Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Трансплантация стволовых клеток жировой ткани производные листа для уменьшения утечки после частичное колэктомия в мышиной модели

doi: 10.3791/57213 Published: August 11, 2018

Summary

Подготовка и трансплантация стволовых клеток (ASC) листов жировой ткани, полученных на недостаточно зашивается анастомозов толстой кишки в мышиной модели представлен. Этот роман приложение показывает, что ASC листы можно уменьшить прямой кишки анастомоз утечки.

Abstract

Анастомоза представляет собой катастрофические осложнение после операции колоректального. Хотя нынешние методы для предотвращения утечки имеют разные уровни клинической эффективности, они являются до теперь несовершенного решения. Терапия стволовой клетки с помощью ASC листов может обеспечить решение этой проблемы. ИСС, считаются как перспективных кандидатов для поощрения исцеление из-за их свойства трофические и иммуномодулирующим ткани. Здесь мы предлагаем методы для получения высокой плотности ASC листы, которые пересаживают на прямой кишки анастомоз в мышиной модели для сокращения утечки. ИСС сформировали ячеек листов в термо отзывчивым культуры блюд, которые могут быть легко отсоединяется. В день трансплантации частичное колэктомия с 5-шов прямой кишки анастомоз была выполнена. Животных сразу же были пересажены с 1 лист ASC в крысу. ASC листы спонтанно присоединились анастомоза без клея, шовный материал или любой биоматериала. Групп животных были принесены в жертву 3 и 7 дней после операции. По сравнению с пересаженной животных, заболеваемость анастомоза абсцессов и утечки был выше контрольных животных. В нашей модели трансплантация ASC листов после прямой кишки анастомоз был успешным и связано с более низкой ставкой утечки.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Частичное колэктомия с первичной анастомоза является часто выполняемые операции, что может быть сделано для многих заболеваний толстой кишки, рака прямой кишки, болезнь Крона и дивертикулит1,2. Самых страшных осложнение после прямой кишки анастомоз анастомоза3. Хотя было выявлено несколько факторов риска, связанных с утечками анастомоза, решения для предотвращения утечки остаются unkown4,5.

Жировая ткань производные стромальные клетки (ИСС), связанные с противовоспалительным и трофические свойства6,7, что делает эти клетки перспективных кандидатов для регенеративной терапии8. Эффективность ИСС для ускорения заживления тканей был показан в различных тканях, таких как сердечной мышцы, кожу и пищевода9,10,11,12,13. Однако есть несколько докладов об использовании ИСС для ускорения заживления кишечника. Местные пересадки ИСС для экспериментальной колоректального анастомозов через ASC-покрытием biosutures или серозных инъекции ИСС показан либо никаких улучшений в исцеление14 или не помешало анастомоза несмотря на более благоприятные анастомоза Исцеление15.

Местные пересадки ИСС в суспензии или в сочетании с биоматериалов могут быть связаны с недостаточной ячейки хранения или недостаточное распределение пересаженные клетки11. Ячейка листа технологии16,17 предлагает инновационный метод ASC доставки18,19. Таким образом в предыдущем исследовании, новый подход был предложен в котором ИСС, организованной в ячейке листа может применяться на экспериментальной кишки анастомоз20. Это исследование показало, что ASC лист трансплантации успеха в сокращении утечки кишки анастомоз после частичное колэктомия в мышиной модели. Эта статья сообщает ASC лист подготовка и техника хирургической трансплантации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Брюшной подкожной жировой клетчатки был получен от человека доноров с одобрения медицинского этического Комитета (#MEC-2014-092), Erasmus MC университетский медицинский центр, Роттердам, Нидерланды. Все эксперименты на животных были утверждены Этический Комитет животных экспериментов, MC медицинский центр университета Erasmus, Роттердам, Нидерланды (133-14-01).

1. человека ИСС изоляции и культура

  1. Подготовка 3 мл изоляции среды 1 g жировой ткани. Mix низкий глюкозы Дульбекко, среднего изменения орла (LG-DMEM) с 10 г/Л бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 г/Л коллагеназы типа 1.
  2. Вскрыть человека подкожной жировой ткани брюшной (n = 8, все женщины, средний возраст 40 ± 9 лет) на мелкие кусочки (0,5 см) с помощью стерильных хирургическое лезвие размер 10, Adson-коричневая ткань щипцы и Metzenbaum ножницы в стерильных биологических SafetyCabinet.
  3. Храните Иссеченную ткань в стерильной стеклянной бутылке хранения средств массовой информации. Весят общее количество Иссеченную ткань и начать пищеварение с подготовленной изоляции среднего (50 г жировой ткани с 150 мл изоляции среды за бутылку). Протокол может быть приостановлена здесь путем сохранения бутылку с расчлененными жировой ткани и изоляции среды на 4 ° C на роликовый миксер на ночь. Затем prewarm бутылки на следующий день к комнатной температуре 25 ° C для 15 мин, прежде чем переходить к следующему шагу.
    Примечание: Подкожной жировой ткани живота был получен как остатки материала от доноров, проходит реконструкция груди с одобрения Комитета MC медицинские этические Erasmus (# MEC-200) и согласно кодекса поведения: «правильное использование вторичных из тканей человека» (< http://www.federa.org>). Остатки жировой ткани используется только от доноров, которые не opt вне для вторичного использования.
  4. Дайджест расчлененных жировой ткани в стерильной стеклянной бутылке хранения СМИ в шейкер инкубатор на 150 об/мин, 37 ° C в течение 1 ч.
  5. Разделите переваривается решения на 50 мл трубки и центрифуги трубы для 10 мин на 390 x g.
  6. Подготовка питательной среды: LG-DMEM дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), гентамицин 50 мкг/мл и 1,5 мкг/мл ampothericin б.
  7. После центрифугирования удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл питательной среды (LG-DMEM дополнена 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), гентамицин 50 мкг/мл и 1,5 мкг/мл ampothericin B). Центрифуга клетки снова за 5 мин на 390 x g и удалить супернатант.
  8. Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл питательной среды (LG-DMEM дополнена 10% FBS, гентамицин 50 мкг/мл и 1,5 мкг/мл ampothericin B) и фильтрации суспензии клеток через фильтр 100 мкм.
  9. Добавьте 50 мкл раствора 3% уксусной кислоты/Метиленовый синий (для Лизис эритроцитов) 50 мкл суспензии клеток, mix решение и использовать 10 мкл для подсчета клеток. Выполняют клетки, считая с Горяева. Затем пластина клетки на плотность 40 000 клеток/см2 в среде культуры (LG-DMEM дополнена 30% FBS, гентамицин 50 мкг/мл и 1,5 мкг/мл ampothericin B).
  10. Инкубируйте клетки при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO2 на 24 часа.
  11. После инкубации, мыть, клетки с теплой (37 ° C) фосфат буфер солевой раствор (PBS), чтобы удалить ячейки мусор и заменить СМИ с 10% FBS питательной среды с свежезаваренным Добавлено аскорбиновая кислота-2-фосфат (25 мкг/мл) и роста человеческого рекомбинантного фибробластов фактор 2 (FGF2, 1 нг/мл).
  12. Субкультура ИСС в 90% слияния, используя стандартный раствор 0,25% трипсина ЭДТА (3 мл раствора для в T175 колбу). После 3-5 мин нейтрализовать 0,25% раствор трипсина ЭДТА с 10 мл питательной среды (LG-DMEM дополнена 10% FBS, гентамицин 50 мкг/мл и 1,5 мкг/мл ampothericin B).
    Примечание: Поток cytometry анализ с использованием общих ASC поверхностных маркеров и tri линии дифференциация анализов были выполнены ранее и показал, что ИСС изолированы с помощью это протокол отображается ASC конкретные характеристики21,22.
  13. Вымыть клетки с 10 мл питательной среды (LG-DMEM дополнена 10% FBS, гентамицин 50 мкг/мл и 1,5 мкг/мл ampothericin B) для T175 колбу и центрифуги клетки для 8 мин на 250 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в 1 мл питательной среды. Подсчет количества ячеек с Горяева.
  14. Пластина клеток в колбах культуры T175 на плотности 8000 клеток/см2.
  15. Заморозить остальные ИСС в жидком азоте с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в среде культуры перед дальнейшим использованием.

2. Возрастание Подготовка листа

  1. Предварительно пальто термо отзывчивым культуры блюда (диаметр 3,5 см) с 1 мл раствора FBS, а затем поместить посуду в инкубаторе при 37 ° C, по крайней мере 30 минут до заполнения ячейки.
  2. Trypsinize ИСС, с помощью стандартного решения ЭДТА трипсин 0.25% для 3-5 мин (3 мл для T175 культуры колбу). Если есть любые скопления клеток после trypsinization, фильтр клетки через фильтр 100 мкм до подсчета.
  3. Нейтрализовать раствор трипсина с LG-DMEM дополнена 10% FBS (10 мл для T175 колбу) и центрифуги суспензию клеток для 8 мин на 250 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в 1 мл LG-DMEM дополнена 10% FBS.
  4. После покрытия термо отзывчивым культуры блюда с FBS, переместить блюда из инкубатора потепления тарелку при 37 ° C и снять блюдо FBS.
  5. Семя ИСС на 400 000 клеток/см2 (в общей сложности, 3.52 × 106 клеток разводят в 2 мл питательной среды за блюдо).
  6. Тщательно как можно равномернее распределите клетки, плавно качаясь на блюдо.
  7. Культура ASC листы для 48 ч при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO2.
    Примечание: Попробуйте свести к минимуму, открывая дверь инкубатора после посева ИСС для предотвращения перепадов температуры, которые могут помешать с формированием лист ASC или вызвать преждевременная отслойка сформированных ASC листов.

3. частичное колэктомия и прямой кишки анастомоз

  1. Стимулировать и поддерживать мужчина крыс (весом 250-350 г) с 1 Л/мин изофлюрановая (1.5-5%)/oxygen ингаляции и придать бупренорфин 0,05 мг/кг внутримышечно.
  2. Как только животные находятся под общим наркозом, оцените обезболивающий глубины с помощью рефлекс тестирования. Применение витамина A, содержащий глазную мазь для глаз для предотвращения сухости. При анестезии считается достаточным для хирургии, асептически Подготовьте живота бритья волосы и распыления хирургические области дважды с 70% этиловом спирте. Драпировка живота с драпировкой стерильные бумаги. Использование асептической техники и поддерживать стерильные поля во время всей хирургической процедуры.
  3. Сделать срединной брюшной разрез 5 см с стерильные хирургические лезвия размером 10 и расширить разрез Metzenbaum ножницами. Выявлять и неубранной толстой кишки и упаковать толстой кишки от остальной части брюшной полости с физиологическим смоченной сетки. Определить право, среднего и покинул колики артерий в брыжейке, тупо вскрыть вокруг каждого судна с помощью Хальстед комаров и перевязать каждого отдельного судна с не рассасывающиеся плетеные шелковые 4/0.
  4. Изолируйте толстой сегмента между 1.0 aborally до слепой кишки и 0,5 см выше хвостового верхней брыжеечной артерии. Разрез через здорового двоеточия Metzenbaum ножницами. После резекции кишечника сегмента объединить проксимальном и дистальном Концы кишки путем введения двух длинные ватные тампоны транс анально через дистальный двоеточие, а затем в конце проксимального отдела толстой кишки.
  5. С помощью хирургический Микроскоп, создайте недостаточно зашивается анастомоза конец в конец, однослойные инвертирование ушивание использованием 5 Прерванный швов (не рассасывающиеся Мононить полиамидная 8/0). Место Прерванный швы через все слои стенки кишки и положение knots extraluminally.
  6. Разделите крысы случайно на элемент управления или группа ASC листа.

4. ASC лист трансплантация

  1. Разрешить культуры блюда остыть до комнатной температуры 40 мин до пересадки в естественных условиях , чтобы облегчить ASC лист отряда.
    Примечание: После отсоединения, ASC листы сократится до примерно 2 см в диаметре. ASC лист жизнеспособность остается высоким для по крайней мере 3-6 ч после отряда20.
  2. Удаление питательной среды и заменить его с 1 мл сыворотки бесплатно LG-DMEM.
  3. Аккуратно схватить колеса ASC листа с атравматической щипцами и поместите блюдо-ASC листа поверх линии анастомоза.
  4. Осторожно Протяни ASC листа примерно 0,25 см выше и ниже линии анастомоза, используя атравматической щипцы и обернуть лист вокруг толстой кишки. Поднимите толстой кишки до обернуть лист ASC вокруг спинной стороне.
    Примечание: ASC листы придерживаться спонтанно линии анастомоза, существует нет необходимости использовать клей ткани или любые другие биоматериал. В контрольной группе не получают какого-либо дополнительного лечения.
  5. Удаление ватные тампоны и измените Перчатки и инструментов. Замените двоеточие в животе. Закрыть живот linea alba с одним слоем работает рассасывающиеся швы с помощью плетеный Полигликолидная кислота 5/0. Шовные подкожный слой и вместе в одном слое запуска рассасывающиеся швы с помощью кутис плетеный Полигликолидная кислота 5/0.

5. послеоперационные Оценка и последующая деятельность

  1. Сразу же после операции увлажняет животных с подкожных инъекций 5 мл теплого физиологического раствора. Место животных под лампой тепла для поддержания температуры тела и контролировать жизненно важные признаки пока животных восстановить достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
    Примечание: Животные, которые прошли хирургии не были возвращены в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел. После восстановления разрешить свободный доступ к воде и регулярные крыса Чоу. Послеоперационные боли администрировать бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно каждые 6-8 ч в течение 3 дней. Антибиотики не вводили в любое время в этом исследовании.
  2. Получите ежедневные клинической оценки оздоровительный и веса. В случае очень низкой оздоровительный Оценка или тяжелые веса животные должны быть euthanized от обескровливания через сердца прокол в то время как все еще под наркозом.
  3. На сутки 3 или день 7, анестезировать крыс снова с 1 Л/мин изофлюрановая (1.5-5%)/oxygen Ингаляция без бупренорфина и выполнять ре лапаротомия с U-образный разрез. Проверьте живота на признаки перитонита, стриктуры, волокнистых спаек и наличие абсцессов. Оценка серьезности сращений и абсцесса брюшной полости и в области анастомоза.
  4. Определите анастомоза давления разрывной инсуффляции воздуха в закрытой сегмент толстой кишки, включая анастомоза. Запишите давление воздуха и место разрыва, когда первый воздух течь как давление разрыва.
  5. Удалите двоеточие от каждого пожертвованного животного и исправить отрезока сегмент толстой кишки - содержащих кишки анастомоз - с буферизацией 4% формальдегида, после парафин встраивание и резки толстой кишки 4 мкм толщиной секций.
  6. Усыпить животных во время под наркозом непосредственно после сбора сегмента анастомоза по обескровливания через сердца прокол. Подтвердите смерти животного с отсутствием дыхания, движения и сердцебиение.
  7. Выполняйте гистохимические stainings например гематоксилином и эозином и Picro Сириус красный и иммуногистохимическое stainings с антителами против человека митохондрий, крыса эндотелиальных клеток (анти CD34) и клетки иммунной системы (CD3 +, CD163 +).
  8. Оцифровка слайдов для компьютеризированных анализа и сравнения групп животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Схема этого исследования, изображающие ASC лист культуры и процедура резекция толстой кишки и анастомоза показан на рисунке 1. Рисунок 2 показывает ASC лист микроскопические морфологии и макроскопические появление ASC листа во время и после отряда. Рисунок 3 показывает различные этапы ASC лист отряда и трансплантации. Рисунок 4 показывает наличие ASC листа на анастомоза линии и предотвращение утечки 3 дней после операции.

Последующей период допускается для прямой кишки анастомоз оценки. Различные оценки показаны в таблице и цифры. По сравнению с контрольных животных, пересаженные групп животных показали менее частые анастомоза зияние и утечки на сутки 3 и менее частые абсцесс формирования на сутки 7. По сравнению с контрольных животных, пересаженные животных не развивались значительные спайки или формирования стриктуры. Таблица 1 показывает макроскопических выводы в конце последующих периодов в трансплантированы и не пересаженные животных.

Figure 1
Рисунок 1: схема исследования. A) ИСС были изолированы и расширена до посева на термо отзывчивым культуры блюда. ИСС были осеменены на плотности 400 000 клеток/см2 и культивировали в течение 48 часов до пересадки. В день трансплантации, ASC листа были отделены, позволяя термо отзывчивым культуры блюдо остынет до комнатной температуры на 30 мин B) схема хирургической процедуры; После перевязки поставки судов производится частичное колэктомия и прямой кишки анастомоз. ASC-лист был обернутые вокруг анастомоза в группе лист ASC; ) caecum, b) терминала подвздошной кишки, c) ануса. Схематический обзор хирургической процедуры была частично адаптирована с разрешения Wu з. и др. 24 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: ASC листа до и после отсоединения. A) ASC лист в термо отзывчивым культуры блюда после 48 ч 40 кратном культуры. ASC листы были получены путем культивирования ИСС на коммерческой термо отзывчивым культуры блюда. B-C) ASC листа во время (B) и после отряда (C). Когда блюда термо отзывчивым культуры было разрешено остыть до комнатной температуры, ASC лист спонтанно отсоединяется от поверхности блюдо как один лист нетронутыми ASC. Было не ферментативной обработки. После отряда уменьшен размер листа ASC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: ASC лист трансплантации. A) изображение ориентации листа ASC в термо отзывчивым культуры блюдо. 26 B) ориентации ASC лист после трансплантации. Блюдо стороне листа ASC был помещен на верхней поверхности серозных линии анастомоза (анастомоза линии указывается с крестами). C) интраоперационная взгляды различных этапов трансплантации. Два атравматической щипцы были использованы для Поднимите лист ASC и оберните его вокруг линии анастомоза. Белые стрелки указывают местоположение листа ASC. Изображения, трансплантации были частично адаптированные с разрешения сухо, P., и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: прямой кишки анастомоз макроскопических и гистологической оценки. A-B) по сравнению с контрольной группой, макроскопической наблюдения показали, что сокращение утечки и абсцесс формирования в послеоперационный день 3 (A) и 7 (B), соответственно. Белые стрелки указывают на области анастомоза и черные стрелки указывают на пересаженные ASC листов. C) представитель сечения кишки анастомоз сайта в трансплантированы животных, окрашенных с H & E. Структура листа могут быть определены на сайте анастомоза до 7 дней после операции. Изображения были частично адаптированные с разрешения сухо, P., и др. 20 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Послеоперационный день 3 Послеоперационный день 7
Управления (%) ASC лист (%) p-значение Управления (%) ASC лист (%) p-значение
Перитонит 1/14(7.1) 0/14(0) NS 0/15(0) 0/14(0) NS
Анастомоза нарушения 10/14(71.4) 2/14(14.3) 0,002 3/15(20) 2/14(14.3) NS
Стриктура 2/14(14.3) 2/14(14.3) NS 2/15(13) 2/14(14.3) NS
Абсцесс в анастомоза 14/14(100) 12/14(85.7) NS 10/15(66.7) 4/14(28.6) 0,04
Адгезия на анастомоза 14/14(100) 14/14(100) NS 15/15(100) 14/14(100) NS
Абсцесс в другом месте 11/14(78.5) 8/14(57.1) NS 6/15(40) 4/14(28.6) NS
Сцепление в другом месте 8/14(57.1) 3/14(21.42) NS 9/15(60) 7/14(50) NS

Таблица 1: Послеоперационный макроскопических выводы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Анастомоза является наиболее серьезных неблагоприятных событий, после резекции кишки с первичной анастомоза. Оптимальные методы для предотвращения утечки и анастомоза нарушения по-прежнему отсутствуют. Местное применение массива биоматериалов был проведен, с различной результаты25,,2627. Клеточной терапии призван облегчить восстановление тканей путем замены тканей или стимулирование местных исцеление через паракринными секрецию.

В этой модели крыса технически успешной трансплантации лист ASC. Клинические и гистологической оценок продемонстрировали эффективность ASC листа на сокращение утечки после резекции кишки с первичной анастомоза.

Трансплантация ASC листа анастомозов толстой кишки является новаторский подход в колоректальная хирургия. В этом исследовании, в первый раз был пересажен высокой плотности лист ASC. Выбор для ИСС как ячейки листа был основан на сообщалось ранее преимущества ячейки листа технологии28,29 над обычными клеточные технологии трансплантации. Кроме того выбор для ИСС был основан на многочисленных исследований, которые продемонстрировали их анти-воспалительных и трофических способностей, особенно в сердечной мышце и кожно лечебными11,12,19,32 .

Подготовка листа ASC и отряд может быть сложным. В некоторых доноров ASC ASC листы преждевременно отсоединяется от культуры блюдо и рукояти, исключающих их использования. В этом исследовании точную причину для этой проблемы в этих конкретных доноров не был идентифицирован. Поскольку в этих доноров был уведомлен высокое потребление питательной среды, предполагалось, что индивидуальные колебания темпов распространения могут играть важную роль. Сыворотка покрытие помощь в клеточной адгезии к поверхности. Вместе с тщательного распределения клеток в культуре блюдо и минимизации открытия двери, инкубатор после посева ИСС (профилактика перепады температур), меньше складной ASC листов произошло. Таким образом ASC листы от всех доноров были успешно пересаживают, подтверждающие целесообразность технику.

В день трансплантации большинство ASC листы спонтанно отсоединена после позволяя термо отзывчивым культуры блюдо остынет до комнатной температуры. Однако ограниченное количество листов не отсоединить полностью. Мягкий сотрясение культуры блюдо или мягкая промывка на обод, в конечном итоге с помощью пипетки помощь в полной отрядов.

Для успешной трансплантации лист ASC колоректального анастомозов несколько критических шагов необходимо учитывать. Во-первых, чрезмерное крови на сайте анастомоза должны быть удалены для обеспечения контактов между ASC и поверхности серозных. Во-вторых блюдо стороне листа ASC должны располагаться на поверхности серозных анастомоза. Постулируется, что функция ячеек листов после сбора урожая поддерживается за счет сохранения белков поверхности клетки и белки перехода к ячейке. Кроме того способность ASC листов спонтанно присоединиться к поверхности серозных в короткое время могло бы способствовать присутствие на хранение ECM, которая производится во время экстракорпорального культура19,,2021. В-третьих размер листа ASC и диаметра толстой кишки должны быть сопоставимыми с разрешить полный охват на сайте анастомоза. Когда большие поверхности должны быть покрыты, можно считать использование нескольких листов.

Существуют некоторые ограничения этого протокола для подготовки листа ASC и трансплантации. При использовании термо отзывчивым культуры блюда для подготовки листа ASC, температура должна строго поддерживаться при 37 ° C в течение всего процесса, чтобы предотвратить преждевременное отслоение. После трансплантации выживаемость ASC лист неизвестна. Хотя предыдущие эксперименты показали, что ИСС были жизнеспособными в 3 дней после операции, митохондриальную активность этих ИСС уменьшилось на 7 дней после операции17. Эффект дозы и скорость выживания клеток трансплантации важные вопросы, которые должны быть рассмотрены в будущих исследований. Наблюдатель от предвзятости нельзя исключать полностью с ASC листа могут быть определены макроскопически и микроскопически в послеоперационной оценки. Хотя пересаженных животных не показывают более послеоперационной адгезии формирования, по сравнению с контроля животных17, оценки прямой кишки анастомоз может сдерживаться присутствие этих внутрибрюшного спаечного.

Преимуществом этого метода приложение является простым и легким для выполнения. С лишь небольшое количество практики и с использованием универсального атравматической щипцы кишечных хирурги должны уметь обернуть лист ASC вокруг анастомоза. Кроме того время операции не является сильно пострадали, так как ASC листы немедленно присоединиться к принимающей тканей. Кроме того при использовании ASC листы, не синтетические биоматериала остается в организме, минимизации риска реакции инородного тела.

Пересаженные ИСС, организованных в ячейке листы продемонстрировали свою способность уменьшить прямой кишки анастомоз утечки. Учитывая эти обнадеживающие результаты, будущие исследования должны проводиться для оценки долгосрочных последствий для терапевтических и соображениям безопасности. Кроме того для изменения терапевтического эффекта ASC листы как заставить гиперэкспрессия Сосудистый эндотелиальный фактор роста30были описаны несколько методов. Эти методы могут еще больше укрепить репарации тканей, с использованием листов ASC и должен рассматриваться в будущих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность проф д-р S.E.R. Hovius, доктор M.A.M. Мюро и все хирурги отделения пластической хирургии для коллекции подкожной жировой ткани. P. сухо поддерживается грант от программы стипендий Нидерланды (NFP-12/435), во время проведения исследования. Ю.м. Bastiaansen-Jenniskens поддерживается грантов от голландского артрит фонда (LP11).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LG DMEM Gibco, Life technologies 22320022 ASC isolation and culture
Collagenase type I Gibco, Life technologies 17100-01 ASC Isolation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418 ASC Isolation
Fetal bovine serum Gibco, Life technologies 10270-106 FBS, ASC isolation and culture
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies 7060 ASC Isolation
Gentamicin Gibco, Life technologies 15750-037 ASC isolation and culture
Ampothericin B Gibco, Life technologies 15290-018 ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400) Akribis Scientific F240 ASC Isolation
Centrifuge Hettichlab Rotina380 ASC isolation and culture
Phosphate buffer saline Gibco, Life technologies 14190-094 PBS, ASC isolation and culture
Ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960 ASC isolation and culture
Human recombinant fibroblast growth factor 2 AbD Serotec AF-100-15 FGF2, ASC isolation and culture
Trypsin EDTA Gibco, Life technologies 25200-056 ASC culture
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650-5x DMSO, ASC freezing
Thermo-responsive culture dishes Nunc Thermo scientific 174904 ASC sheet preperation
Non-absorbable braided silk 4/0 B Braun 21151042 surgery
Non-absorbable monofilament polyamide 8/0 B Braun G1118170 surgery
Absorbable braided polyglycolic acid 5/0 B Braun C1048207 surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawahara, H., et al. Single-incision laparoscopic right colectomy for recurrent Crohn's disease. Hepatogastroenterology. 57, (102-103), 1170-1172 (2010).
  2. Saia, M., Buja, A., Mantoan, D., Agresta, F., Baldo, V. Colon Cancer Surgery: A Retrospective Study Based on a Large Administrative Database. Surg Laparo Endo Per. 26, (6), e126-e131 (2016).
  3. Snijders, H. S., et al. Meta-analysis of the risk for anastomotic leakage, the postoperative mortality caused by leakage in relation to the overall postoperative mortality. Eur J Surg Oncol. 38, (11), 1013-1019 (2012).
  4. Daams, F., Luyer, M., Lange, J. F. Colorectal anastomotic leakage: aspects of prevention, detection and treatment. World J Gastroentero. 19, (15), 2293-2297 (2013).
  5. Testini, M., et al. Bovine pericardium patch wrapping intestinal anastomosis improves healing process and prevents leakage in a pig model. PLoS One. 9, (1), e86627 (2014).
  6. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212, (3), 702-709 (2007).
  7. Mussano, F., et al. Growth Factor Profile Characterization of Undifferentiated and Osteoinduced Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells Int. 6202783 (2017).
  8. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22, (3), 313-325 (2014).
  9. Shudo, Y., et al. Addition of mesenchymal stem cells enhances the therapeutic effects of skeletal myoblast cell-sheet transplantation in a rat ischemic cardiomyopathy model. Tissue Eng Pt A. 20, (3-4), 728-739 (2014).
  10. Otsuki, Y., et al. Adipose stem cell sheets improved cardiac function in the rat myocardial infarction, but did not alter cardiac contractile responses to beta-adrenergic stimulation. Biomed Res. 36, (1), 11-19 (2015).
  11. Hamdi, H., et al. Epicardial adipose stem cell sheets results in greater post-infarction survival than intramyocardial injections. Cardiovasc Res. 91, (3), 483-491 (2011).
  12. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14, (11), 3997-4008 (2013).
  13. Perrod, G., et al. Cell Sheet Transplantation for Esophageal Stricture Prevention after Endoscopic Submucosal Dissection in a Porcine Model. PLoS One. 11, (3), e0148249 (2016).
  14. Pascual, I., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells in biosutures do not improve healing of experimental colonic anastomoses. Brit J Surg. 95, (9), 1180-1184 (2008).
  15. Yoo, J. H., et al. Adipose-tissue-derived Stem Cells Enhance the Healing of Ischemic Colonic Anastomoses: An Experimental Study in Rats. J Korean Soc Coloproctol. 28, (3), 132-139 (2012).
  16. Okano, T. Cell sheet engineering. Rinsho Shinkeigaku. 46, (11), 795-798 (2006).
  17. Chen, G., et al. Application of the cell sheet technique in tissue engineering. Biomed Rep. 3, (6), 749-757 (2015).
  18. Labbe, B., Marceau-Fortier, G., Fradette, J. Cell sheet technology for tissue engineering: the self-assembly approach using adipose-derived stromal cells. Methods Mol Biol. 702, 429-441 (2011).
  19. Sukho, P., et al. Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet Application for Tissue Healing In Vivo: A Systematic Review. Tissue Eng Part B-Re. (2017).
  20. Sukho, P., et al. Effects of adipose stem cell sheets on colon anastomotic leakage in an experimental model: Proof of principle. Biomaterials. 140, 69-78 (2017).
  21. Verseijden, F., et al. Angiogenic capacity of human adipose-derived stromal cells during adipogenic differentiation: an in vitro study. Tissue Eng Pt A. 15, (2), 445-452 (2009).
  22. Sukho, P., et al. Effect of Cell Seeding Density and Inflammatory Cytokines on Adipose Tissue-Derived Stem Cells: an in Vitro Study. Stem Cell Rev. 13, (2), 267-277 (2017).
  23. Surface, N. U. Cell Harvesting by Temperature Reduction. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AppNote-Nunc-UpCell-N20230.pdf (2008).
  24. Wu, Z., et al. Colorectal anastomotic leakage caused by insufficient suturing after partial colectomy: a new experimental model. Surg Infect (Larchmt). 15, (6), 733-738 (2014).
  25. Wu, Z., et al. Reducing colorectal anastomotic leakage with tissue adhesive in experimental inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 21, (5), 1038-1046 (2015).
  26. Servier. Smart servier medical art. http://smart.servier.com (2017).
  27. Wu, Z., et al. Reducing anastomotic leakage by reinforcement of colorectal anastomosis with cyanoacrylate glue. Eur Surg Res. 50, (3-4), 255-261 (2013).
  28. Aysan, E., Dincel, O., Bektas, H., Alkan, M. Polypropylene mesh covered colonic anastomosis. Results of a new anastomosis technique. Int J Surg. 6, (3), 224-229 (2008).
  29. Suarez-Grau, J. M., et al. Fibrinogen-thrombin collagen patch reinforcement of high-risk colonic anastomoses in rats. World J Gastrointest Surg. 8, (9), 627-633 (2016).
  30. Kobayashi, J., Okano, T. Fabrication of a thermoresponsive cell culture dish: a key technology for cell sheet tissue engineering. Sci Technol Adv Mat. 11, (1), 014111 (2010).
  31. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267, (1), 54-70 (2010).
  32. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12, (4), 459-465 (2006).
  33. Makarevich, P. I., et al. Enhanced angiogenesis in ischemic skeletal muscle after transplantation of cell sheets from baculovirus-transduced adipose-derived stromal cells expressing VEGF165. Stem Cell Res Ther. 6, 204 (2015).
Трансплантация стволовых клеток жировой ткани производные листа для уменьшения утечки после частичное колэктомия в мышиной модели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).More

Sukho, P., Boersema, G. S. A., Kops, N., Lange, J. F., Kirpensteijn, J., Hesselink, J. W., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Verseijden, F. Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model. J. Vis. Exp. (138), e57213, doi:10.3791/57213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter