Aneuploidy fører til genomet ustabilitet, som til slutt produserer celle syklus-arrestert celler med komplekse karyotypes. Dette dokumentet gir en enkel og praktisk metode for å isolere aneuploid celler med komplekse karyotypes som slutte å dele.
Kromosom mis segregering fører til aneuploidy, en tilstand der cellene havn en ubalanserte Kromosom nummer. Flere linjer av bevisene indikerer sterkt at aneuploidy utløser genomet ustabilitet, til slutt generere celler med komplekse karyotypes som arrestere deres spredning. Isolering og karakterisering av celler skjuler komplekse karyotypes er avgjørende for å studere virkningen av en ubalanse Kromosom nummer på cellen fysiologi. Hittil har ingen metoder etablert pålitelig isolere slike aneuploid celler. Dette papiret gir en protokoll for berikelse og analyse av aneuploid celler komplekse karyotypes bruker standard, billig vev kultur teknikker. Denne protokollen kan brukes til å analysere flere funksjoner i aneuploid celler med komplekse karyotypes inkludert indusert senescence-assosiert sekretoriske fenotype, pro-inflammatoriske egenskaper, og evnen til å samhandle med immunceller. Fordi kreftceller havn ofte ubalanser i Kromosom nummer, er det avgjørende å dechiffrere hvordan aneuploidy påvirker celle fysiologi i normale celler, med det endelige mål å avdekke begge sin pro – og anti – tumorigenic effekter.
Feil under kromosom segregering føre til aneuploidy, en tilstand preget av et kromosom tall som ikke er et multiplum av haploid supplement1,2,3,4. Aneuploid karyotypes utløser replikering stress som genererer ytterligere genomisk ustabilitet5,6,7,8,9,10, øker Karyotype kompleksitet, og til slutt fører til celle syklus arrestasjon av en subpopulasjon av celler10. Formålet med metoden som presenteres her er å generere atskilt slik en subpopulasjon fra sykling celler. Ved å bruke billig vev kultur teknikker, forenkler denne protokollen isolering og karakterisering av cellen syklus-arrestert aneuploid celler med komplekse karyotypes. Disse cellene kalles ArCK (arrestert med komplekse Karyotype) celler og deres euploid sykling kolleger som kontroller.
Denne protokollen er den første som opprettes for dette formålet og gir isolasjon og videre studier av ArCK linjer inkludert, men ikke begrenset til, deres indusert senescence og senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP), deres pro-inflammatoriske funksjoner og deres evne til å engasjere seg med immunceller. Metoden som presenteres her er utviklet i transformeringsinstruksjonene, udødeliggjort menneskelige celler, men ennå ikke er testet i kreft linjer. Noen transformert celler kan være ufølsom for celle syklus arrestasjon på grunn av undertrykkelse av ett eller flere baner; Derfor skal videre validering utføres i andre linjer.
Denne romanen metoden å generere og berike for arrestert celler med komplekse karyotypes (ArCK) gjør studiet av celler som har flere kromosom gevinst eller tap og slutte å dele. Metoden oppsettet er utviklet for å lette isolering av ArCK celler i en rask og pålitelig måte.
Det viktigste trinnet i denne analysen er strengt kontrollere tidslinjen i behandling og, viktigst, fjerning av aneuploid sykling celler. For optimale resultater er tidspunktet for nocodazole behandling og riste-off spesielt viktig å sikre at sykling celler er fjernet fra platen, mens de fortsatt avrundet og mitotisk, hindre muligheten for mitotisk celledød eller forsinkelse i G1, potensielt skape en tetraploid befolkning. Det anbefales ikke at tidspunktet for riste av avviker mer enn to timer fra anbefalt 12-h nocodazole inkubasjon.
Fremtidige studier av ArCK celler har potensial til å lette en dypere forståelse av hvor komplekse karyotypes påvirke celle fysiologi. Spesielt viste en fersk studie at celler i immunsystemet kan samhandle med og utløser immunsystemet klarering av ArCK celler10. Metoden beskrevet her gir et utmerket utgangspunkt for videre karakterisering av ArCK celler, inkludert avklaring av molekylære mekanismer underliggende immun klarering i transformeringsinstruksjonene celler og studiet av hvordan kreftfremkallende transformasjon kan omgå denne overvåking mekanismen, en avgjørende spørsmålet i feltet14,15.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av Koch Institute støtte (kjernen) Grant P30-CA 14051 fra National Cancer Institute, den nasjonale institutter for helse Grant (CA206157-22 og GM118066) og Curt marmor Cancer Research Fund å Angelika Amon. Angelika Amon er også en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute og Glenn Foundation for biomedisinsk forskning. S. S. ble støttet av den amerikanske italienske Cancer Foundation (AICF), av et fellesskap i kreftforskning fra Marie Curie handlinger og italiensk Association for Cancer Research (AIRC), og en KI Quinquennial Cancer Research Fellowship. E.M. ble støttet av et fellesskap fra Howard Hughes Medical Institute.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |