Aneuploidi leder till genomet instabilitet, som så småningom producerar cellcykeln-arresterade celler med komplexa karyotypes. Detta dokument ger en enkel och bekväm metod för att isolera aneuploid celler med komplexa karyotypes som upphör att dela.
MIS kromosomsegregering leder till aneuploidi, ett tillstånd där celler hysa en obalanserad kromosomantalet. Flera rader av bevis tyder starkt på att aneuploidi utlöser genomet instabilitet, i slutändan generera celler med komplexa karyotypes att gripa deras spridning. Isolering och karakterisering av celler hysa komplex karyotypes är avgörande för att studera effekterna av en obalanserad kromosomantalet på cellfysiologi. Hittills har inga metoder fastställts att tillförlitligt isolera sådana aneuploid celler. Detta dokument innehåller ett protokoll för anrikning och analys av aneuploid celler med komplexa karyotypes utnyttja standard, billig vävnadsodling tekniker. Detta protokoll kan användas för att analysera flera funktioner av aneuploid celler med komplexa karyotypes inklusive deras inducerad åldras-associerade sekretoriska fenotyp, pro-inflammatoriska egenskaper och förmågan att interagera med immunceller. Eftersom cancerceller hamnområde ofta obalanser i kromosom nummer, är det avgörande att dechiffrera hur aneuploidi påverkar cellfysiologi i normala celler, med slutmålet att avslöja både dess pro – och anti – tumorigenic effekter.
Fel i färd med att kromosomsegregering leder till aneuploidi, ett tillstånd som kännetecknas av en kromosom nummer som inte är en multipel av det haploida komplement1,2,3,4. Aneuploid karyotypes utlösa replikering stress som genererar ytterligare genomisk instabilitet5,6,7,8,9,10, ökar karyotyp komplexitet, och i slutändan leder till cellcykelarrest av en subpopulation av celler10. Syftet med den metod som presenteras här är att generera och separera sådan en subpopulation från cykling celler. Genom att anställa billig vävnadsodling tekniker, underlättar detta protokoll isolering och karakterisering av cellcykeln-greps aneuploid celler med komplexa karyotypes. Dessa celler kallas ArCK (frihetsberövad med komplex karyotyp) celler och deras euploid cykling motsvarigheter som kontroller.
Detta protokoll är det första som skall fastställas för detta ändamål och tillåter för isolering och ytterligare studera ArCK linjer inklusive, men inte begränsat till, deras inducerad åldras och åldras-associerade sekretoriska fenotypen (SASP), deras pro-inflammatoriska funktioner och deras förmåga att utföra med immunceller. Metoden presenteras här har utvecklats i ej omformad, förevigade mänskliga celler men har ännu inte testats i cancer linjer. Vissa celler kan vara okänsligt för cellcykelarrest på grund av hämning av en eller flera vägar; Därför ska ytterligare validering utföras i andra cellinjer.
Denna nya metod att generera och berika för arresterade celler med komplexa karyotypes (ArCK) möjliggör studier av celler som har flera kromosom vinster eller förluster och upphöra att dela. Den metod setup har utformats för att underlätta isolering av ArCK celler på ett snabbt och tillförlitligt sätt.
Det mest kritiska steget i denna analys är rigoröst kontrollera tidslinjen för missbruksbehandling och, viktigast av allt, avlägsnande av aneuploid cykling celler. För optimalt resultat är tidpunkten för nocodazole behandling och shake-off särskilt viktigt att säkerställa att cykling celler avlägsnas från plåten medan de är fortfarande rundade och mitotiska, förhindra möjligheten av mitotiska celldöd eller slirning i G1, potentiellt skapa en gräsart befolkning. Det rekommenderas inte att tidpunkten för shake-off avviker mer än två timmar från rekommenderade 12-h nocodazole ruvning.
Framtida studier på ArCK celler har potential att ge en djupare förståelse för hur komplexa karyotypes påverka cellfysiologi. I synnerhet visade en nyligen genomförd studie att celler i immunförsvaret är att interagera med och trigger immun clearance av ArCK celler10. Den metod som beskrivs här ger en utmärkt utgångspunkt för ytterligare karakterisering av ArCK celler, inklusive klargörandet av de molekylära mekanismerna bakom immun clearance i ej omformad celler och studiet av hur Onkogen transformation kan kringgå denna övervakningsmekanism, en avgörande fråga i fältet14,15.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds delvis av Koch Institute stöd (core) Grant P30-CA 14051 från National Cancer Institute, genom den nationella institut för hälsa Grant (CA206157-22 och GM118066) och Curt marmor Cancer Research Fund att Angelika Amon. Angelika Amon är också en utredare av den Howard Hughes Medical Institute och Glenn Foundation for Biomedical Research. S. S. stöddes av den amerikanska italienska Cancer Foundation (AICF), genom ett stipendium inom cancerforskning från Marie Curie-åtgärderna och den italienska föreningen för Cancer forskning (AIRC), och genom en KI Tyskland Cancer Research Fellowship. E.M. stöddes av ett stipendium från Howard Hughes Medical Institute.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |