Анеуплоидия приводит к нестабильности генома, который в конечном итоге производит арестован клеточного цикла клетки с сложными получен. Этот документ предоставляет простой и удобный метод для изоляции анеуплоидных клеток с сложных получен, которые перестают разделить.
Хромосома неправильного сегрегации приводит к анеуплоидии, условие, в котором клетки гавани несбалансированным хромосома номер. Несколько линий доказательств настоятельно указывают, что анеуплоидия вызывает нестабильность генома, в конечном счете генерации клеток с сложных получен, которые арестовать их распространения. Выделение и характеристика клетки укрывательство комплекс получен имеют решающее значение для изучения последствий несбалансированной хромосома номер на физиологии клетки. На сегодняшний день, были созданы методы не надежно изолировать таких анеуплоидных клеток. Этот документ предоставляет протокол для обогащения и анализ анеуплоидных клеток с сложных получен, используя методы стандартных, недорогой техники культуры тканей. Этот протокол может использоваться для анализа нескольких функций анеуплоидных клеток с сложными получен, включая их искусственное старение связанные секреторной фенотип, про воспалительные свойства и способность взаимодействовать с иммунных клеток. Поскольку раковые клетки часто гавани диспропорций в число хромосом, важно расшифровать как анеуплоидия влияет физиологии клетки в нормальных клеток, с конечной целью раскрытие обоих его про – и анти – tumorigenic эффект.
Ошибки в процессе хромосома сегрегация приведет к анеуплоидии, состояние, характеризующееся хромосома номер, который не является кратной гаплоидным дополнение1,2,3,4. Анеуплоидных получен триггера репликации стресс, который генерирует далее геномная нестабильность5,6,,78,9,10, увеличивает кариотип сложности и, в конечном счете, приводит к арест клеточного цикла субпопуляции клеток10. Цель метода, представленные здесь — для создания и отделить такого субпопуляция от Велоспорт клетки. Применяя методы недорогой культуры ткани, этот протокол облегчает изоляции и характеристика клеточного цикла арестован анеуплоидных клеток с сложными получен. Эти клетки называются ArCK (арестован с сложными кариотипа) клеток и их euploid Велоспорт коллегами как элементы управления.
Этот протокол является первым должен быть создан для этой цели и позволяет для изоляции и дальнейшего изучения ArCK линий, включая, но не ограничиваясь, их искусственное старение и связанные старение секреторной фенотип (SASP), их про воспалительных особенности и их способности взаимодействовать с иммунных клеток. Представленные здесь метод был разработан в клетках человека непреобразованной, увековечен, но еще не были протестированы в линиях рака. Некоторые трансформированных клеток могут быть чувствительны к арест клеточного цикла из-за подавления одного или нескольких путей; Таким образом дальнейшие проверки должны выполняться в других клеточных линий.
Этот новый метод для создания и обогатить для арестованных клетки с сложными получен (ArCK) позволяет для изучения клеток, которые имеют несколько хромосома прибыли или убытки и прекратить делить. Метод установки был разработан для содействия изоляции ArCK клеток в быстрый и надежный способ.
Наиболее важным этапом в этом assay строго контролировать сроки лечения наркомании и, самое главное, удаление анеуплоидных клеток Велоспорт. Для получения оптимальных результатов сроков лечения Нокодазол и трясти офф имеет особое значение для обеспечения что Велоспорт клетки удаляются из пластины, хотя они все еще округлые и митотического, предотвращая возможность митотическая клеточной гибели или проскальзывания в G1, потенциально создание тетраплоидные населения. Не рекомендуется, что сроки трясти-Off отклоняется более чем в двух часах от инкубации рекомендуется 12-h Нокодазол.
Будущие исследования по ArCK клетки имеют потенциал для содействия более глубокому пониманию как комплекс получен влияют на физиологии клетки. В частности недавнее исследование продемонстрировал, что клетки иммунной системы способны взаимодействовать с и триггер иммунной Распродажа ArCK клеток10. Метод, описанный здесь обеспечивает отличной отправной точкой для дальнейшей характеризации ArCK ячейки, включая уточнение молекулярных механизмов, лежащих в основе иммунной Распродажа непреобразованной клетки и исследования как онкогенных преобразования может обойти этот механизм наблюдения, важнейший вопрос в поле14,15.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана в части поддержки Института Кох (ядро) 14051 P30-CA грант от национального института рака, национальных институтов здравоохранения Грант (CA206157-22 и GM118066) и Курт мрамор онкологический научный фонд для Angelika Амона. Angelika Amon является также следователь Говард Хьюз медицинский институт и Гленн фонда для биомедицинских исследований. С.с. было поддержано по американской итальянский рак Фонда (МДБГ), стипендий в исследовании рака от Мари Кюри действий и итальянская ассоциация для исследования рака (АКПО) и стипендий пятилетних исследований рака KI. Е.м. была поддержана стипендии от Говард Хьюз медицинский институт.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |