אנאפלואידיה מוביל לחוסר יציבות הגנום, אשר בסופו של דבר מייצר תאים בבידוד-מחזור התא עם karyotypes מורכבים. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ונוחה לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה להפסיק לחלק.
סגרגציה שגויה כרומוזום מוביל aneuploidy, מצב שבו תאים הנמל מספר כרומוזום מאוזנת. מספר קווי ראיה מציינות בחום שאנאפלואידיה הזה מעורר יציבות הגנום, בסופו של דבר ליצירת תאים עם karyotypes מורכבים זה לעצור את התפשטות שלהם. בידוד ואפיון של תאים מחסה karyotypes מורכבים מכריעים לחקור את ההשפעה של מספר כרומוזום מאוזנת על פיזיולוגיה של התא. נכון להיום, אין שיטות הוקמו באופן אמין בידוד תאי aneuploid כזה. מאמר זה מספק פרוטוקול העשרה וניתוח של תאים aneuploid karyotypes מורכבים ניצול טכניקות תרביות רקמה סטנדרטי, זולה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לנתח מספר תכונות של תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים לרבות פנוטיפ הפרשה הזדקנות ביולוגית-הקשורים המושרה, תכונותיהם הפרו דלקתיים, ואת היכולת לתקשר עם תאים חיסוניים. כי התאים הסרטניים הנמל לעיתים קרובות חוסר איזון, כרומוזום מספר, זה הכרחי לפענח כיצד אנאפלואידיה משפיעה על פיזיולוגיה של התא בתאים נורמליים, עם המטרה הסופית של חשיפת שני tumorigenic pro אנטי השפעותיו.
שגיאות בתהליך של כרומוזום סגרגציה להוביל aneuploidy, מצב המאופיין מספר כרומוזום זה אינו כפולה של3,42,1,המשלים הפלואידי. Aneuploid karyotypes על ההדק שכפול הלחץ שיוצר עוד אי יציבות גנומית5,6,7,8,9,10, מגביר קריוטיפ המורכבות, ומוביל בסופו של דבר לעצור את מחזור התא של subpopulation של תאים10. מטרת השיטה המובאת כאן היא ליצירה להפריד כזה subpopulation רכיבה על אופניים תאים. על ידי שימוש בטכניקות תרביות רקמה זולה, פרוטוקול זה מקלה על בידוד ואפיון של מחזור התא נעצר תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים. תאים אלו נקראים תאים ArCK (Arrested עם מורכבות קריוטיפ) ואת עמיתיהם אופניים euploid כפקדים.
פרוטוקול זה הוא הראשון שהוקם למטרה זו מאפשרת הבידוד ואת המשך מחקר של קווי ArCK, כולל אך לא מוגבל, הזדקנות ביולוגית המושרה שלהם ועל פנוטיפ הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה (SASP), שלהם פרו-דלקתיים תכונות, היכולת שלהם לעסוק עם תאים חיסוניים. השיטה המוצגת כאן פותחה ב untransformed, מונצחים תאים אנושיים, אך לא נבדק עדיין בשורות סרטן. כמה תאים טרנספורמציה עשוי להיות חסר רגישות מחזור התא מעצר בשל דיכוי אחד או מספר מסלולים; לכן, נוסף אימות צריכה להתבצע בתוך שורות תאים אחרים.
שיטה חדשנית זו כדי ליצור ולהעשיר עבור תאים נעצר עם קומפלקס karyotypes (ArCK) מאפשר חקר התאים יש כרומוזום רווחים או הפסדים מרובים. ולהפסיק לחלק. הגדרת השיטה תוכנן כדי להקל על הבידוד של תאים ArCK בצורה מהירה ואמינה.
השלב הקריטי ביותר זה וזמינותו בקפדנות שולט על ציר הזמן של הטיפול בתרופה, והכי חשוב, הסרת תאים אופניים aneuploid. לקבלת תוצאות מיטביות, העיתוי של טיפול nocodazole ו- shake-off יש חשיבות מיוחדת כדי להבטיח כי תאים אופניים יוסרו מן הצלחת בזמן שהם עדיין מעוגל, mitotic, מונע את האפשרות של מוות של תאים mitotic או גלישה לתוך G1, יצירת פוטנציאל אוכלוסיה tetraploid. לא מומלץ כי העיתוי של שייק-off סוטה יותר משעתיים מ הדגירה המומלץ nocodazole 12-h.
מחקרים עתידיים על ArCK תאים יש את הפוטנציאל לקדם הבנה עמוקה יותר של מה מורכב karyotypes להשפיע על פיזיולוגיה של התא. בפרט, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאים של המערכת החיסונית הם אינטראקציה עם, סיווג המערכת החיסונית הגורם המפעיל של ArCK תאים10. השיטה המתוארת כאן מספקת נקודת התחלה מצוינת עבור אפיון נוסף של תאים ArCK, כולל לבירור המנגנונים המולקולריים שבבסיס סיווג המערכת החיסונית תאים untransformed, המחקר של טרנספורמציה איך oncogenic ייתכן לעקוף את מנגנון מעקב זה, שאלה קריטית14,שדה15.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי תמיכה המכון קוך (core) גרנט P30-קה 14051 מן המכון הלאומי לסרטן, על ידי נבחרת מוסדות של בריאות גרנט (CA206157-22 ו- GM118066) ו קורט השיש סרטן מחקר לקרן אנג’ליקה אמון. אנג’ליקה אמון הוא גם חוקר של הווארד יוז המכון הרפואי ועל קרן גלן למחקר ביורפואי. ס ס נתמכה על ידי את האמריקאי איטלקי סרטן קרן (AICF), על ידי התמחות בחקר הסרטן של מארי קירי פעולות של האגודה האיטלקית עבור סרטן מחקר (למקורות), ועל -ידי קי Quinquennial סרטן מחקר לאגודה. א. מ נתמכה על ידי התחברות מן המוסד הרפואי הווארד יוז.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |