Aneuploide conduce all’instabilità del genoma, che alla fine produce le cellule ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi. Questo documento fornisce un metodo semplice e conveniente per isolare cellule aneuploidi con karyotypes complessi che non smettono di dividersi.
Mis-segregazione del cromosoma conduce ad aneuploide, una condizione in cui cellule del porto un numero cromosomico squilibrato. Parecchie linee di prova indicano fortemente che aneuploide innesca instabilità genomica, in ultima analisi, generare cellule con karyotypes complessi che arrestano la loro proliferazione. Isolamento e caratterizzazione di cellule che harboring i karyotypes complessi sono cruciali per studiare l’impatto di un numero di cromosoma squilibrato sulla fisiologia cellulare. Ad oggi, non sono stati stabiliti metodi per isolare in modo affidabile tali cellule aneuploidi. Questo documento fornisce un protocollo per l’arricchimento e l’analisi di cellule aneuploidi con karyotypes complessi utilizzando tecniche di coltura del tessuto standard, poco costoso. Questo protocollo può essere usato per analizzare le diverse caratteristiche di cellule aneuploidi con karyotypes complessi inclusi indotta senescenza-collegata di fenotipo secretivo, proprietà pro-infiammatorie e capacità di interagire con le cellule immunitarie. Perché le cellule tumorali spesso porto gli squilibri nel numero dei cromosomi, è fondamentale decifrare come aneuploide impatti fisiologia cellulare in cellule normali, con l’obiettivo finale di scoprire entrambi suoi pro – e anti – tumorigenic effetti.
Errori nel processo di segregazione del cromosoma causare aneuploide, una condizione caratterizzata da un numero di cromosoma che non è un multiplo del aploide complemento1,2,3,4. Aneuploid karyotypes stress di replica di trigger che genera ulteriore instabilità genomica5,6,7,8,9,10, aumenta complessità del cariotipo e in ultima analisi porta ad arresto del ciclo cellulare di una sottopopolazione di cellule10. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di generare e separare tali una sottopopolazione dal riciclaggio delle cellule. Utilizzando tecniche di coltura del tessuto economico, questo protocollo facilita l’isolamento e la caratterizzazione di cellule aneuploidi ciclo cellulare-arrestato con karyotypes complessi. Queste cellule sono denominate cellule ArCK (arrestato con Karyotype complesso) e le loro controparti in bicicletta euploide come controlli.
Questo protocollo è il primo ad essere istituito a tale scopo e permette l’isolamento e un ulteriore approfondimento delle linee di ArCK inclusi, ma non limitato a, loro indotta senescenza e il fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP), loro pro-infiammatorie caratteristiche e la loro capacità di impegnarsi con le cellule immunitarie. Il metodo presentato qui è stato sviluppato in cellule umane immortalizzate, non trasformate, ma non è ancora stato testato nelle linee del cancro. Alcune cellule trasformate possono essere insensibili all’arresto del ciclo cellulare a causa della soppressione di uno o più percorsi; di conseguenza, ulteriore convalida deve essere eseguita in altre linee cellulari.
Questo nuovo metodo per generare e arricchire di cellule arrestato con karyotypes complessi (ArCK) consente lo studio delle cellule che hanno più del cromosoma guadagni o perdite e smettono di dividersi. Il metodo setup è stato progettato per facilitare l’isolamento di cellule ArCK in modo rapido e affidabile.
La fase più critica in questo test è rigorosamente il controllo timeline di trattamento farmacologico e, soprattutto, la rimozione di cellule aneuploidi in bicicletta. Per risultati ottimali, i tempi di trattamento nocodazole e shake-off sono di particolare importanza per garantire che le cellule ciclanti sono rimosse dalla piastra mentre sono ancora arrotondati e mitotica, impedendo la possibilità di morte cellulare mitotica o slittamento in G1, potenzialmente creando una popolazione tetraploide. Non è consigliabile che i tempi di shake-off devia più di due ore dall’incubazione consigliato 12-h nocodazole.
Gli studi futuri su ArCK cellule hanno il potenziale per facilitare una più profonda comprensione di come complesso karyotypes influisce sulla fisiologia cellulare. In particolare, uno studio recente ha dimostrato che le cellule del sistema immunitario sono in grado di interagire con e grilletto clearance immuni di ArCK cellule10. Il metodo qui descritto fornisce un ottimo punto di partenza per ulteriore caratterizzazione delle cellule di ArCK, compreso il chiarimento dei meccanismi molecolari che liquidazione immuni in cellule non trasformate e lo studio della trasformazione come oncogeni può ignorare questo meccanismo di sorveglianza, una questione cruciale nel campo14,15.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato in parte dal sostegno Istituto Koch (nucleo) Grant P30-CA 14051 dal National Cancer Institute, dal National Institutes of salute Grant (CA206157-22 e GM118066) e Curt marmo Cancer Research Fund di Angelika Amon. Angelika Amon è anche un investigatore di Howard Hughes Medical Institute e Glenn Foundation per la ricerca biomedica. S. S. è stata sostenuta dall’americano italiano cancro Foundation (AICF), di una borsa di studio nella ricerca sul cancro da azioni Marie Curie e l’associazione italiana per la ricerca cancro (AIRC) e di una borsa di ricerca cancro quinquennali KI. E.M. è stato sostenuto da una borsa di studio da Howard Hughes Medical Institute.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |