Aneuploidi fører til ustabilitet, genom, som i sidste ende producerer cellecyklus-anholdt celler med komplekse karyotypes. Dette papir giver en enkel og bekvem metode til at isolere aneuploid celler med komplekse karyotypes, at ophøre med at opdele.
Kromosom mis segregation fører til aneuploidi, en tilstand, hvor celler havnen en ubalanceret kromosom nummer. Flere linjer af beviser tyder kraftigt på at aneuploidi udløser genom ustabilitet, i sidste ende generere celler med komplekse karyotypes, at arresterer deres spredning. Isolering og karakterisering af celler husly komplekse karyotypes er afgørende for at studere virkningerne af en ubalanceret kromosom nummer på celle fysiologi. Til dato, er ingen metoder fastlagt pålideligt isolere sådanne aneuploid celler. Dette papir giver en protokol for berigelse og analyse af aneuploid celler komplekse karyotypes udnytte standard, billig vævskultur teknikker. Denne protokol kan bruges til at analysere flere funktioner af aneuploid celler med komplekse karyotypes herunder induceret gulne-associerede sekretoriske fænotype, pro-inflammatoriske egenskaber, og evnen til at interagere med immunceller. Fordi kræftcellerne ofte harbor ubalancer i Kromosomtal, er det afgørende at dechifrere, hvordan aneuploidi påvirker celle fysiologi i normale celler, med det endelige mål med afsløring både pro og anti tumorigenic virkninger.
Fejl i kromosom segregation føre til aneuploidi, en tilstand karakteriseret ved en Kromosomtal, der ikke er en flere haploide supplement1,2,3,4. Aneuploid karyotypes udløser replikering stress, der genererer yderligere genomisk ustabilitet5,6,7,8,9,10, øger karyotype kompleksitet, og i sidste ende fører til celle cyklus anholdelse af en delpopulation af celler10. Formålet med metoden præsenteres her er at skabe og adskille sådan en delpopulation fra cykling celler. Ved at ansætte billig vævskultur teknikker, letter denne protokol isolering og karakterisering af cellecyklus-anholdt aneuploid celler med komplekse karyotypes. Disse celler kaldes ArCK (anholdt med komplekse Karyotype) celler og deres euploid cykling modparter som kontrol.
Denne protokol er den første til at blive etableret til dette formål og giver mulighed for isolation og yderligere undersøgelse af ArCK linjer, herunder, men ikke begrænset til, deres induceret gulne og gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP), deres pro-inflammatoriske funktioner, og deres evne til at engagere sig med immunceller. Metoden præsenteres her er udviklet i untransformed, udødeliggjort menneskelige celler, men endnu ikke er blevet testet i kræft linjer. Nogle transformerede celler kan være ufølsom over for celle cyklus anholdelse på grund af undertrykkelse af én eller flere veje; Derfor, yderligere validering skal udføres i andre cellelinjer.
Denne nye metode til at generere og berige for anholdt celler med komplekse karyotypes (ArCK) giver mulighed for undersøgelse af celler, der har flere kromosom gevinster eller tab og ophøre med at opdele. Opsætningen metode er udviklet til at lette isolationen af ArCK celler i en hurtig og pålidelig måde.
Det mest afgørende skridt i denne analyse er strengt kontrollere tidslinjen af narkotikabehandling, og vigtigst, fjernelse af aneuploid cykling celler. For optimale resultater er timingen af nocodazole behandling og shake-off af særlig betydning at sikre, at cykling celler er fjernet fra pladen, mens de er stadig afrundede og mitotiske, at forebygge risikoen for mitotiske celledød eller skred i G1, potentielt skabe en tetraploide befolkning. Det anbefales ikke, at timingen af shake-off afviger mere end to timer fra anbefalede 12-h nocodazole inkubation.
Fremtidige undersøgelser af ArCK celler har potentiale til at fremme en dybere forståelse af hvordan kompleks karyotypes påvirke celle fysiologi. Især vist en nylig undersøgelse, at celler i immunsystemet er i stand til at interagere med og udløser immunsystemet clearance af ArCK celler10. Metoden beskrevet her giver et udmærket udgangspunkt for yderligere karakterisering af ArCK celler, herunder afklaring af de molekylære mekanismer bag immun clearance i untransformed celler og studiet af hvordan mutationer transformation kan omgå denne overvågningsmekanisme, et afgørende spørgsmål i felt14,15.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist understøttet af Koch instituttet Support (kerne) Grant P30-CA 14051 fra National Cancer Institute, ved de nationale institutter for sundhed Grant (CA206157-22 og GM118066) og Curt marmor Cancer Research Fund til Angelika Amon. Angelika Amon er også en investigator af Howard Hughes Medical Institute og Glenn Foundation for biomedicinsk forskning. S. S. blev støttet af det amerikanske italienske Cancer Foundation (AICF), af et stipendium i kræftforskning fra Marie Curie-aktionerne og den italienske forening for kræft forskning (AIRC), og en KI femårige Cancer Research Fellowship. E.M. blev støttet af et stipendium fra Howard Hughes Medical Institute.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |