Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

השתלת תאי רקמת שומן-Derived גיליון כדי להפחית את זליגת לאחר קיצור קיבה חלקית במודל של עכברים

doi: 10.3791/57213 Published: August 11, 2018

Summary

ההכנה והשתלות של רקמת שומן נגזר תאי גזע (ASC) מגיליונות דיו sutured. חיבור המעי הגס במודל חולדה מוצג. יישום זה הרומן מראה כי גיליונות ASC יכולים להפחית זליגת השקה המעי הגס.

Abstract

זליגת anastomotic הוא סיבוך נוראי לאחר ניתוח המעי הגס. למרות שיטות למניעת זליגת יש רמות שונות של יעילות קלינית, הם עד עכשיו לא מושלם פתרונות. טיפול בתאי גזע באמצעות גליונות ASC יכול לספק פתרון לבעיה זו. השיקופיים נחשבים כמו מבטיח מועמדים לקידום רקמת ריפוי בגלל תכונותיהם עם מחלות, immunomodulatory. כאן, אנו מספקים שיטות כדי לייצר הגליונות ASC בצפיפות גבוהה, אשר מושתלים על גבי השקה המעי הגס במודל חולדה כדי להפחית לדליפת. השיקופיים נוצר תא גליונות במנות תרבות תרמו מגיב זה יכול להיות מנותק בקלות. ביום של השתלת, בוצעה כריתת חלקית עם השקה המעי הגס 5-תפר. חיות הושתלו מייד עם גיליון 1 עולה לכל חולדה. גליונות ASC באופן ספונטני דבקה ההשקה ללא בדבק כלשהו, בתפר או biomaterial כלשהו. קבוצות בעלי חיים הוקרבו 3 ו 7 ימים במשככי. בהשוואה לבעלי המושתלים, השכיחות של אבצס anastomotic ודליפה היה גבוה בבעלי השליטה. במודל שלנו, השתלת של גיליונות עולה לאחר ההשקה המעי הגס היה מוצלח עם קצב דליפת נמוך יותר.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קיצור קיבה חלקית עם השקה ראשי הוא ניתוח נפוץ שבוצעו שניתן להיעשות למחלות רבות להשפיע על המעי הגס כגון סרטן המעי הגס, מחלת קרוהן, דיברטיקוליטיס1,2. הכי חששתי סיבוך לאחר ההשקה המעי הגס היא דליפה anastomotic3. למרות מספר גורמי סיכון הקשורים עם דליפות anastomotic זוהו, פתרונות למניעת זליגת נשארים unkown4,5.

רקמת שומן-derived סטרומה תאים (השיקופיים) קשורים עם תכונות אנטי דלקתיות עם מחלות6,7, מה שהופך את התאים האלה מבטיח מועמדים טיפולים משובי8. היעילות של השיקופיים כדי לקדם ריפוי רקמות הוצגה ברקמות שונות כגון שריר הלב, העור לוושט9,10,11,12,13. עם זאת, ישנם כמה דיווחים על השימוש השיקופיים כדי לקדם ריפוי מעיים. השתלת המקומי של השיקופיים אל המעי הגס ניסיוני. חיבור באמצעות biosutures מצופים ASC או זריקות serosal של השיקופיים הראו שיפור או ריפוי14 או לא מנעו anastomotic זליגת למרות יותר לחיוביות anastomotic ריפוי15.

השתלת המקומי של השיקופיים ההשעיה או בשילוב עם biomaterials יכול להיות משויך תא לא מספיקות השמירה או של חלוקת התאים המושתלים11לקוי. 16,טכנולוגיה של תא גליון17 מציע שיטה חדשנית של עולה משלוח18,19. לפיכך, במחקר הקודם, גישה מוזרה הוצע באיזה השיקופיים מאורגן בתא גליון יכול להיות מיושם על ניסיוני השקה המעי הגס20. מחקר זה הראה כי השתלת גיליון ASC הוא מוצלח בהפחתת בריחת השקה המעי הגס לאחר קיצור קיבה חלקית במודל של עכברים. מאמר זה מדווח טכניקה כירורגית השתלת והכנה של גיליון ASC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

רקמת השומן התת עורית בטן הושג מתורמים האנושי עם אישור של הוועדה האתית הרפואית (#MEC-2014-092), המרכז הרפואי של אוניברסיטת MC ארסמוס, רוטרדם, הולנד. ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי אתית הוועדה של חיות ניסוי, המרכז הרפואי של אוניברסיטת MC ארסמוס, רוטרדם, הולנד (133-14-01).

