu tür için daha yüksek olmalıdır. Sistem kür UV 400 W güç varsa, polimerizasyon için en fazla 10-15 dk gerçekleştirilmesi gerekir. En kısa zamanda APS (başlatıcı) TEMED sonra çözüme eklenir, hemen polimerizasyon (Adım 3.2.5) önlemek için sonraki adım çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.

Yüzeyden gelen şablon damga kaldırıldıktan sonra UV polimerizasyon en önemli adımlardan biri. Bu adımı düzgün gerçekleştirilmez ise, elektrot yüzeyinde polimer film olabilir bir risk ile damga kaldırıldı. Bu nedenle, bu elektrot ve su bir çözümde üstte protein damga polimerizasyon sonra bırakın, daha sonra pul çok yavaş ve dikkatli bir şekilde yüzeyden (Adım 3.1.6) kaldırmak için tavsiye edilir.

Kullanılan şablonu temel alan, değişiklikler türü ve kullanılan monomer (fonksiyonel monomer ve cross-linker) oranı daha yüksek duyarlılık oluşturma açısından değerlendirildi. Bu ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, benzeşim bağlama şablon molekülünün genellikle aynı anda birkaç farklı etkileşimleri içerir. Bu nedenle, bu yeniden oluşturma adımları sırasında sorunlara neden. İlişkili şablon yüzeyinden düzgün serbest değilse, bu daha fazla çözümleme için elektrot kullanılırlığı etkileyebilir. Bu çok noktalı benzeşim da zayıf etkileşimler yoluyla bağlama neden olabilir. Tür sistemlerde, non-spesifik bağlama sistemi16selectivity olumsuz etkileyebilir yer alabilir. Bu yöntemin ortak ve genel, sınırlamalar vardır.

Bu belirli sınırlamalar dışında birçok önemli avantajlar tartışılan yöntem mevcut yöntemler vardır. RIA'ları, ELISAs ve Fluorometrik ölçümlere çok hassastır, onlar etiketli malzeme (şablon veya dedektörü), kullanım Biyoalgılayıcı tamamen ise etiket içermeyen gerektirir. Bu yöntemler aynı zamanda daha pahalı ve zaman alıcı. MIPS hızlı, paralel sentezi aynı saat16farklı kompozisyonlarda için Biyoalgılayıcı bir yaklaşım sağlar. Sadece bir kaç microliters monomer çözeltinin hazırlanması için gerekli olduğundan, pahalı ya da başka türlü sınırlı monomerleri kullanırken uygun yöntemdir. Ayrıca, tek MIP elektrotlar diğer mevcut yöntemleri30anlamlı olarak daha yüksek performans, önemli bir azalma olmadan yaklaşık 80 analizleri için kullanılabilir. Yüksek seçicilik ile algılama ve miktar pM aralığı olarak açıklanan yöntemi sağlar iken mevcut yöntemler de, değişen derecelerde düşük duyarlılık ve seçicilik, içinde acı.

Maliyet-etkililik, enstrüman ve gerçek zamanlı hassas algılama varolan yöntemlerine göre kısa sürede çalışma kolaylığı nedeniyle biyosensörler çok olan nokta, umut verici bakım tespit sistemleri alan koşullarında; örneğinhem uygulamalar gelişmekte olan ülkelerde çevre izleme için. Hastalığı tanısı içinde birçok uygulama içinde serum gibi karmaşık bir karışımı bir biyomarker gerçek zamanlı, duyarlı, seçici ve hızlı tespiti gerekli15,25' tir. Burada, biyosensörler sağlamlık ve duyarlılık nedeniyle mevcut yöntemler için özellikle, üstündür. Özellikle enfeksiyöz ajanlar tespiti için bacteriophages son zamanlarda onların ana bilgisayar bakteri özgüllük33,34,35nedeniyle biyosensörler için alternatif biorecognition öğesi olarak kabul edilmektedir. Antikorlar bacteriophages ile yerini maliyeti düşürmek ve istikrarı daha da36artırmak için çok umut verici. Böyle bir sistem de algılama ve belirli phages ortamında ve klinik örneklerinden miktar sağlayacaktır. Bacteriophages ve antibiyotik direnç genleri37,38ile bakteri transduce yeteneğini yaygınlığı nedeniyle, böyle bir yöntem dayanıklı bakteri yayılmasını okuyan değerli olabilir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Maria Baumgarten (IQ biyoteknoloji Platform, enfeksiyon tıp, Lund Üniversitesi) gerçekleştirme ve tarama elektron filmler sağlamak için kabul edilmektedir. Bu eser Avrupa üçüncü ortak programlama girişimi Antimikrobiyal direnç (JPIAMR) çağrı "İletim dinamiği." bir parçası olarak gelen İsveçli Araştırma Konseyi Formas (2017-00100) hibe tarafından desteklenmiştir Fon çalışma tasarım, yorumu, yazma, el yazması, göndermek veya karar karar hazırlanması çalışmaları yayımlamak için herhangi bir rolü yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Cover slips ThermoFisher 102222 protein stamp
HCl Sigma-Aldrich H1758-500ML cleaning
NaOH Sigma-Aldrich 72068-100ML cleaning
Ultrasonic cleaner Branson Ultrasonic BRANSONIC M1800- E cleaning
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648-100ML modification
EtOH Sigma-Aldrich 1009836010 rinsing/cleaning
glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882-100ML cross-linker
acetone Sigma-Aldrich 34850-1L-M cleaning
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741-100ML piranha solution
H2O2 Sigma-Aldrich H1009-500ML piranha solution
tyramine Sigma-Aldrich T90344-5G modification
CompactStat Ivium Technologies CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz potentiostat
Platinum Counter Electrode Kit Equilabrium AFCTR5 potentiostat
Reference Electrode Equilabrium RREF0021 potentiostat
acryloyl chloride EMD Millipore 8.00826.0100 modification
triethylamine EMD Millipore 8.08352.0100 modification
toluene Sigma-Aldrich 244511-100ML modification
N-hydroxymethyl acrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate Sigma-Aldrich 409510-250ML cross-linker
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma-Aldrich 410896-50G functional monomer
UV polymerizator Dymax Dymax 5000ECE UV-polymerization
forceps Sigma-Aldrich Z168777-1EA consumable
1-dodecanethiol Sigma-Aldrich 471364-100ML blocking agent
acrylamide Sigma-Aldrich A3553-100G functional monomer
N-hydroxymethylacrylamide Sigma-Aldrich 245801-100G functional monomer
N-isopropylacrylamide Sigma-Aldrich 415324-50G functional monomer
methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich 146072-500G cross-linking monomer
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-25ML catalyst
ammonium persulphate Sigma-Aldrich A3678-25G initiator
Capacitive biosensor CapSenze Equipment
Glycine Merck 1042011000 regeneration buffer
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML regeneration buffer
Trizma base Sigma-Aldrich 93352-1KG running buffer
Na2HPO4 • 2H2O Calbiochem 567547-1KG running buffer
NaH2PO4 • 2H2O Calbiochem 567549-1KG running buffer
DELPHI correlative light and electron microscope Phenom-World equipment
Capacitive gold electrodes CapSenze Biosystems consumables
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) Sigma-Aldrich 441090-25G photo-initiator
CapSenze Smart Software CapSenze Biosystems software program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
  2. Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
  3. Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
  4. Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
  5. Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
  6. Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
  7. Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
  8. Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
  9. Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
  10. Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
  11. Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
  12. Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
  13. Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
  14. Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
  15. Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
  16. Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
  17. Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
  18. Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
  19. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
  20. Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
  21. Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
  22. Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
  23. Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
  24. Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
  25. Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
  26. Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
  27. Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
  28. Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
  29. Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
  30. Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
  31. Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
  32. El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
  33. Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
  34. Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
  35. Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
  36. Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
  37. Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
  38. Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).

Tags

İmmünoloji sayı 132 basma basma kapasitif Biyoalgılayıcı bakteriyofaj polimer biomacromolecule microcontact moleküler
Vericiyi biyolojik moleküler sürecinden kullanarak tespiti kapasitif Biyoalgılayıcı dayalı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ertürk, G., Lood, R.… More

Ertürk, G., Lood, R. Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e57208, doi:10.3791/57208 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter