Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och odla murina peritoneal mastceller. Vi beskriver också två protokoll för deras funktionell karakterisering: en fluorescerande avbildning av intracellulära gratis Ca2 + koncentration och en degranulering analys baserat på kolorimetriska kvantifiering av de utgivna β-hexosaminidase.
Abstract
Mastceller (MCs), spela som en del av immunförsvaret, en nyckelroll i försvaret värden mot flera patogener och i inledningen av det allergiska immunsvaret. Aktivering av MCs via tvärbindningen av ytan IgE bundet till hög affinitet IgE receptor (FcεRI) samt genom stimulering av flera andra receptorer, initierar uppkomsten av gratis intracellulära Ca2 + nivån ([Ca2 +]jag) som främjar frisättning av inflammatoriska och allergiska mediatorer. Identifiering av molekylära beståndsdelar inblandade i dessa signalvägar är avgörande för att förstå regleringen av MC funktion. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för isolering av murina bindväv typ MCs av peritoneal lavage och odling av peritoneal MCs (PMCs). Kulturer av MCs från olika knockout mus-modeller av denna metodik utgör en användbar metod för identifiering av proteiner involverade i MC signalering vägar. Dessutom vi också beskriva ett protokoll för enstaka cell Fura-2 imaging som en viktig teknik för kvantifiering av Ca2 + signalering i MCs. fluorescens-baserad övervakning av [Ca2 +]jag är en pålitlig och vanligen används förhållningssätt till studera Ca2 + signalering händelser, inklusive store manövrerade kalcium inträde, som är av yttersta vikt för MC-aktivering. För analys av MC degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release assay. Beloppet för β-hexosaminidase släpptes i odlingsmediet är ansedd som en degranulering markör för alla tre olika sekretoriska undergrupper beskrivs i MCs. β-hexosaminidase kan enkelt kvantifieras genom dess reaktion med ett colorigenic substrat i en mikrotiter plattan kolorimetriska analys. Denna mycket reproducerbara teknik är kostnadseffektiv och kräver ingen specialutrustning. Sammantaget det medföljande protokollet visar en hög avkastning av MCs uttrycka typiska MC yta markörer, Visa typiska morfologiska och fenotypiska drag, MCs och visar mycket reproducerbara Svaren till secretagogues i Ca2 +- Imaging och degranulering analyser.
Introduction
MCs har en framträdande roll under medfödda och förvärvade immunsvaret. Specifikt, MCs delta i dödandet av patogener, såsom bakterier och parasiter, och också försämra potentiellt giftiga endogena peptider eller komponenter av serotoninreceptorerna (för granskning se Galli et al. 20081). MCs fysiologiska roll i medfödd och adaptiv immunitet är föremål för livlig debatt. Därför, många data avvikelserna i de studier som utförts med olika MC-brist musmodeller kräver en systematisk omvärdering av immunfunktionerna för MCs bortom allergi2. Mogen MCs är oftast lokaliserade i vävnader och organ som hud, lunga och tarm, och finns vanligen endast i litet numrerar i blodet. MCs härleda från hematopoetisk prekursorer, såsom MC progenitorceller, och slutföra sin differentiering och mognad i mikromiljö av nästan alla vaskulariserad vävnad1. T-cell-derived faktor interleukin (IL) -3 främjar selektivt den livskraft, proliferation och differentiering av pluripotenta befolkningen på mus MCs från deras hematopoetiska progenitorceller3. Stem cell faktor (SCF) är producerad av strukturella celler i vävnader och spelar en avgörande roll i MC utveckling, överlevnad, migration och funktion4. Egenskaper för enskilda MCs kan variera beroende på deras förmåga att syntetisera och lagra olika proteaser eller proteoglykaner. Hos möss särskiljs så kallade bindväv-typ MCs från slemhinnor MCs enligt deras anatomiska lokalisering, morfologi och innehåll av heparin och proteaser5.
I MCs, en ökning med gratis cytosoliska Ca2 + [Ca2 +]jagär oumbärlig för degranulering och produktion av eikosanoider, liksom för syntesen av cytokiner och aktivering av transkriptionsfaktorer som svar på antigen och olika secretagogues6. Ett större nedströms mål på dessa stimuli är fosfolipas C, som hydrolyserar fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate diglyceridolja (DAG) och inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverar proteinkinas C och IP3 släpper joner av Ca2 + från endoplasmatiska retiklet. Utarmning av dessa butiker aktiveras Ca2 + inflöde genom plasmamembranet Ca2 + kanaler, vilket leder till att lagra manövrerade kalcium inträde (SOCE). Denna process frammanas genom samverkan mellan den Ca2 +-sensor, stromal interaktion celladhesionsmolekyl-1 (Stim1), i det endoplasmatiska retiklet med Orai17 samt genom aktivering av transient receptor potential kanoniska (TRPC) kanal proteiner (för granskning se Freichel o.a. 20148) i plasmamembranet.
Den fysiologiska roll dessa kanaler, flera farmakologiska (tillämpning av kalciumantagonister) eller genetiska metoder används vanligtvis för att studera. I det senare fallet, undertryckande av proteinuttryck uppnås genom att rikta mRNA (knockdown) eller genomiskt DNA redigering med globala eller vävnadsspecifika9 radering av ett exon kodning en por bildar subuniten av en kanal (knockout). Tillgången till en blockerare med tillräcklig specificitet för dessa kanaler är begränsade. Dessutom den knockdown metoden kräver noggrann kontroll av dess effektivitet använder, t.ex., Western blot analys och hämmas av avsaknad av specifika antikroppar för riktade kanal protein i många fall. Användningen av knockout musmodeller anses således fortfarande den gyllene standarden för sådan analys. En rekommenderad in vitro- modell för utredning av MC funktioner är odling av PMCs som kan vara isolerad ex vivo som en fullt mogen population (i motsats till att differentiera MCs i vitro från, t.ex., benmärgsceller)10 . Jämfört med benmärg härrör MCs (BMMCs), som används också ofta att studera MC funktion i vitro, stimulering av FcεRI och beta-hexosaminidase ökar frisättningen 8-fold och 100-fold i PMCs, respektive. I den här artikeln beskriver vi en metod för isolering och odling av murina PMCs, vilket gör för att få efter 2 veckors odling ett stort antal rena bindväv skriver MCs, tillräckligt för vidare analys.
Trots senaste framsteg i utvecklingen och tillämpningen av genetiskt kodade kalcium indikatorer begränsas deras användning fortfarande av svårigheter i leverans av gener till målcellerna, särskilt i högt specialiserade celler såsom primära odlade MCs. Dessutom saknar denna grupp av fluorescerande indikatorer för [Ca2 +]jag mätningar fortfarande proportionerlig färgämnen med en high dynamic range. Av dessa skäl är den föredragna metoden för proportionerlig [Ca2 +]jag mätning fortfarande den fluorescerande färgämnet ”Fura-2”11.
För närvarande den vanligaste metoden för utvärdering av MC aktivering och degranulering är mätning av β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk medlare, är ett av de MC granule komponenter som är co släppt med histamin i konstant andel från MCs12. Β-hexosaminidase kan lätt och exakt mätas genom dess reaktion med ett visst substrat, som producerar en mätbar mängd en colorigenic produkt som enkelt kan upptäckas i en mikroplattan kolorimetriska analys. I denna artikel redovisas en tillämpning av denna teknik för analys av PMCs degranulering svar på olika stimuli.
Aggregering av hög affinitet plasmalemmal IgE-receptorn (FcɛRI) aktiveras i MCs en mångsidig intracellulära signalväg, leder till en frisättning av sekretoriska granule innehåll i den omgivande extracellulära. Förutom de specifika antigenen, många andra stimuli kan aktivera MCs för att släppa ett varierande utbud av immunmodulerande medlare, såsom komplement anaphylatoxins (t.ex., C3a och C5a)13, den kärlsammandragande peptiden endotelin 1 (ET1)14 , as well as talrika katjoniska substanser och droger provocera pseudoallergic reaktioner (t.ex., ikatibant)15 genom bindning till MRGPRX216. Intracellulära signalvägar involverade i MRGPR-inducerad MCs degranulering kännetecknas dåligt jämfört med FcɛRI-medierad Intracellulär signalering; dessa vägar bara börjat studeras intensivt under de senaste par år17 efter den receptor identifiering16. I hög grad, återstår de plasmamembran-jonkanalerna som är involverade i kalcium posten följt av MRGPRX2 stimulering förstås. Därför denna artikel fokuserar också på intracellulära Kalciumsignalering och degranulering av MCs stimuleras med MRGPR agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden utfördes enligt tysk lagstiftning riktlinjerna för skötsel och användning av försöksdjur (officiellt godkänd av Karlsruhe regionala rådet).
1. PMC isolering och odling av Intraperitoneal Lavage
| 1 | Ice |
| 2 | 10 mL sprutor |
| 3 | 27 G injektionsnålar |
| 4 | 20 G injektionsnålar |
| 5 | Frigolit block och stift |
| 6 | Insamling rör (50 mL plast centrifugrör) |
| 7 | 70% etanol |
| 8 | RPMI Medium (Pre kylas och förvaras på is) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (fetalt kalvserum) + 1% Penicillin Streptomycin lösning (Pen-Strep) |
| 10 | Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning - DPBS (utan Ca2 + och Mg2 +) |
| 11 | Kultur kolvarna (25 cm) |
| 12 | Tillväxtfaktorer lagerför lösningar (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Serologiska pipetter (10 mL) |
| 14 | Pipetter tips steril (20 – 200 µL) |
| 15 | Hemocytometer |
| 16 | Bänk centrifug |
| 17 | Sax och pincett |
| 18 | CO2 kammare för möss |
| 19 | Öppen steril huv |
| 20 | Stängt sterila huva |
| 21 | Cell inkubator (37 ° C och 5% CO2) |
| 22 | Överföra pipetter (20 – 200 µL) |
Tabell 1: Material för steg 1.
-
PMC isolering av intraperitoneal lavage
- Före den cell isoleringen, förbereda de material som anges i tabell 1.
- Använd 8 till 14 veckor gamla hanmöss för PMC isolering. Avliva en mus av CO2 inandning och bekräfta döden genom förlust av reflexer. Spraya med musen med 70% etanol och fixa det på en skum block med pinnarna (ryggsidan nedåt). Ta bort ventrala huden på musen med trubbig kant sax. Undvika att skada i bukhålan.
Obs: Vi använder vanligtvis detta protokoll för möss med C57BL/6N stam genetiska bakgrund. - Injicera 7 mL iskallt RPMI medium och 5 ml luft i peritoneal hålighet med en 10 mL spruta försedd med en 27 G nål. Tryck nålen försiktigt i bukhinnan och inte perforera alla organ. Använda en plats i regionen av epididymal fettet för att minska risken för en orgel perforation.
- Efter injektionen, skaka musen för 1 min att lösgöra peritoneal celler i RPMI mediet. Skaka inte musen alltför starkt, för att undvika skada inre organ och förorena bukhålan med blod.
- Återanvända 10 mL sprutan genom att utrusta den med en ny 20 G kanyl. Flytta de inre organen till ena sidan genom att luta det skum blocket och försiktigt knacka det på bänken att underlätta medium aspiration från andra sidan. Infoga en 20 G nål, kantskär upp och aspirera vätska från buken försiktigt och långsamt (~0.5 mL/s) att undvika igensättning av de inre organen. Samla så mycket vätska som möjligt (normalt 5 – 6 mL).
- Ta bort nålen från sprutan och överföra insamlade cellsuspensionen i en samling röret på is. Kassera en prov tub om det finns synligt blod kontaminering.
- Centrifugera rören med cellsuspension vid ~ 300 x g i 5 min. Under sterila huva Aspirera supernatanten. För varje mus, kombinera prov pellets i 4 mL kall (4 – 10 ° C) PMC Medium och överför cellsuspensionen till en 25 cm2 kultur kolv. Lägg till tillväxtfaktorerna IL-3 och SCF till den slutliga koncentrationer 10 ng/mL och 30 ng/mL, respektive. Placera kolven som innehåller celler i en inkubator (37 ° C och 5% CO2) och inkubera i ~ 48 h tills nästa procedur.
-
PMC kultur
- Dag 2 (~ 48 h efter isolering): Medium förändring
- För att ta bort Aspirera supernatanten och icke-anhängare cellerna (erytrocyter och döda celler), medium från kolven genom att placera en Pasteur pipettspetsen vid kanten av kolven och hålla kolven nästan horisontellt. Tillsätt 4 mL före värmde PMC Medium per mus. Lägg till tillväxtfaktorerna IL-3 (10 ng/mL) och SCF (30 ng/mL). Placera kolven som innehåller celler i en inkubator (37 ° C och 5% CO2).
- Dag 9: Cell delning
- Överföra cellsuspensionen från cell kultur kolven i en plast 50 mL centrifugrör. Tvätta kolven tre gånger med 10 mL före värmde (37 ° C) Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS), plast samlande cellsuspension med fristående celler i samma 50 mL och centrifugera röret. Räkna cellkoncentrationen av en hemocytometer, och beräkna det totala antalet celler.
- Centrifugera cellsuspension vid ~ 300 x g i 5 min och Aspirera supernatanten. Återställa pelleten i förväg värmde PMC Medium (37 ° C) att erhålla cell koncentration 1 x 106 celler/mL. Överföra cellsuspensionen till en ny 25 cm2 kultur kolv. Kassera den gamla kolven med fibroblaster som ansluter sig till botten.
- Lägg till tillväxtfaktorerna IL-3 (10 ng/mL) och SCF (30 ng/mL) och Placera kolven som innehåller celler i en inkubator (37 ° C och 5% CO2).
- Dag 12 – 15: Cell mätningar
- Om några experiment med stimulering av FcɛRI receptorer är planerade, förbehandla cellerna över natten med 300 ng/mL IgE anti-DNP i standard odlingsmedium. Fortsätt med steg 2 eller steg 3.
- Dag 2 (~ 48 h efter isolering): Medium förändring
2. fluorometric intracellulära fritt kalcium koncentrationsmätning i PMCs
- Innan mätningarna, förbereda de material som anges i tabell 2. Också, förbereda en tänkbar installation bestående av: inverterad fluorescens Mikroskop; Syfte: 40 X / 1.3 olja; Fura 2 Filter Set; CCD-kamera; Magnetiseringen ljuskälla; Imaging förvärvet programmet; Gravitation utfodras lösning ansökningssystemet.
| 1 | PMC (12 – 15 dagar gamla) 1 x 106 celler/mL |
| 2 | Concanavalin A |
| 3 | Fura-2 AM |
| 4 | Pluronic F-127 20% lösning |
| 5 | Täckglas glasögon runda; ø 25 mm; Nr 1 |
| 6 | DNP-HSA (dinitrofenol-mänskliga serum albumin) stamlösning |
| 7 | Anti-DNP-antikropp (IgE) stamlösning |
| 8 | Flat bottenplatta (12 brunnar) |
| 9 | Sammansatta 48/80 stamlösning |
| 10 | Täck väl Imaging Chambers |
| 11 | Hemocytometer |
| 12 | Överföra pipetter (20 – 200 µL) |
Tabell 2: Material för steg 2.
-
Fura-2 imaging förberedelse
- Utföra en cell sammanräkning med hjälp av en hemocytometer och justera cellkoncentrationen till 1 x 106 celler/mL. Dela PMCs kolonierna genom försiktigt pipettering (3 – 5 gånger) cellsuspension med en 1 mL pipettspetsen.
- Förbereda en Ca2 +-innehållande HEPES buffrad saltlösning (Ca2 +- HBSS) består av 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES och 12 mM glukos. Justera pH till 7,4 med 3 M NaOH.
- Förbereda concanavalin A belagda diabilder av pipettering 1 droppe concanavalin A lösning (0,1 mg/mL i H2O) på varje 25 mm runda luckan glas under en steril huva. Låt dropparna på täckglas för minst 1 minut, sedan ta bort de flesta av lösningen med en pipett och låt täckglas lufttorka för 45 min. Tryck försiktigt de concanavalin A behandlade täckglas på gummit imaging kammare (se Tabell för material) tills de fäster Erhåll mikroskopi imaging chambers.
Obs: Poly-L-lysin belagda bilder kan användas som ett alternativ. - Lös det fluorescerande Ca2 + färgämnet Fura-2 AM (1 mM) i dimetyl sulfoxid (DMSO). Förvara lösningen skyddas från ljus.
- Späd den Fura-2 AM stamlösning i Ca2 +- HBSS till en slutlig koncentration av 5 µM för att förbereda ”lastning bufferten”. Komplettera med 5 µL/mL 20% pluronic F-127 i DMSO.
- Blanda 500 µL ”lastning bufferten” med 500 µL av PMC cellsuspensionen. Pipettera blandningen i imaging kammaren och inkubera cellerna för 20 – 30 min i rumstemperatur i mörkret.
- Ställa in allvar utfodras appliceringssystem med olika lösningar enligt protokollet stimulering. Komplettera spruta 1 med 40 mL Ca2 +- HBSS lösning, spruta 2 med 40 mL Ca2 +- HBSS lösning innehållande 100 ng/mL DNP, spruta 3 med 40 mL Ca2 +- HBSS lösning innehållande 50 µg/mL sammansatta 48/80, spruta 4 med 40 mL nominellt Ca2 +-gratis-HBSS lösning, och spruta 5 med 40 mL nominellt Ca2 +-gratis-HBSS lösning innehållande 2 µM Thapsigargin.
- Förbereda en 40 X hög bländare oljeimmersionsobjektivet genom att placera en liten droppe av nedsänkning olja på den.
- Montera ansökningssystemet på scenen av inverterade mikroskopet. Sätt imaging kammaren med laddade celler i ansökningssystemet och säkra den för att förhindra rörelse under inspelning. Slå på genomlysning och fokusera cellerna.
- Skölj cellerna tre gånger med Ca2 +- HBSS buffert med gravitation matad ansökningssystemet.
- Inkubera cellerna i Ca2 +- HBSS i 5 min för Fura-2 AM avinstallation förestring.
- Skölj cellerna en gång innan bildtagning, ta bort någon potentiellt läckt fluorescerande färg.
-
Cell imaging
- Starta bildprogrammet förvärv i fysiologiska förvärv läge. Öppna fönstret och justera fokus och optimal förvärv tid (vilket bör vara samma för excitation med 340 nm och 380 nm och vanligtvis varierar mellan 50 – 150 ms).
Obs: Minimera exponeringen av Fura-2 laddad cell till något ljus att undvika fotoblekning av färgämnet. - Bild en referens bild, och markera cellerna som regioner av intresse (ROI). Markera den sista ROI i ett område där inga celler är närvarande och definiera den som bakgrund.
- Slutföra installationen och starta mätningen med en 5 s förvärv hastighet.
Obs: Cellerna växelvis belyses med ljus excitation av 340 nm och 380 nm, och den utsända fluorescensen (> 510 nm) kommer att samlas in med hjälp av CCD-kamera. Bilder av fluorescens signaler F340 nm och F380 nm samt förhållandet (F340 nm/F380 nm) visas tre fönster. Diagrammen för tidsförloppet för enskilda ROIs fluorescensintensiteten menar värden visas också kontinuerligt. - Lägg till lösningar på ordentlig cykel nummer enligt utformningen av experimentet:
- Att mäta antigen-inducerad behörighetshöjning [Ca2 +]jag, som illustreras i figur 2, 2B, applicera spruta 2 lösningen efter cykel 20, och stoppa inspelningen efter cykel 150.
- För att mäta sammansatta 48/80-inducerad behörighetshöjning [Ca2 +] applicerajag,vilket illustreras i figur 2C, spruta 3 lösningen efter cykel 20, och stoppa inspelningen efter cykel 150.
- För att mäta höjden av [Ca2 +]jag frammanade av SOCE, som illustreras i figur 2D, applicera spruta 4 lösningen efter cykel 10, applicera spruta 5 lösningen efter cykel 70, applicera spruta 4 lösningen efter cykel 120, Applicera den spruta 1 lösningen efter cykel 150, och stoppa inspelningen efter cykel 220.
- Efter avslutad mätning, omsätta resultaten i en baserat på tabellen som innehåller de uppmätta stödnivåerna för magnetisering våglängder med och utan bakgrundskorrektion, såväl som förhållandevärden med och utan bakgrundskorrektion för varje ROI och varje mätpunkt tid. I förvärvet programmet, i följd tryck på knapparna: ”start cutter”, ”markera alla”, ”konvertera alla”, ”fysiologi mätningar”, ”Ok,” Ok ”. Spara filerna som tabeller och bildstaplar för offline analys.
- Starta bildprogrammet förvärv i fysiologiska förvärv läge. Öppna fönstret och justera fokus och optimal förvärv tid (vilket bör vara samma för excitation med 340 nm och 380 nm och vanligtvis varierar mellan 50 – 150 ms).
3. beta-hexosaminidase Release mätning i PMCs
| 1 | PMC (12 – 15 dagar gamla) 1 x 106 celler/mL |
| 2 | Anti-DNP-antikropp (IgE) stamlösning |
| 3 | DNP-HSA stamlösning |
| 4 | Sammansatta 48/80 stamlösning |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | Plattan med 96 brunnar, v-formad botten |
| 7 | 96 brunnar, platt botten |
| 8 | Plast centrifugrör (15 mL) |
| 9 | Serologiska pipetter |
| 10 | Cell inkubator (37 ° C och 5% CO2) |
| 11 | Bänk centrifug |
| 12 | Mikrotiterplattläsare för optisk densitet mätningar |
| 13 | Multikanalpipett (20 – 200 μL) |
| 14 | Hemocytometer |
Tabell 3: Material för steg 3.
- Innan mätningarna, förbereda de material som anges i tabell 3.
Obs: β-hexosaminidase släppt från MCs efter deras stimulering hydrolyserar p-nitrofenylfosfat-acetyl-D-glukosamin (pNAG) till p-nitrofenol och N-acetyl-D-glukosamin. Β-hexosaminidase i provet är proportionell mot mängden p-nitrofenol som kommer att bildas. I en miljö med högt pH ”stopplösning” p-nitrofenol existerar som fullt deprotonated p-nitrophenolat och kan upptäckas av dess ljus absorbansen vid 405 nm. - Förbereda Tyrodes lösning innehållande 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM glukos och BSA 0,1%. Justera pH till 7,4 med 3 M NaOH.
- Bered den Lys genom att lägga till en 1% volym av Triton x-100 den Tyrodes lösning.
- Förbereda den stopplösning som består av 200 mM glycin och justera pH till 10,7 med NaOH.
- Bereda pNAG lösning (4-nitrofenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) lösning genom att lösa upp pNAG i 0,4 M citronsyra till en slutlig koncentration på 4 mM.
- Beräkna mängden celler behövs för analysen (utföra analysen i två exemplar). Använd 200.000 PMCs per brunn. Använda 2 brunnar som negativa kontroller (Tyrodes lösning utan någon secretagogues såsom DNP eller sammansatta 48/80) och 2 brunnar som positiva kontroller (Tyrodes lösning med 10 µM Ionomycin) för varje genotyp.
- Överföra cellerna i en 15 mL centrifugrör för plast, justera volymen till 15 mL med Tyrodes lösning och centrifugera 200 x g för 4 min. avlägsna supernatanten med en Pasteur-pipett och resuspendera cellerna i Tyrodes lösning till 2 x 106 celler /mL.
- Över 100 µL cellsuspension per brunn till en väl plattan med 96 brunnar V-botten. Tillsätt 25 µL av antingen stimulering eller kontrollösning till varje brunn (enligt pipettering systemet illustreras i figur 3A). Inkubera cellerna under 45 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Stoppa reaktionen genom att placera plattan med 96 brunnar på is för 5 min. Sedan Centrifugera plattan vid 4 ° C under 4 minuter vid 120 x g. Över 120 µL av supernatanten med hjälp av en flerkanalspipett till en platt-bottenplatta med 96 brunnar och placera den på is. Noga med att undvika att vidröra cell pellets, men helt Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 125 µL lyseringsbuffert till cell pellets. Inkubera cell pellets för 5 min i rumstemperatur och resuspendera dem efter inkubering av upprepad pipettering (cirka 5 gånger).
- Pipettera 25 µL av pNAG lösningen (4 mM) i de obligatoriska brunnarna i en ny platt-bottenplatta med 96 brunnar. Tillsätt 25 µL från varje supernatanten till beredda pNAG lösningen samt 25 µL av varje cell lysate.
- Inkubera reaktion batchar för 1 h vid 37 ° C. Efter inkubering, tillsätt 150 µL stopplösning till varje brunn för att stoppa reaktionen.
- Analysera plattan med en microplate reader med en dual-våglängd inställning vid 405 nm med referens 630 nm för automatiska bakgrunden subtraktion. I förvärvet programmet, markera rutan ”referens” och ”absorbans” element programmenyn, Välj ”630 nm” från det drop-down listan. Om den optiska densiteten av proverna är för hög, förbereda en lämplig utspädning av sonden innan ommätning.
- Beräkna procentandelen av β-hexosaminidase release enligt följande ekvation:
där Release [%] är procent av specifika beta-hexosaminidase release, en [supernatant] är bakgrunden korrigerade absorption av supernatanten, och en [lysate] är bakgrunden korrigerade absorption av motsvarande cell lysate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PMCs isolerades från 3 vildtyp möss (C57BL/6N) av intraperitoneal lavage och ytterligare odlade i RPMI medium kompletteras med 20% FCS och 1% penna-Strep i närvaro av tillväxtfaktorer (IL-3 vid 10 ng/mL) och SCF vid 30 ng/mL under sterila tilluften villkor på 37 ° C och 5% CO2. Medium bytte dag 2 och 9 efter cell isolering. Cellmorfologi analyserades med överföring ljus DIC imaging (se figur 1A, B). Cell kontrast och granularitet visat bra cellernas viabilitet. Efter 2 veckors odling under dessa förhållanden, erhölls en homogen befolkning på 1,5 x 107 celler. Flödesanalys flödescytometri av celler Co färgas med anti-IgE-antikropp konjugerat med FITC och Anti-c-Kit-antikropp konjugerat med PE avslöjade 98,6% av FITC positiva och 99,8% PE positiva celler (figur 1C). 98,5% av de odlade cellerna var dubbel positiva för FITC och PE (figur 1C), visar typiska drag av mogen MCs.
För ytterligare funktionell analys av erhållna cellerna utfördes fluorometric [Ca2 +]jag mätningar med Fura-2 fluorescerande indikator. Fura-2 laddade celler lystes växelvis med 340 nm och 380 nm magnetisering ljus varje 5 s och fluorescens > 510 nm registrerades använder en CCD-kamera. Förhållandet mellan fluorescens (F340/F380) var ständigt övervakas. Tillämpningen av DNP (100 ng/mL) till PMC inkuberas över natten med 300 ng/mL IgE anti-DNP frammanas en uttalad förhöjning av [Ca2 +]jag nivån, som långsamt skämda på halva maximala under flera minuter (figur 2A, B). Variabilityen av cell Svaren var relativt låg (figur 2A, B). Stimulering av MRGPRB2 receptorer med 50 µg/mL i sammansatta 48/80 med protokollet för samma tid ökade också betydligt [Ca2 +]jag i Fura-2-loaded PMCs med en mycket liknande genomsnittlig amplitud i svaret (figur 2C). För analysen av SOCE i PMCs, ett ”nytt tillägg” protokoll tillämpades: 10 cykler efter början av mätningen, externa Ca2 + togs bort och under cykler 70 – 120, Thapsigargin (2 µM), en hämmare av endoplasmatiska retiklet ATPas, var tillämpas för utarmning av intracellulära Ca2 + butiker och för maximal aktivering av SOCE. Övergående [Ca2 +]jag höjden återspeglas Ca2 + frigöraren från intracellulära Ca2 + butiker i en nominellt Ca2 +-gratis bad lösning (figur 2D). Återställa den externa Ca2 + koncentrationen till 2 mM efter cykeln 150 resulterade i en framstående ökning av [Ca2 +]i nivå på grund av Ca2 + inflödet genom SOCE kanaler (figur 2D). Denna komponent av Ca2 + svar hämmades starkt i närvaro av 10 µM GSK 7975A, känd som en CRAC blockerare, medan Ca2 + frigöraren från intracellulära Ca2 + butikerna förblivit oförändrad (figur 2D ).
I nästa steg testade vi de isolerade PMCs förmåga att genomgå degranulering crosslinking av FcɛRI hög affinitet receptorer eller stimulering av MRGPRB2 receptorer. För detta ändamål utfördes en ß-hexosaminidase release assay. Cellerna var lagt till en V-botten 96 brunnar plattan (2 x 105 celler per brunn) och stimuleras enligt schema illustreras i figur 3A för 45 min vid 37 ° C. Plattan var centrifugeras och efter borttagning av supernatanten, pellets var lyserat. ß-hexosaminidase innehållet i enskilda supernatanterna och pellet lysates analyserades av deras reaktioner med pNAG under en 1 h inkubation vid 37 ° C. Mängden reaktionsprodukterna upptäcktes kolorimetriskt och procentandelen av den släppta ß-hexosaminidase har beräknats (se figur 3B). Spontan release var mycket låg (1%), medan svaren på stark degranulering stimuli såsom 10 µM Ionomycin och sammansatta 48/80 på 50 µg/mL var över 40% och 60%, respektive. Degranulering Svaren till DNP stimulering var dosberoende över koncentration intervallet 10 – 300 ng/mL. Tillsammans, ange dessa data tydligt de isolerade PMCs gott funktionellt skick.
Figur 1 : Karakterisering av primära odlade murina vildtyp PMCs utförs med DIC mikroskopi och flöde flödescytometri analys. (A, B) Representativa bilder som erhållits med 20 X plasDIC mål av PMCs odlade i 25 cm2 plast flaskor 1 h efter cell isolering av intraperitoneal lavage (A) och på dag 9 av odling (B). Skala barer i det högra nedre hörnet indikerar 100 µm. (C) flödescytometri Flödesanalys av PMCs (odlade 12 dagar enligt ovan beskrivna protokollet) Co färgas med anti-IgE-antikropp konjugerat med Fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och Anti-c-kit antikropp konjugerat med fykoerytrin (PE). Cell densiteten tomten är uppdelad i fyra kvadranter: Q1, PE ovan autofluorescens nivå/FITC under autofluorescens nivån. Q2, PE ovan autofluorescens nivå/FITC ovan autofluorescens nivå. Q3, PE nedanför autofluorescens nivå/FITC under autofluorescens nivån. Q4, PE nedanför autofluorescens nivå/FITC över autofluorescens nivå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Inspelning av [Ca2 +] jag i Fura-2 laddade PMCs isolerade från vildtyp möss. [Ca 2 + ]jag presenteras som fluorescens F340/F380 förhållande. (A) representativa spår av [Ca2 +]jag tidsförloppet för enskilda PMCs (n = 38) stimuleras med DNP (100 ng/mL). (B) tidsförloppet för DNP (100 ng/mL)-framkallat [Ca2 +]jag höjd. Varje datapunkt anger medelvärden som erhållits från 38 enskilda celler illustreras i panelen A. PMCs var förbehandlats över natten med 300 ng/mL IgE anti-DNP. (C) tidsförloppet för medelvärdena för sammansatta 48/80-inducerad [Ca2 +]jag höjd i PMCs (n = 60). (D) tidsförloppet för medelvärdena för [Ca2 +]jag förändringar under intracellulära Ca2 +-lagra utarmning som induceras av tillämpningen av 2 µM Thapsigargin (Tg) i nominellt Ca2 +-gratis lösning, följt av butik drivs kalcium tillströmning efter nytt tillägg av 2 mM Ca2 + i Bad lösning i kontrollgruppen (n = 44) av PMCs (svarta fyrkanter) och i närvaro av 10 µM av GSK 7975A i Bad lösningen (blå fyrkanter) (n = 41). I B, C och D Visar felstaplar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Beta-hexosaminidase släppa kolorimetriska flera mätningar utförs med PMCs isolerade från vildtyp möss. (A) stimulering systematiken i plattan med 96 brunnar pipettering för att utföra den beta-hexosaminidase analysen; Resultaten presenteras i panelen B. ”Spontan” motsvarar pipettering Tyrodes lösning utan tillsats av någon secretagogues; IM = Ionomycin; CP 48/80 = sammansatta 48/80. (B) Bar diagram som illustrerar procentandel av ß-hexosaminidase release under basala förhållanden (Spont), efter stimulering med Ionomycin (IM), dinitrofenol-mänskliga serumalbumin (DNP) och sammansatta 48/80 (Cp 48/80) med angivna koncentrationerna. Analysen utfördes i två exemplar; felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MC-modeller kan användas framgångsrikt att studera MC degranulering, Kemotaxis, vidhäftning, samt för att belysa intracellulära transduktion signalvägar involverade i MC aktivering. Vissa forskare använder mänskliga MCs modeller, såsom förevigade linjer (LAD2 och HMC1) eller mänskliga MCs härrör från sladd blod stamceller (CD133 +) och perifera stamceller (CD34 +). Andra föredrar gnagare MC-modeller, som förevigade (råtta basofila leukemi RBL - 2H 3 MC linje) eller primär odlade (mus ben-märg-härledda MCs BMMCs, PMCs) modeller. Murina primära MCs kan användas för att analysera MC funktion i många ”knock-out” musmodeller, som är den gyllene standard strategin för utforskandet av fysiologiska funktioner av vissa gener och kodade proteiner. Underskottet av farmakologiska verktyg för tillräcklig selektivitet och styrka gör denna metod särskilt värdefulla för utredning av signaltransduktion mekanismer av MC aktiveringen18. Murina PMCs är den bindväv fenotyp som uppvisar en mogen morfologi och hög detaljnivå. De bara svarar inte väl på antigen crosslinking av FcεRI som BMMCs, men som också aktiveras av agonister flera ytterligare receptorer såsom endotelin 1 eller sammansatta 48. Dock avkastningen av PMCs är vanligtvis betydligt lägre jämfört med BMMCs och är oftast inte tillräckligt för att utföra en Western blot eller en annan teknik som kräver ett stort antal celler. Flera tekniker har beskrivits för isolering och rening av PMCs. Exempelvis rapporterades Percoll gradient centrifugering att ge en hög renhet av celler19; antalet celler som erhålls med denna teknik är dock vanligtvis relativt låg. I protokollet som beskrivs här, är det mest kritiska steget ambitionen av cellsuspensionen från i bukhålan. Att blod kontaminering av provet och aspirera den maximala mängden medelstora möjliga är viktigt att få ett stort antal PMCs hög renhet. Med vissa mus-stammar, en maximal PMC nummer erhålls endast genom en förkortad (11 – 12 dagar) odling period. Lämnar dessa celler i kultur villkoren för en längre tid leder endast till en minskning av antalet cell.
I denna studie, beskriver vi ett enkelt protokoll som är lämplig för isolering av mogen MCs som gör det möjligt att få ett högt rena MC befolkningen från den mus bukhålan. De erhållna cellerna kännetecknas av en hög homogenitet och uppvisar typiska MC funktioner, såsom uttryck av specifika receptorer (KIT och FcεRI). Dessa celler uppvisar tydligt MC kännetecken för att degranulate och öka deras [Ca2 +]jag svar på FcɛRI och MRGPR aktivering.
MC signalering är tätt relaterat till [Ca2 +]i nivå bestäms av Ca2 + release från intracellulära butiker och Ca2 + inträde via plasmamembranet kanaler. [Ca2 +] jag höjd aktiverar ett komplex av intracellulära signalvägar som trigger MC degranulering. Liksom i andra icke-retbara celler, den huvudsakliga Ca2 + tillströmning vägen i MCs är den SOCE aktiveras av utarmning av de Ca2 +-butiker. Identifiering av kanalerna som är inblandade i denna signalväg är avgörande för att förstå regleringen av MC funktion. För identifiering av de molekylära beståndsdelarna av SOCE väg, microfluorometric tekniken använder fluorescerande Ca2 + indikatorer och metoden ”patch-clamp” Elektrofysiologisk har spelat en framträdande roll. Förhöjning av [Ca2 +]jag nivå är dock summan av Ca2 + release och SOCE. För att diskriminera dessa två faser av Ca2 + mobilisering, utvecklades tidigare så kallade ”Ca2 + nytt tillägg” protokollet (för granskning se fågel et al. 200820). I detta protokoll, slås den externa salt lösningen från en som innehåller normala [Ca2 +]o (1 – 2 mM) till ett nominellt Ca2 +-gratis lösning. Under dessa förhållanden behandlas cellerna med thapsigargin till Tom Ca2 + butiker och därmed fullt ut aktivera SOCE. I avsaknad av extracellulära Ca2 +frammanar thapsigargin behandling övergående [Ca2 +]jag höjden, vilket återspeglar en frigörare av Ca2 + joner från intracellulära Ca2 + butiker. Nytt tillägg av extracellulära Ca2 + leder till en ökning av [Ca2 +]jag representerar SOCE. I denna artikel presenterar vi framgångsrika utnyttjande av denna metod för karakterisering av SOCE i MCs. För att övervaka [Ca2 +]jag ändringar, användes Fura-2 som en indikator för kalcium. I sin acetoximetyl form, kan Fura-2 enkelt laddas i PMCs. Detta proportionerlig färgämnet tillåter jämförelse av inte bara amplituder av [Ca2 +]jag höjder, men också skillnader i basal [Ca2 +]jag , vilket är särskilt viktigt för att analysera vildtyp/knockout celler. Jämfört med genetiskt kodade fluorescerande färgämnen, en av de största nackdelarna av Fura-2 är dess hög ansamling i olika cellulära organeller och därigenom kontamination av den cytoplasmisk fluorescensen.
Fura-2 bildtagning kräver en dubbla excitation-teknik. Det är normalt tekniskt mycket lättare att använda än den dubbla utsläpp teknik som kräver inte bara användningen av en utlöst ljuskälla men dessutom ett Filterhjul eller en bild-splitter i utsläpp ljusstrålen involveras. Protokollet beskrivs kan användas för Ca2 + avbildning av andra icke-retbara celler.
En nyckelfunktion i MCs är deras höga innehåll av de elektron-tät sekretoriska granulat, som är fyllda med stora mängder medlare och immunmodulerande ämnen. MC aktivering leder till en snabb frisättning av förformade granule föreningar. Flera metoder att analysera MC degranulering i vitro finns tillgängliga, inklusive upptäckt av radiomärkt serotonin, histamin detektering med antikroppar (ELISA) och detektion av en ökning av plasma membran yta med elektrofysiologiska ”patch-clamp” cell kapacitans mätningar. I detta dokument beskriver vi en praktisk tillämpning av analysen använder flera kolorimetriska detektering av in vitro- släppt β-hexosaminidase. Denna analys bygger på β-hexosaminidase förmåga att hydrolysera terminal N-acetyl-D-hexosamine rester i N-acetyl-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase släpps tillsammans med histamin men också med andra mediatorer såsom Cathepsin D eller TNF och kan därmed användas som ett korrelat för degranulering från flera typer av sekretoriska vesikler i MCs12,22.
I den beskrivna tekniken stimuleras PMCs vid 37 ° C med olika secretagogues, följt av en uppskattning av supernatanterna samt pellets av β-hexosaminidase innehåll av deras reaktioner med β-hexosaminidase substrat. Som substrat användes 4-nitrofenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide. Det var hydrolyseras till N-acetyl-D-glukosamin och p- nitrofenol. Mängden p- nitrofenol kvantifierades kolorimetriskt av ljus absorbansen vid 405 nm. I vissa ändringar av ß-hexosaminidase release analysens, 4-methylumbelliferil-N-acetyl -beta- glukosamin används som substrat. Efter enzymatisk hydrolys genererar ämnet en fluorometrically detekterbara förening. Vi uttryckte omfattningen av degranulering som en procentandel av frigöraren, normaliserade till den totala halten. Detta tillät oss att undvika det variabilitet som införs genom olika cell nummer och deras granulat innehåll mellan olika cell preparat. Vi inte subtrahera en spontan release (observerad i avsaknad av MCs secretagogues) från netto stimuleras degranulering, eftersom en spontan release rapporterades separat på grund av dess betydelse som en indikator på MC livskraft. För att undvika hög variation i analysens resultat, är det viktigt att avgränsa mycket noggrant supernatanterna och pellets efter centrifugering av stimuleras cellerna. Det är också viktigt att undvika bildandet av eventuella bubblor i flera tallrikar innan du utför de kolorimetriska mätningarna. En betydande begränsning av den beskrivna metoden är att resultatet representeras inte som ett absolut värde, utan som en procentandel av den släppta medlaren.
I motsats till metoder för direkt påvisande av utgivna serotonin eller histamin, rapporterade analysen är mycket mer kostnadseffektiv och kräver ingen specialutrustning. Dessutom beskrivs tekniken är mycket reproducerbara, behöver inte utföras i en radioaktiv laboratorium och kräver inte inköp av dyra antikroppar. Det kan därför vara ett utmärkt alternativ till mer kostsamma och svåra tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Julia Geminn för tekniskt bistånd i mastcellen förberedelse och odling. Detta arbete stöds av The transregionala Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