1. האדם השיקופיים בידוד ותרבות

  1. להכין 3 מ"ל של בידוד בינוני 1g של רקמת שומן. מיקס גלוקוז נמוך Dulbecco של בינוני הנשר ששינה (LG-DMEM) עם 10 גרם/ליטר שור אלבומין (BSA) ו 1 g/L collagenase סוג 1.
  2. לנתח את האדם רקמת השומן התת עורית בטן (n = 8, כל נקבה, אומר גיל 40 ± בת 9) לחלקים קטנים (0.5 ס מ) באמצעות להב כירורגי סטרילי בגודל 10. לאדאמסון-חום רקמת מלקחיים, קורות חיים SafetyCabinet הביולוגיים סטרילית.
  3. אחסן את הרקמה ביתור בקבוק אחסון זכוכית סטריליים מדיה. שוקל את הסכום הכולל של רקמות ביתור ולהתחיל העיכול עם המדיום בידוד מוכן (50 גרם של רקמת שומן עם 150 מ ל בידוד בינוני לכל בקבוק). ניתן להשהות את הפרוטוקול פה על-ידי אחסון הבקבוק עם רקמת שומן גזור, בידוד בינוני ב 4 ° C על מערבל רולר בן לילה. ואז prewarm את הבקבוק ביום המחרת לטמפרטורת החדר 25 º C למשך 15 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.
    הערה: רקמת השומן התת עורית בטן הושג כחומר שאריות מתורמים שעברו ניתוח שחזור שד באישור ועדת ארסמוס MC רפואית אתית (# MEC-200) ועל פי את הקוד האתי: "שימוש משני נכונה של רקמה אנושית"(< http://www.federa.org>). שאריות רקמת שומן שימשה רק מתורמים אשר לא הפרסומות כדי שימוש משני.
  4. לעכל את רקמת שומן ביתור בתוך בקבוק אחסון זכוכית סטריליים מדיה של שייקר-חממה-150 סל ד ו- 37 מעלות לשעה.
  5. לחלק את הפתרון מתעכל צינורות 50 מ ל, centrifuge הצינורות 10 דקות ב 390 x g.
  6. להכין תרבות בינוני: LG-DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 50 גנטמיצין µg/mL ו- µg/mL 1.5 ampothericin B.
  7. בעקבות צנטריפוגה, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 20 מ של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 50 גנטמיצין µg/mL ו- µg/mL 1.5 ampothericin B). Centrifuge את התאים שוב עבור 5 דקות ב 390 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  8. Resuspend בגדר תא עם 10 מ"ל של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% FBS, גנטמיצין µg/mL 50 ו- 1.5 µg/mL ampothericin B) ולסנן התליה תא דרך מסנן 100 מיקרומטר.
  9. להוסיף 50 µL של 3% חומצה אצטית/מתילן כחול פתרון (עבור פירוק תאי הדם האדומים) µL 50 של השעיה תא, לערבב את הפתרון, להשתמש 10 µL כדי לספור את התאים. בצע תא סופר עם hemocytometer. ואז צלחת התאים-צפיפות של תאים/ס מ 40,0002 תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 30% FBS, גנטמיצין µg/mL 50 ו- 1.5 µg/mL ampothericin B).
  10. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב אווירה לח עם 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
  11. בעקבות הדגירה, שטיפת התאים עם פוספט חמים (37 מעלות צלזיוס) buffered תמיסת מלח (PBS) כדי להסיר שאריות תאים ולהחליף את התקשורת עם 10% FBS תרבות בינוני עם טרי להוסיף חומצה אסקורבית-2-פוספט (25 µg/mL) ואת הצמיחה פיברובלסט רקומביננטי אנושי פקטור 2 (FGF2, 1 ng/mL).
  12. תת-תרבות השיקופיים ב 90% זרימה באמצעות תקן 0.25% טריפסין EDTA פתרון (3 מ"ל של בקבוקון T175). לאחר 3-5 דקות, לנטרל את הפתרון EDTA טריפסין 0.25% עם 10 מ"ל של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% FBS, גנטמיצין µg/mL 50 ו- 1.5 µg/mL ampothericin B).
    הערה: לזרום cytometry ניתוח שימוש נפוץ ASC סמני פני ובידול tri-השושלת מבחני היו שבוצעה בעבר, חשף כי השיקופיים מבודדים באמצעות זה פרוטוקול מוצגים ASC מאפיינים ספציפיים21,22.
  13. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של תרבות בינוני (LG-DMEM בתוספת 10% FBS, גנטמיצין µg 50/mL ו- 1.5 µg/mL ampothericin B) עבור בקבוקון T175 centrifuge התאים עבור 8 דקות ב 250 x g. הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל של תרבות בינוני. לספור את התאים עם hemocytometer.
  14. צלחת התאים T175 מבחנות תרבות-צפיפות של תאים/cm 8,0002.
  15. להקפיא את השיקופיים הנותרים של חנקן נוזלי עם 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) תרבות בינוני לפני שימוש נוסף.

2. עולה גיליון הכנה

  1. מראש מעיל תרבות תרמו מגיב מנות (3.5 ס"מ קוטר) עם 1 מ"ל של FBS ולאחר מכן מקם את הכלים בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני תא זריעה.
  2. Trypsinize השיקופיים באמצעות פתרון EDTA טריפסין 0.25% למשך 3-5 דקות (3 מ"ל על בקבוקון תרבות T175). אם יש גושים תא כלשהו לאחר trypsinization, לסנן את התאים דרך מסנן 100 מיקרומטר לפני שספר.
  3. לנטרל את הפתרון טריפסין עם LG-DMEM בתוספת 10% FBS (10 מ"ל על בקבוקון T175), צנטריפוגה התליה תא במשך 8 דקות ב 250 x g... להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל של LG-DMEM בתוספת 10% FBS.
  4. לאחר ציפוי כלים תרבות תרמו מגיב עם FBS, להעביר את הכלים החממה צלחת התחממות כדור הארץ ב 37 מעלות צלזיוס ולהסיר FBS מתוך קערה.
  5. השיקופיים זרע-תאים/cm 400,0002 (בסך הכל, 3.52 תאים6 × 10, מעורבבת עם 2 מ של תרבות בינוני לכל מנה).
  6. בזהירות להפיץ את התאים בצורה אחידה ככל האפשר על ידי נדנוד בעדינות את המנה.
  7. תרבות ASC גיליונות עבור h 48-37 מעלות צלזיוס ב אווירה לח עם 5% CO2.
    הערה: לנסות למזער את פתיחת הדלת של החממה לאחר זריעה השיקופיים כדי למנוע טיפות טמפרטורה העלול להפריע היווצרות גיליון ASC או לגרום התנתקות מוקדמת של גליונות ASC בנוי.

3. חלקית קיצור קיבה, המעי הגס השקה

  1. זירוז ולשמור על חולדות זכרים Wistar (במשקל בין 250-350 גר') עם 1 ליטר/דקה של איזופלוריין (1.5-5%)/oxygen באינהלציה ולהזריק 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין intramuscularly.
  2. לאחר החיות תחת הרדמה כללית, להעריך את עומק הרדמה באמצעות בדיקת רפלקס. להחיל משחה העין המכילים ויטמין A לעיניים למניעת יובש. כאשר ההרדמה נחשב מספיק לניתוח, גילוח ורחיצה כירורגית הכן את הבטן על ידי גילוח שערות, ריסוס אזור כירורגית פעמיים עם 70% אתנול. לעטוף את הבטן עם וילונות נייר סטרילי. שימוש בטכניקה אספטית ולתחזק את שדה סטרילי במהלך הליך כירורגי לגמרי.
  3. עושים חתך בבטן קו האמצע של 5 ס"מ עם גודל להב כירורגי סטרילי 10 ולהרחיב את החתך עם קורות חיים. לזהות exteriorize המעי הגס, שתשלח המעי הגס מהשארית חלל הבטן עם פדים בטעימת מלוחים. לזהות באמצע צודק, ולאחר כשנשארו העורקים מעינה מצע המעי, בוטה לנתח סביב כל ספינה וספינה באמצעות יתוש האלסטד מאתרים ומפסיקים את כל כלי בודדים עם משי קלועה נספגים 4 0.
  4. לבודד את המקטע הגס בין 1.0 ס מ aborally אל המעי 0.5 ס מ מעל עורק מצע המעי העליון סימטרית. Transect דרך המעי הגס בריא באמצעות קורות חיים. לאחר כריתה מקטע מעי, להביא לקרע, קצוות המעי הגס יחד על ידי החדרת שני ספוגיות כותנה ארוכה הטרנס-אנלית דרך המעי הגס דיסטלי ולאחר מכן לתוך סוף המעי הגס הפרוקסימלית.
  5. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, ליצור לחיבור תעלות end-to-end sutured דיו על ידי אחד-שכבת היפוך תפירת בעזרת תפרים קטע 5 (המוזרק monofilament פוליאמיד 8/0). מקום התפרים קטע דרך כל השכבות של הקיר המעי הגס ומקם את extraluminally קשרים.
  6. לחלק את החולדות באקראי שליטה או קבוצה גיליון ASC.

4. ASC גיליון השתלת

  1. לאפשר את הכלים תרבות להתקרר לטמפרטורת החדר 40 דקות לפני ההשתלה ויוו , כדי להקל על ניתוק גיליון ASC.
    הערה: לאחר הניתוק, גליונות ASC לכווץ כ 2 ס מ קוטר. ASC גיליון הכדאיות נשאר גבוה לפחות 3-6 שעות לאחר ניתוק20.
  2. הסר את תרבות בינוני והחלף אותו עם 1 מ"ל של נסיוב חינם LG-DMEM.
  3. בעדינות לתפוס העיטורים של הגיליון עולה עם מלקחיים atraumatic ומניחים בצד הצלחת של הגיליון עולה מעל הקו anastomotic.
  4. בזהירות כדי למתוח את עולה גיליון כ 0.25 ס מ מעל ומתחת לקו anastomotic באמצעות מלקחיים atraumatic לעטוף הסדין סביב המעי הגס. הרם את המעי הגס עד עטיפת הגיליון ASC מסביב בצד הגבי.
    הערה: ASC גליונות באופן ספונטני לדבוק הקו anastomotic, אין צורך להשתמש בדבק רקמות או כל biomaterial אחרים. קבוצת הביקורת לא מקבל כל טיפול נוסף.
  5. הסר את ספוגיות כותנה ולשנות את כפפות וכלי נגינה. החלף את המעי הגס בבטן. סגור הבטן-linea alba עם שכבה אחת של פועל באמצעות תפרים שנספג קלוע polyglycolic חומצה 5/0. תפר את subcutis, cutis ביחד בשכבה אחת של פועל באמצעות תפרים שנספג קלוע polyglycolic חומצה 5/0.

5. לאחר הניתוח והערכת מעקב

  1. מיד נתרענן החיות עם זריקה תת עורית של 5 מ"ל תמיסת מלח חמים במשככי. מקם את החיות מתחת למנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולנטר את סימני החיים עד חיות להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
    הערה: בעלי חיים, כי עבר ניתוח לא הוחזרו לחברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין. לאחר התאוששות, לאפשר גישה חופשית למים, צ'או עכבר רגיל. לשיכוך כאבים לאחר ניתוח, לנהל 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously כל 6-8 h במשך 3 ימים. אנטיביוטיקה לא נוהלו בכל עת במחקר זה.
  2. להשיג יומי הקליני הערכות של בריאות ומשקל. במקרה של ציון נמוך מאוד בריאות או הרזיה חמורה, חיות צריך להרדימם מאת מפצעי דקירה הלב עדיין תחת הרדמה.
  3. ביום שלאחר הניתוח 3 או יום 7, עזים ומתנגד העכברושים שוב עם 1 ליטר/דקה של איזופלוריין (1.5-5%)/oxygen באינהלציה מבלי. הבופרנורפין, ולבצע re-פתיחת בטן עם חתך בצורת U. בדוק את הבטן על הסימנים של דלקת הצפק, stricture, הדבקויות סיביים, הנוכחות של אבצס. ציון דירוג הסיכון של הדבקויות, מורסה על הבטן וגם באזור anastomotic.
  4. לקבוע את הלחץ המתפרצת anastomotic על ידי insufflation האוויר קטע סגור של המעי הגס כולל ההשקה. רישום לחץ האוויר והמקום של קרע כאשר האוויר הראשון לדלוף כ מתפוצץ לחץ.
  5. הסרת המעי הגס כל חיה שהקריבה עצמה ולתקן על חתוך קטע של המעי הגס - המכיל ההשקה המעי הגס - עם 4% buffered פורמלדהיד, בעקבות פרפין הטבעה וחיתוך המעי הגס למקטעים עבה μm 4.
  6. המתת חסד החיות תוך בהרדמה ישירות אחרי אוסף של המקטע השקה מאת מפצעי דקירה בלב. לאשר מוות בעלי חיים עם העדר נשימה תנועה ללא היסוס.
  7. מבצעים stainings פתולוגיה Hematoxylin & אאוזין ו Picro סיריוס אדום, immunohistochemical stainings עם נוגדנים נגד המיטוכונדריה אנושי, תאי אנדותל של עכברוש (anti-CD34) ותאים של מערכת החיסון (CD3 +, CD163 +.).
  8. Digitalize השקופיות לבדיקה ממוחשבת ולהשוות את קבוצות בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תרשים זרימה של מחקר זה המתאר ASC גיליון תרבות והן את ההליך של צוות, השקה מוצג באיור1. איור 2 מציג ASC גיליון מורפולוגיה מיקרוסקופית ואת המראה מאקרוסקופית של הגיליון ASC במהלך ואחרי הניתוק. איור 3 מראה את השלבים השונים של ניתוק גיליון ASC והשתלות. איור 4 מראה הנוכחות של הגיליון ASC קו anastomotic ומניעה של זליגת 3 ימים במשככי.

תקופת מעקב המותר עבור הערכה השקה המעי הגס. ההערכות השונות מוצגות דמויות ו לטבלה. בהשוואה לבעלי שליטה, הקבוצות בעלי חיים המושתלים הראו פחות תכופים התבקעות anastomotic ודליפה ביום שלאחר הניתוח 3 ופחות להצטברות בתדירות גבוהה ב 7 יום לאחר הניתוח. בהשוואה לבעלי שליטה, חיות המושתלים לא לפתח הדבקויות משמעותית או היווצרות stricture. טבלה 1 מציגה את הממצאים מאקרוסקופית בסוף לעקוב תקופות המושתלים, מושתלים שאינם בעלי חיים.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה המחקר. A) השיקופיים היו מבודדים והתרחבה לפני זריעה על תרבות תרמו מגיב מנות. השיקופיים היו נזרע על צפיפות של תאים/cm 400,0002 ותרבותית במשך 48 שעות לפני ההשתלה. ביום של השתלת, גיליון ASC היו מנותקים על-ידי מתן המנה תרבות תרמו מגיב להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות B) ערכה של הליך ניתוחי; לאחר מצדו של הספקת ספינות מתבצע קיצור קיבה חלקית עם השקה המעי הגס. גיליון ASC הייתה עטופה סביב ההשקה בקבוצה גיליון עולה; a) caecum, ileum מסוף b), ג) לפי הטבעת. סקירה סכמטי של הליך כירורגי הותאמה חלקית באישור וו צ ואח. 24 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גיליון ASC לפני ואחרי בניתוק. א) גיליון ASC במנות תרבות תרמו מגיב לאחר 48 שעות של תרבות 40 x הגדלה. גליונות ASC התקבלו על ידי culturing השיקופיים על תרבות תרמו מגיב מסחרי מנות. B-C) עולה גיליון במהלך (B), לאחר ניתוק (C). כאשר הכלים תרבות תרמו מגיב הורשו להתקרר לטמפרטורת החדר, הגיליון עולה באופן ספונטני מנותקת פני התבשיל כגיליון ASC שלם אחד. אין טיפול אנזימטי היה הכרחי. גודל הגליון ASC מופחתת לאחר הניתוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השתלת גיליון ASC. א) תיאור ASC אוריינטציה גיליון בצלחת תרבות תרמו מגיב. 26 ב') גיליון אוריינטציה של עולה לאחר ההשתלה. לצד המנה של הגיליון ASC הונח מעל פני השטח serosal של הקו anastomotic (קו anastomotic מזוהה עם צלבים). ג) נופים התוך פעיל של השלבים השונים של השתלת. שני atraumatic מלקחיים שימשו כדי להרים את הגיליון ASC וכרוך אותו סביב קו anastomotic. החצים הלבנים מציינות מיקום גליון ASC. התמונות של השתלת הוסבו חלקית עם רשות מן הראש, עמ', ואח. 20 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הערכות מאקרוסקופית היסטולוגית השקה המעי הגס. A-B) לעומת קבוצת הביקורת, התבוננות מאקרוסקופית הראה מופחתת זליגת היווצרות מורסה ביום שלאחר הניתוח 3 (א) ו-7 (B), בהתאמה. החצים הלבנים הצבע באזור anastomotic ומצביעות חצים שחורים על גליונות ASC המושתלים. חתכים ג) נציג של האתר השקה המעי הגס בבעלי המושתלים מוכתם H & א המבנה גיליון יכול להיות מזוהה באתר השקה למעלה עד 7 ימים במשככי. התמונות הוסבו חלקית עם רשות מן הראש, עמ', ואח. 20 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

יום לאחר הניתוח 3 יום לאחר הניתוח 7
שליטה (%) גיליון ASC (%) p-ערך שליטה (%) גיליון ASC (%) p-ערך
דלקת הצפק 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Anastomotic שיבוש 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0.002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Stricture 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
מורסה-השקה 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0.04
הידבקות בהשקה 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
מורסה במקום אחר 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
הדבקה במקום אחר 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

טבלה 1: ממצאים מאקרוסקופית שלאחר הניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זליגת anastomotic הוא האירוע לוואי החמורה ביותר בעקבות צוות עם השקה ראשי. טכניקות אופטימלית למניעת הפרעה anastomotic ודליפה עדיין חסרים. יישום מקומי של מערך של biomaterials נערכה, עם שלל תוצאות25,26,27. המטרה של טיפולים תא היא להקל על רקמות תיקון על ידי החלפת רקמות או הגירוי של ריפוי מקומי באמצעות הפרשת paracrine.

במודל זה עכברוש, עולה גיליון השתלת היה מוצלח מבחינה טכנית. הערכה קלינית, היסטולוגית הפגינו את האפקטיביות של הגיליון ASC בהפחתת בריחת לאחר כריתה של המעי הגס עם השקה ראשוני.

ההשתלה של גיליון ASC כדי. חיבור המעי הגס היא גישה מוזרה בפרוקטולוגיה. במחקר זה, בפעם הראשונה, היה מושתלים גיליון ASC בצפיפות גבוהה. הבחירה השיקופיים כערכות גיליון תא היה מבוסס על היתרונות שדווחה בעבר של תא גליון טכנולוגיה28,29 על טכניקות השתלת תאים קונבנציונלי. בנוסף, הבחירה עבור השיקופיים התבססה על מחקרים רבים הראו את היכולות אנטי דלקתיות, עם מחלות, במיוחד של שריר הלב, העור-ריפוי11,12,19,32 .

הכנת גיליון ASC ולהתנתקות יכול להיות מאתגר. כמה תורמים עולה, עולה גליונות מנותקת בטרם עת המנה תרבות, מקופל, מסלק את השימוש בהם. במחקר זה, הגורם המדויק עבור בעיה זו של אלה תורמים ספציפיים לא מזוהה. מאז צריכה גבוהה של תרבות בינוני נודע ב אלה תורמים, זה הנחנו בודדים וריאציות בקצב התפשטות עשוי לשחק תפקיד חשוב. סרום ציפוי סייע תא אדהזיה אל פני השטח. יחד עם זהירות חלוקת התאים בתרבות מאכל וצמצום פתיחת הדלת במדגרה לאחר זריעה השיקופיים (מניעת טמפרטורה טיפות), פחות קיפול של הגליונות ASC אירעה. בדרך זו, עולה גליונות מתורמים כל בהצלחה הושתלו, המאשרת את הכדאיות של הטכניקה.

יום של השתלת רוב ASC גליונות מנותק באופן ספונטני לאחר המאפשר המנה תרבות תרמו מגיב להתקרר לטמפרטורת החדר. עם זאת, מספר מוגבל של גליונות לא מלא ניתוק. טלטול עדין של תרבות מאכל או שטיפה רך שבקצה הכפר באמצעות פיפטה בסופו של דבר סייע detachments מלאה.

עבור השתלת מוצלחת של גיליון ASC כדי. חיבור המעי הגס, מספר צעדים קריטיים שצריך להתייחס. הראשון, עודף דם באתר השקה יש להסיר על מנת להבטיח את איש הקשר בין הגיליון ASC השטח serosal. שנית, לצד צלחת של הגיליון ASC יוצבו על פני השטח serosal של ההשקה. זה הוא שמהווה תפקוד התא גליונות לאחר הקציר נשמר עקב השימור של חלבונים פני שטח התא, צומת לתא חלבונים. בנוסף, היכולת של גליונות ASC לדבוק באופן ספונטני השטח serosal תוך זמן קצר עשוי להיות בהנחייתם של הנוכחות של ECM הופקדו המיוצר במהלך תרבות במבחנה19,20,21. שלישית, הגודל של הגיליון ASC ואת קוטר המעי הגס אמורים להיות דומים במהירותם כדי לאפשר כיסוי מלא של האתר השקה. כאשר משטחים גדולים יותר צריכים להיות מכוסים, השימוש במספר גליונות יכול להיחשב.

ישנן כמה מגבלות של פרוטוקול זה עבור הכנת גיליון ASC והשתלות. בעת שימוש תרבות תרמו מגיב מנות להכין את הגיליון ASC, הטמפרטורה בהחלט לשמור על 37 מעלות צלזיוס במהלך התהליך כולו כדי למנוע התנתקות מוקדמת. לאחר ההשתלה, שיעור ההישרדות של גיליון ASC אינו ידוע. למרות ניסויים קודמים הראו כי השיקופיים היו קיימא ב 3 ימים במשככי, פעילות מיטוכונדריאלי של השיקופיים אלה היה פחתה ב 7 ימים במשככי17. תא הישרדות קצב והמנה השפעת השתלת חשובים שאלות שצריכות להיות התייחס בעתיד מחקרים. הטיית הצופה לחלוטין אפשרות מאז הגיליון ASC ניתן לזהות בעין בלתי מזוינת, מאכל-הערכות שלאחר הניתוח. למרות חיות המושתלים לא הופיע יותר לאחר הניתוח היווצרות אדהזיה בהשוואה לשלוט בבעלי חיים17, הערכת ההשקה המעי הגס יכול להיות מוגבל בשל הנוכחות של אלה הדבקויות אינטרה בבטן.

יתרון שיטה זו היישום היא שזה פשוט וקל לביצוע. עם רק כמות קטנה של תרגול באמצעות מלקחיים atraumatic אוניברסלי, מנתחים מעיים אמור להיות מסוגל לעטוף את הגיליון עולה סביב ההשקה. בנוסף, זמן הניתוח אינה מושפעת במידה רבה מאז ASC גליונות מיד לדבוק רקמות הפונדקאי. יתר על כן, בעת שימוש ASC גליונות, biomaterial סינתטיים לא נשאר בגוף תוך מזעור הסיכון של תגובת גוף זר.

המושתלים השיקופיים מאורגן בגליונות תא הפגינו את היכולת להפחית את זליגת השקה המעי הגס. לאור אלה מבטיח תוצאות, מחקרים עתידיים וצריך להתנהל כדי להעריך השפעות ארוכות טווח עבור טיפולית, מטעמי בטיחות. חוץ מזה, תוארו מספר שיטות כדי לשנות את השפעות טיפוליות ASC יריעות כגון גרימת ביטוי של צמיחה אנדותל כלי הדם30. שיטות אלה עשויים לשפר עוד יותר לתיקון רקמות באמצעות גליונות עולה ויש להתייחס בעתיד מחקרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר בוצע בהיעדר יחסים מסחריים או פיננסי שיכול להחשב בתור ניגוד אינטרסים פוטנציאליים.

Acknowledgments

המחברים מודים פרופ ' ד ר S.E.R. Hovius, ד ר M.A.M. Mureau, מנתחים כל המחלקה לכירורגיה פלסטית האוסף של רקמת השומן התת עורית. עמ' הראש נתמך על ידי מענק של התוכנית היה האחווה הולנד (NFP-12/435), במהלך התנהלות של המחקר. עיון Bastiaansen-Jenniskens נתמך על ידי מענקים מקרן דלקת מפרקים ההולנדית (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57, (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26, (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38, (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19, (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9, (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212, (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22, (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20, (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36, (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91, (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14, (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11, (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95, (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28, (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46, (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3, (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15, (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13, (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15, (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21, (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50, (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6, (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8, (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11, (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267, (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12, (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).
השתלת תאי רקמת שומן-Derived גיליון כדי להפחית את זליגת לאחר קיצור קיבה חלקית במודל של עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter